检测骨桥蛋白的电化学传感器及其构建方法

检测骨桥蛋白的电化学传感器及其构建方法
【专利摘要】本发明利用一种检测骨桥蛋白的电化学传感器及其构建方法。该传感器为三电极体系，铂丝电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极、修饰后金电极作为工作电极，葡聚糖胺作为一种常见的三维材料连接剂具有如下两大优势：（1）减少蛋白质变性和非特异性结合，（2）葡聚糖胺的氨基与抗体定向多肽相连形成的复合三维传感界面具有较好的抗体绑定能力和较多的固定位点。本发明结合电化学技术和复合三维材料的优势，制备出一种新型的电化学生物传感器，实现了对骨桥蛋白高特异性定量检测。
【专利说明】检测骨桥蛋白的电化学传感器及其构建方法

【技术领域】
[0001 ] 本发明利用一种检测骨桥蛋白的电化学传感器及其构建方法。

【背景技术】
[0002]1979年，Senger等首次报道一种包含RGD整合素结合区且与恶性转化有关的磷酸化糖蛋白及其与肿瘤的关系，称之为转化相关性磷酸蛋白。后来Franzen等从骨基质和牙齿中分离出一种磷酸蛋白，特性与转化相关性磷酸蛋白相似，人们将其命名为Osteopontin(OPN)，它可以调控肿瘤的转移。分泌后，OPN可以参与许多肿瘤的活动，例如:肿瘤血管生成、入侵、粘附、迁移、逃避识别/破坏免疫系统，抑制肿瘤细胞凋亡。它在心脏和血管中的正常表达水平很低，但是，如果持续增加其表达水平将会引发胃癌、乳腺癌、食道癌、肾癌、结肠直癌和子宫宫颈癌等疾病。
[0003]近年来，OPN因可作为一些疾病的诊断标志物和治疗目标而引起了很多研究者的关注。因此，一些检测OPN的方法被不断报道，迄今为止，ELISA法是检测OPN最常用的方法，但是由于ELISA法需要耗费大量的时间和样品并且灵敏度不高，因此，找出一种新颖、灵敏、便捷的方法检测OPN是非常必要的。
[0004]电化学传感器具有选择性高、检出限低等优点。在电化学免疫传感器中，免疫复合物(抗体)通常被间接固定在电极上。一些特殊的分子经常被作为连接剂来连接电极和抗体，葡聚糖胺作为一种最常见的连接剂之一，被广泛用于蛋白质的固定。它是一种富含氨基，通过葡萄糖分子之间1，6连接形成的线型高分子聚合物。葡聚糖胺有两大优势:第一，它不但可以降低蛋白质变性的几率，而且可以尽量避免配体与传感器表面的非特异性结合，是生物分子和金基底之间有效的屏障；第二，葡聚糖胺的氨基与抗体定向多肽相连形成的复合三维传感界面具有较好的抗体绑定能力和较多的固定位点。然而，蛋白质的羧基和葡聚糖胺的氨基直接反应可能会破坏蛋白质的活性区域，因此，许多科学家都在努力寻找一种可以特异性地结合在蛋白质稳定区域的分子。抗体分子的Fe端为其稳定区，Fab端可以稳定地结合抗原。Carbonell等发现了一个新的六聚体短肽HWRGWV,可以结合到IgG的Fe端。并且该短肽绑定的亲和力比蛋白质低，这一特点成为该短肽应用于其它体系的优势。目前，葡聚糖胺和短肽HWRGWV已被应用于多个领域的研究中，并取得了良好的效果。


【发明内容】

[0005]本发明的目的之一在于提供一种检测骨桥蛋白的电化学传感器，该传感器含有葡聚糖胺和短肽等特殊分子组成的三维体系，并将其修饰到金电极上构建电化学免疫传感器来检测0ΡΝ，及其作为OPN电化学免疫传感器的使用方法。
[0006]本发明的目的之二在于提供该传感器的构建方法。
[0007]一种检测骨桥蛋白的电化学传感器，三电极体系，钼丝电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极、修饰后金电极作为工作电极，其特征在于所述的修饰后金电极具有三维结构,先通过金巯键在金电极表面修饰ω-巯基^ 酸(MUA)与6-巯基己醇(MCH),再利用氨基与羧基的交联反应连接三维材料葡聚糖胺，短肽的羧基与葡聚糖胺的氨基相连，骨桥蛋白抗体通过Fe末端与短肽相连，即得到修饰后金电极；所述的短肽的序列为:Acetylated-HWRGWVA。
[0008]一种构建上述的检测骨桥蛋白的电化学传感器的方法，其特征在于传感器的构建方法为:
a.三维构型基底的形成:
a-Ι.将处理好的金电极浸泡在ω-巯基^^一酸(MUA)与6_巯基己醇(MCH)的混合溶液中过夜；然后分别用无水乙醇和超纯水冲洗干净并吹干待用
a-2.将步骤a-Ι所得金电极在1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液中浸泡20分钟，再将该金电极放在浓度为
0.lmg/mL的葡聚糖胺溶液中孵育30分钟；最后用乙醇胺进行封板；
a-3.向步骤a-2所得的金电极浸没在0.5mg/mL短肽的溶液中，反应12-15小时；即形成传感器的三维构型基底；
b.将步骤a所得金电极浸没在10Pg/mL的骨桥蛋白抗体溶液中共同孵育2 h，以固定Ant1-OPN，最终得到修饰后金电极；
c.将步骤b所得修饰后金电极与钼丝电极和饱和甘汞电极一起构成三电极传感器，即为检测骨桥蛋白的电化学传感器。
[0009]上述的步骤a-Ι的金电极的处理方法具体为:用超纯水将金电极充分冲洗至洁净状态，并吹干；然后，分别用3000、5000目的砂纸打磨，并依次在含有不同粒度I μπι，0.3μπι, 0.05 μπι的氧化铝砂浆中抛光电极，直至电极表面呈镜面无痕状，用超纯水和乙醇冲洗干净后，然后，向电极表面滴加20 μ? piranha，即98% H2SO4: 30% H202=3:1溶液；5分钟后用超纯水清洗干净；最后，将电极放入0.5 M H2SO4中，用循环伏安法扫描(0V-+1.6V)至信号稳定)，用超纯水冲洗干净、氮气吹干后待用。
[0010]本发明的优点和特点如下所述:本发明利用一种新型复合三维材料修饰的金电极构建一种检测骨桥蛋白的电化学传感器。葡聚糖胺作为一种最常见的连接剂之一，广泛用来固定蛋白质，葡聚糖胺有两大优势:第一，它不但可以降低蛋白质变性的几率，而且可以尽量避免配体与传感器表面的非特异性结合，是生物分子和金基底之间有效的屏障；第二，葡聚糖胺的氨基与抗体定向多肽相连形成的复合三维传感界面具有较好的抗体绑定能力和较多的固定位点。再用一段短肽来连接葡聚糖胺和抗体，从而避免了蛋白质的羧基和葡聚糖胺的氨基直接反应时破坏蛋白质的活性区域。本发明结合电化学技术和三维材料的优势，制备出一种新型的电化学生物传感器，通过交流阻抗方法对OPN进行高特异性定量检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0011]图1为最佳条件下，加入不同浓度的OPN溶液的交流阻抗图。

【具体实施方式】
[0012]现将本发明的具体实施例叙述于后。
[0013]实施例1 本实施例中三维构型传感器的构建方法和步骤如下:
1、三维构型基底的形成:
a.金电极的预处理:首先，用超纯水将电极充分冲洗至洁净状态，并以洗耳球吹干电极表面；然后，分别在3000、5000目的砂纸上打磨电极，并依次在含有不同粒度(I ym,
0.3 ym, 0.05 μ m)的氧化铝砂浆中抛光电极，直至电极表面呈镜面无痕状，用超纯水冲洗干净后，再依次用乙醇和超纯水各超声清洗5分钟，然后，向电极表面滴加20 μ?piranha(98% H2SO4: 30% H202=3:1)溶液，5分钟后用超纯水清洗干净。最后，将电极放入
0.5 M H2SO4中，用循环伏安扫描(0V- +1.6V)至信号稳定(约40圈)，用超纯水冲洗干净、氮气吹干后待用。
[0014]b.自组装单分子层的形成:将处理好的电极立即浸泡在ω-巯基^^一酸(MUA)&6-巯基己醇(MCH)混合溶液中过夜。然后分别用无水乙醇和超纯水冲洗干净并用氮气吹干后供下一步使用。
[0015]c.准备三维材料修饰的电极:
(I)将修饰过的电极在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)& N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液中浸泡20分钟，用以活化MUA末端的羧基。活化结束，将电极放在葡聚糖胺溶液中孵育三十分钟。为了阻止其它非特异性分子结合活化的羧基，用乙醇胺对上述处理过的电极进行封板。
[0016](2)向封板后的电极表面滴加含有短肽Acetylated-HWRGWVA的溶液，至少反应12小时。短肽Acetylated-HWRGWVA的羧基与葡聚糖胺的氨基形成共价酰胺键结合在电极表面，即形成OPN检测传感器的三维构型基底。
[0017]2、抗体的固定和OPN的检测
将一定浓度的OPN抗体(Ant1-OPN)与上述已修饰三维材料的电极共同孵育，以固定Ant1-OPN,并利用抗原抗体的特异性反应，检测目标蛋白(0ΡΝ)。将由上述构建修饰后金电极作为工作电极、钼丝电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极，组成传统的三电极体系；检测时，将三电极体系置于铁氰化钾溶液中测定不同浓度OPN时的交流阻抗值。
[0018]电化学检测0ΡΝ:
采用 OPN 浓度分另Ij 为 2.27X10' 3.41X10-9, 5.68X10' 9.08X10-9,13.62X10—9，20.43X10_9 M/L.测试条件:以构建修饰后金电极作为工作电极、钼丝电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极，组成传统的三电极体系；检测时，将三电极体系置于铁氰化钾溶液中测定不同浓度OPN时的交流阻抗值。
[0019]参见附图，图1为最佳条件下，加入不同浓度的OPN溶液的交流阻抗图。
[0020]由图可见，随着OPN浓度的增高，阻抗(Ω )也呈现上升趋势。
[0021]本发明方法制备的OPN电化学免疫传感器具有无标记、较高的灵敏度、良好的选择性等优势。不仅为OPN检测提供了一种较好的方法，也为其它肿瘤标志物的检测提供了一个良好的平台，并且推动肿瘤早期诊断和治疗的发展。
【权利要求】
1.一种检测骨桥蛋白的电化学传感器，三电极体系，钼丝电极作为对电极、饱和甘汞电极作为参比电极、修饰后金电极作为工作电极，其特征在于所述的修饰后金电极具有三维结构，先通过金巯键在金电极表面修饰ω-巯基i 酸(MUA)与6-巯基己醇(MCH),再利用氨基与羧基的交联反应连接三维材料葡聚糖胺，短肽的羧基与葡聚糖胺的氨基相连，骨桥蛋白抗体通过Fe末端与短肽相连，即得到修饰后金电极；所述的短肽的序列为:Acetylated-HWRGWVA。
2.—种构建根据权利要求1所述的检测骨桥蛋白的电化学传感器的方法，其特征在于传感器的构建方法为: a.三维构型基底的形成: a-Ι.将处理好的金电极浸泡在ω-巯基^^一酸(MUA)与6_巯基己醇(MCH)的混合溶液中过夜；然后分别用无水乙醇和超纯水冲洗干净并吹干待用 a-2.将步骤a-Ι所得金电极在1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合液中浸泡20分钟，再将该金电极放在浓度为0.lmg/mL的葡聚糖胺溶液中孵育30分钟；最后用乙醇胺进行封板； a-3.向步骤a-2所得的金电极浸没在0.5mg/mL短肽的溶液中，反应12-15小时；即形成传感器的三维构型基底； b.将步骤a所得金电极浸没在10Pg/mL的骨桥蛋白抗体溶液中共同孵育2 h，以固定Ant1-OPN，最终得到修饰后金电极； c.将步骤b所得修饰后金电极与钼丝电极和饱和甘汞电极一起构成三电极传感器，即为检测骨桥蛋白的电化学传感器。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤a-Ι的金电极的处理方法具体为:用超纯水将金电极充分冲洗至洁净状态，并吹干；然后，分别用3000、5000目的砂纸打磨，并依次在含有不同粒度I μπι，0.3 ym, 0.05 μ m的氧化铝砂浆中抛光电极，直至电极表面呈镜面无痕状，用超纯水和乙醇冲洗干净后，然后，向电极表面滴加20 VL piranha,即98% H2SO4: 30% H202=3: I溶液；5分钟后用超纯水清洗干净；最后，将电极放入0.5 MH2SO4中，用循环伏安法扫描(0V-+1.6V)至信号稳定)，用超纯水冲洗干净、氮气吹干后待用。
【文档编号】G01N33/68GK104165913SQ201410210922
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】李根喜, 陈红霞, 贾盛崧 申请人:上海大学