快速检测有机磷农药残留的试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速检测有机磷农药残留的试剂盒及其使用方法；所述试剂盒包括：C酶瓶、T酶瓶、C底物反应杯、T底物反应杯，所述C酶瓶、T酶瓶均用酶瓶密封盖密封，且装有酶冻干的三酶混合剂；所述C底物反应杯、T底物反应杯均设有含有乙酰胆碱、鲁米诺及二甲基联苯胺的冻干吸水垫。本发明还涉应用前述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法。本发明利用乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶及过氧化物酶为催化体系，将氯化乙酰胆碱水解氧化后的产物与鲁米诺产生化学发光效应。建立灵敏地测试农产品中有机磷农药的方法。本发明有具检测速度快、操作过程简单、稳定性及重复性好、不需要昂贵仪器等优点，非常适合于在农贸市场进行有机磷农药的现场监测。
【专利说明】快速检测有机磷农药残留的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种快速检测食品中有机磷农药残留的方法，具体是涉及一种快速检测有机磷农药残留的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]农产品、食品及药品中的农药残留仍是危胁人类身体健康的重要潜在因素之一。在中国的农业生产过程中，农药年使用量上仍居世界首位，且有机磷农药的使用量占全部农药用量的70%以上。据近些年的资料报道，中国省级大城市的农贸市场中第一季度所销售的蔬菜、水果有机磷农药不合格率占到14%以上，尤其来自于大棚种植蔬菜的农药残留量更高。在农药抽样监测中发现，甲胺磷、敌百虫、氧化乐果、敌敌畏的检出率更高。当前检测有机磷农药的方法主要有:①光谱法，主要包括分光光度法、化学发光法、红外及荧光光谱法色谱分析法，主要包括薄层色谱分析法、气相色谱法、液相色谱法、超临界流体色谱法及色谱/质谱联用技术；③免疫学分析方法，主要包括酶联免疫吸附分析法、纳米金免疫试纸条法、免疫荧光分析法等；④传感器法，主要包括压晶生物传感器法、光导纤维型酶传感器、有机磷水解酶生物传感器、胆碱酯酶传感器及基于分子印迹技术的仿生传感器。⑤快速检测法，主要包括速测卡法及速测仪法。光谱法及色谱法是国家确证性地检测农产品中有机磷农药的标准方法，具有特异性强、灵敏度高的特点，其不足之处是需要利用较为昂贵的仪器及专门的测试人员，且操作过程相当复杂，不适合于现场大量检测农产品中有机磷农药残留。免疫学检测方法的灵敏度高及特异性较强，但只能检测单个或数种有机磷农药，且相应抗体的研发时间长而成本高。免疫学检测方法的另一缺点是其重复性及稳定性较差。传感器方法是近些年发展起来的新型检测技术，其中有关利用胆碱酯酶的电流型及电位型传感器方面的报道非常多。传感技术的特点是灵敏、操作简单，但研究成果仍在实验室阶段，仍存在着重复性及稳定性差的缺陷。现有速测卡技术是利用胆碱酯酶能够水解乙酰胆碱的类似物2，6- 二氯靛酚乙酸酯而生成蓝色的2，6- 二氯靛酚乙酸，从而根据速测卡颜色的变化来判定有机磷农药的残留情况。其优点是检测速度快，操作简单。但该方法仍是简单的定性方法，灵敏度低，对一些种类的有机磷及氨基甲酸酯农药的检测限高出蔬菜、水果的国家限量标准，另外样品中的有机色素会严重干扰测定而造成假阴性结果。而现有的速测仪仍是一种便携式的分光光度计，需要配合较为复杂的检测试剂，且在现场不易实施。
[0003]经对现有技术文献的检索发现，专利申请号为2005100741791.3，名称为“化学发光有机磷农药残留分析仪及其检测方法”。其关键技术是，在过硫酸钾及二氧化钛纳米离子存在的条件下，利用紫外光催化作用使蔬菜或水果上的有机磷农药转化为无机磷酸盐，然后与钥酸及钒酸盐形成磷钥钒杂多酸，该物质氧化鲁米诺后产生化学发光，并用化学发光仪进行测定。但其缺陷是反应体系易受外界磷酸盐的干扰，而使结果出现假阴性。另外该检测方法的缺陷是重复性、稳定性仍不够理想，不能满足定性及定量检测的需要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供了一种快速检测有机磷农药残留的试剂盒及其使用方法。
[0005]本发明是通过以下的技术方案实现的:
[0006]第一方面，本发明涉及一种快速检测有机磷农药残留的试剂盒，所述试剂盒包括:C酶瓶、T酶瓶、C底物反应杯、T底物反应杯，所述C酶瓶、T酶瓶均用酶瓶密封盖密封，且装有酶冻干的三酶混合剂；所述C底物反应杯、T底物反应杯均设置含有氯化乙酰胆碱、鲁米诺及二甲基联苯胺的冻干吸水垫。
[0007]第二方面，本发明还涉及前述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，包括以下步骤:
[0008]第I步:酶冷冻保护剂的制备:将蔗糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、甘油加入氯化钙溶液中，搅拌至完全溶解，冷冻保存待用；
[0009]第2步:反应酶液的配制:将所述酶冷冻保护剂分别稀释乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶，混合，冷冻干燥后，分别装入C酶瓶和T酶瓶中；
[0010]所述胆碱酯酶是商品化的乙酰胆碱酯酶，其来源可以是从昆虫、动物肝脏、鱼脑、植物或基因工程技术生产的乙酰胆碱酯酶，本申请优选昆虫来源的乙酰胆碱酯酶。所述胆碱氧化酶也为商品化的胆碱氧化酶，其来源于产碱菌、土壤球形节杆菌或基因工程技术生产的胆碱氧化酶，本申请优选产碱菌来源的胆碱氧化酶。所述过氧化物酶是市售的辣根过氧化物酶。
[0011]第3步:底物反应杯的制备:将反应底物垫片放入鲁米诺、氯化乙酰胆碱、二甲基联苯胺混合溶液中，浸泡浙干，并冷冻干燥后，放入聚氯乙烯塑料反应杯，标记为C底物反应杯、T底物反应杯；
[0012]第4步:样品的测试:分别向C、T酶瓶内滴加纯净水，摇匀后，用塑料滴管向所述T酶瓶中滴加待检样品溶液，向C酶瓶中滴加纯净水或磷酸盐缓冲液，摇匀，静置，用滴管从所述C、T酶瓶中吸取反应产物，分别滴加到C、T底物反应杯中，在2?8分钟内于便携式化学发光仪上测定C、T底物反应杯的发光强度，根据发光强度的相对抑制率，确定有机磷的浓度。
[0013]优选地，第I步中，酶冷冻保护剂中包括如下含量的各组分:5?15mmol/L氯化钙溶液100毫升，蔗糖I?3克，甘氨酸I?3克，甘油5?15毫升，牛血清白蛋白I?3克。
[0014]优选地，第2步中，所述乙酰胆碱酯酶稀释3000?8000倍，所述胆碱氧化酶稀释200?800倍，所述过氧化物酶稀释200?800倍。
[0015]优选地，第3步中，所述C底物反应杯、T底物反应杯的底面内径为8?20mm，高度为10?25mm。
[0016]优选地,第3步中,所述反应底物垫片的厚度为3?6mm。
[0017]优选地，第3步中，所述鲁米诺的浓度为1.0\10_4?3.0父10_411101/1、氯化乙酰胆碱的浓度为3.0X10—3?15.0X10_3mol/L、二甲基联苯胺的浓度为2.0X10—3?
10.0X10_3mol/L。
[0018]优选地，第4步中，所述向C、T酶瓶内滴加纯净水为50?200微升，所述待检样品溶液为50?200微升，所述C酶瓶中纯净水为50?200微升，磷酸盐缓冲液为0.lmol/L,且pH为7.0。[0019]优选地，第4步中，所述C、T底物反应杯中的反应产物100?300微升。
[0020]本发明具有如下的有益效果:
[0021](I)检测灵敏度高:本发明选用了含有乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶及过氧化物酶的三酶体系，并建立了基于增敏剂及鲁米诺的化学发光技术，其灵敏度高出数十倍及上千倍，且检测线性范围显著增宽。本发明检测敌敌畏及敌百虫的最低检测限达0.078ppm;检测苯线磷的最低检测限达0.035ppm ;对丁硫克百威的检测限达0.039ppm ；
[0022](2)本发明试剂盒使用方便，操作简单，在测试中不需要复杂的配制试剂过程，非专业人员按照试剂盒说明书便可轻易完成检测；
[0023](3)检测快速:本发明可在半小时内完成样品的前处理过程及检测过程，对蔬菜、水果样品前处理只需要3?5分钟，用试剂盒测试过程需要10?25分钟。
[0024](4)可检测的有机磷范围广:本发明可检测包括涕灭威、氧化乐果、乐果、乙酰甲胺磷、西维因、敌百虫、呋喃丹、丁硫克百威、二嗪农、敌敌畏、百治磷、硫线磷、乙基对硫磷、苯线磷、马拉硫磷、甲胺磷、甲基对硫磷、久效磷、杀线威、亚胺硫磷、辛硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、甲基异硫磷、谷硫磷等在内的数几十种有机磷农药。本发明同时也可检测出一些重金属包括镉、铜、铅、汞及锌等物质在蔬菜、水果上的残留。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
[0026]图1为本发明快速检测有机磷农药残留的试剂盒的模式图；
[0027]其中，I为含有对照及测试用的三酶试剂瓶组，包括C酶瓶、T酶瓶；2为酶瓶密封盖，3为三酶试剂瓶体；4为酶冻干的三酶混合剂；5为底物反应杯杯体；6为含有氯化乙酰胆碱、鲁米诺及二甲基联苯胺的冻干吸水垫；7为对照及测试用二联底物反应杯组，包括C底物反应杯、T底物反应杯。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0029]实施例1
[0030]本实施例涉及一种利用试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，包括以下步骤:
[0031]本实施例检测市售油菜中有机磷农药的残留。
[0032]1、样品前处理，将重量在10克之内的市售油菜叶10份，放置于一带有螺旋盖的塑料及玻璃容器中，也可以用常用的罐头瓶。加入约10毫升的纯净水，摇晃3分钟后，静置2分钟后，取上清可直接用于测试；
[0033]2、酶冷冻保护剂的制备:本实施例的配制方法如下:先配制5mmol/L氯化钙溶液100毫升，然后加入蔗糖I克，甘氨酸I克，甘油5毫升，牛血清白蛋白I克，对以上成分边加入边搅拌，直至所有的粉状试剂全部溶解，然后在_15°C条件下冷冻保存待用；[0034]3、反应酶液的配制:将上述三种酶液用上述酶冷冻保护剂进行稀释，即将每毫克含有425国际酶活性单位的乙酰胆碱酯酶稀释3000倍，将每毫克含有10国际酶活性单位的乙酰胆碱酯酶稀释200倍，将每毫克含有113国际酶活性单位的辣根过氧化物酶稀释200倍。然后各取上述酶液100微升混合于一起，分装在棕色的安瓿瓶中，放在冷冻干燥机上冷冻干燥后，上盖后密封，放置于铝箔袋中，室温保存；
[0035]4、底物反应杯的制备:在本实施例中，用聚氯乙烯塑料反应杯，底面内径为8mm，高度为10mm，所述反应底物垫片的厚度为3mm，将此垫片放入含有浓度为1.0X 10_4mol/L鲁米诺、3.0X 10_3mol/L氯化乙酰胆碱及2.0 X 10_3mol/L 二甲基联苯胺的混合溶液中，浸泡3分钟后浙干，并冷冻干燥后，放入反应杯中，分别标记为C及T杯，封入包装袋中，室温保存待用；
[0036]5、样品的测试:分别向C及T酶瓶滴加50微升纯净水，轻轻摇匀后，向T酶瓶中用定量塑料滴管滴加50微升待检样品溶液，向C酶瓶中用定量塑料滴管滴加50微升纯净水，轻轻摇匀后，放置15分钟，然后用滴管从上述C及T的酶瓶吸取反应产物100微升，分别滴加到C及T底物反应杯中，在2分钟内于便携式化学发光仪上测定C及T底物反应杯的发光强度，根据发光强度的相对抑制率，确定有机磷的浓度。
[0037]结果表明，在10份被检油菜样品中，有2份油菜样品的化学发光抑制率分别为16%及33%，判定为阳性。其余8份油菜样品的化学发光抑制率均小于15%。对照测试阳性样品为5ppm的氧化乐果。
[0038]实施例2
[0039]本实施例涉及一种利用试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，包括以下步骤:
[0040]本实施例检测市售菠菜中有机磷农药的残留。
[0041]1、样品前处理，步骤同实施例1的步骤I ;
[0042]2、酶冷冻保护剂的制备:本实施例的配制方法如下:先配制lOmmol/L氯化钙溶液100毫升，然后加入蔗糖2克，甘氨酸2克，甘油10毫升，牛血清白蛋白2克。对以上成分边加入边搅拌，直至所有的粉状试剂全部溶解，然后在_25°C条件下冷冻保存待用；
[0043]3、反应酶液的配制:将上述三种酶液用上述酶冷冻保护剂进行稀释，即将每毫克含有425国际酶活性单位的乙酰胆碱酯酶稀释5000倍，将每毫克含有10国际酶活性单位的乙酰胆碱酯酶稀释500倍，将每毫克含有113国际酶活性单位的辣根过氧化物酶稀释500倍。然后各取上述酶液200微升混合于一起，分装在棕色的安瓿瓶中，放在冷冻干燥机上冷冻干燥后，上盖后密封，放置于铝箔袋中，室温保存。
[0044]4、底物反应杯的制备:在本实施例中，用聚苯乙烯塑料反应杯。底面内径为12mm，高度为15mm。所述反应底物垫片的厚度为4mm。将此垫片放入含有浓度为2.0 X 10_4mol/L鲁米诺、8.0 X 10_3mol/L氯化乙酰胆碱及6.0 X 10_3mol/L 二甲基联苯胺的混合溶液中，浸泡3分钟后浙干，并冷冻干燥后，放入反应杯中，分别标记为C及T杯，封入包装袋中，室温保存待用；
[0045]5、样品的测试:分别向C及T酶瓶滴加100微升纯净水，轻轻摇匀后，向T酶瓶中用定量塑料滴管滴加100微升待检样品溶液。向C酶瓶中用定量塑料滴管滴加100微升纯净水，轻轻摇匀后，放置20分钟。然后用滴管从上述C及T的酶瓶吸取反应产物200微升，分别滴加到C及T底物反应杯中。然后在5分钟内于便携式化学发光仪上测定C及T底物反应杯的发光强度，根据发光强度的相对抑制率，确定有机磷的浓度。
[0046]结果表明，在10份被检菠菜样品中，有1份油菜样品的化学发光抑制率分别为21%，判定为阳性。其余9份菠菜样品的化学发光抑制率均小于15%。对照测试阳性样品为IOppm的久效磷。
[0047]实施例3
[0048]本实施例涉及一种利用试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，包括以下步骤:
[0049]本实施例检测市售水晶梨中有机磷农药的残留。
[0050]1、样品前处理:先将水晶梨切取八分之一大小，放置于一干净的罐头瓶中。其余步骤同实施例1的步骤I;
[0051]2、酶冷冻保护剂的制备:本实施例的配制方法如下:先配制15mmol/L氯化钙溶液100毫升，然后加入蔗糖3克，甘氨酸3克，甘油15毫升，牛血清白蛋白3克。对以上成分边加入边搅拌，直至所有的粉状试剂全部溶解，然后在_40°C条件下冷冻保存待用；
[0052]3、反应酶液的配制:将上述三种酶液用上述酶冷冻保护剂进行稀释，即将每毫克含有425国际酶活性单位的乙酰胆碱酯酶稀释8000倍，将每毫克含有10国际酶活性单位的乙酰胆碱酯酶稀释800倍，将每毫克含有113国际酶活性单位的辣根过氧化物酶稀释800倍。然后各取上述酶液300微升混合于一起，分装在棕色的安瓿瓶中，放在冷冻干燥机上冷冻干燥后，上盖后密封，放置于铝箔袋中，室温保存。
[0053]4、底物反应 杯的制备:在本实施例中，用聚碳酸酯塑料反应杯。底面内径为20mm，高度为25mm。在制备反应底物垫片时。所述的反应底物垫片时，所用的厚度为6mm。然后将此垫片放入含有浓度为3.0父10_4!1101/1鲁米诺、15.0\10_311101/1氯化乙酰胆碱及
10.0X 10_3mol/L 二甲基联苯胺的混合溶液中，浸泡3分钟后浙干，并冷冻干燥后，放入反应杯中，分别标记为C及T杯，封入包装袋中，室温保存待用；
[0054]5、样品的测试:分别向C及T酶瓶滴加200微升纯净水，轻轻摇匀后，向T酶瓶中用定量塑料滴管滴加200微升待检样品溶液。向C酶瓶中用定量塑料滴管滴加200微升纯净水，轻轻摇匀后，放置25分钟。然后用滴管从上述C及T的酶瓶吸取反应产物300微升，分别滴加到C及T底物反应杯中。然后在8分钟内于便携式化学发光仪上测定C及T底物反应杯的发光强度，根据发光强度的相对抑制率，确定有机磷的浓度。
[0055]结果表明，10份被检水晶梨样品的化学发光抑制率均小于15%，结果判定为均为阴性。对照测试阳性样品为15ppm的甲胺磷。
[0056]本发明利用乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶及过氧化物酶为催化体系，将氯化乙酰胆碱水解氧化后的产物与鲁米诺产生化学发光效应。由于有机磷农药会抑制这种反应体系的三种酶的活性，尤其是乙酰胆碱酯酶的活性，从而可建立灵敏地测试农产品中有机磷农药的方法，并利用此原理研制出检测有机磷农药的化学发光检测试剂盒。本发明有具检测速度快、操作过程简单、稳定性及重复性好、不需要昂贵仪器等优点，非常适合于在农贸市场进行有机磷农药的现场监测。
[0057]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【权利要求】
1.一种快速检测有机磷农药残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:c酶瓶、T酶瓶、C底物反应杯、T底物反应杯，所述C酶瓶、T酶瓶均用酶瓶密封盖密封，且装有酶冻干的三酶混合剂；所述C底物反应杯、T底物反应杯均设置含有氯化乙酰胆碱、鲁米诺及二甲基联苯胺的冻干吸水垫。
2.一种应用权利要求1所述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，其特征在于，包括以下步骤: 第I步:酶冷冻保护剂的制备:将蔗糖、牛血清白蛋白、甘氨酸、甘油加入氯化钙溶液中，搅拌至完全溶解，冷冻保存待用； 第2步:反应酶液的配制:将所述酶冷冻保护剂分别稀释乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶，混合，冷冻干燥后，分别装入C酶瓶和T酶瓶中； 第3步:底物反应杯的制备:将反应底物垫片放入鲁米诺、氯化乙酰胆碱、二甲基联苯胺混合溶液中，浸泡浙干，并冷冻干燥后，放入聚氯乙烯塑料反应杯，标记为C底物反应杯、T底物反应杯； 第4步:样品的测试:分别向C、T酶瓶内滴加纯净水，摇匀后，用塑料滴管向所述T酶瓶中滴加待检样品溶液，向C酶瓶中滴加纯净水或磷酸盐缓冲液，摇匀，静置，用滴管从所述C、T酶瓶中吸取反应产物，分别滴加到C、T底物反应杯中，在2~8分钟内于便携式化学发光仪上测定C、T底物反应杯的发光强度，根据发光强度的相对抑制率，确定有机磷的浓度。
3.如权利要求2所述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，其特征在于，第I步中，酶冷冻保护剂中包括如下含量的各组分:5~15mmol/L氯化钙溶液100毫升,鹿糖I~3克，甘氨酸I~3克，甘油5~15毫 升，牛血清白蛋白I~3克。
4.如权利要求2所述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，其特征在于，第2步中，所述乙酰胆碱酯酶稀释3000~8000倍，所述胆碱氧化酶稀释200~800倍，所述过氧化物酶稀释200~800倍。
5.如权利要求2所述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，其特征在于，第3步中，所述C底物反应杯、T底物反应杯的底面内径为8~20mm，高度为10~25mm。
6.如权利要求2所述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，其特征在于，第3步中，所述反应底物垫片的厚度为3~6_。
7.如权利要求2所述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，其特征在于，第3步中，所述鲁米诺的浓度为1.0X 10_4~3.0X 10_4mol/L、氯化乙酰胆碱的浓度为3.0X 10_3~15.0X10_3mol/L、二甲基联苯胺的浓度为 2.0Χ10-3 ~10.0 X l(T3mol/L。
8.如权利要求2所述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，其特征在于，第4步中，所述向C、T酶瓶内滴加纯净水为50~200微升，所述待检样品溶液为50~200微升，所述C酶瓶中纯净水为50~200微升，磷酸盐缓冲液为0.lmol/L，且pH为7.0。
9.如权利要求2所述的试剂盒快速检测有机磷农药残留的方法，其特征在于，第4步中，所述C、T底物反应杯中的反应产物100~300微升。
【文档编号】G01N21/76GK104007104SQ201410219923
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】刘国艳, 柴春彦, 王艺如, 管毓渝, 任慧鹏 申请人:上海交通大学