检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及elisa试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/pGEX-NP2，其特征在于：rNC蛋白为NP基因C'端编码区的330bp编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为330碱基的原核表达质粒；其是以一种重组大肠杆菌菌株，即可以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，能有效地进行病毒感染和疫苗免疫后的诊断。
【专利说明】检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒，特别是 涉及一种以表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2 在试剂盒中的应用，属于动物病毒学与动物传染病学检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 副流感病毒（PIV)系单股负链RNA病毒目、副粘病毒科、副粘病毒亚科，是一类 不分节段的单股负链RNA病毒，可感染多种动物(包括人在内）。已报道的感染宿主有 人、牛、犬、禽、猴、家兔、鼠、马、羊、雪貂、虎等某些野生动物。牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus 3，BPIV3)是引起牛和其它反刍动物急性呼吸道疾病的主要病毒。 最近几年BPIV3在我国内蒙、黑龙江、山东等地普遍流行。BPIV3引起的病症为牛副流行性 感冒，又称"运输热"，是一种急性接触性传染病，病毒对牛的致病力不强，但在其他继发性 细菌(特别是多杀性巴氏杆菌或溶血性巴氏杆菌）及外界诱因（特别是长途运输中受寒、饥 饿、拥挤、气候恶劣等）的联合作用下，则可产生严重呼吸道症状，甚至可引起病牛的死亡。 同时，BPIV3和牛呼吸道合胞体病毒（BRSV)、牛病毒性腹泻病毒（BVDV)-起构成了牛呼吸 道综合征（Bovine respiratory disease complex, BRDC)的主要病原。目前，牛呼吸道综 合征是引起世界范围内的饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着世界的养牛业。随着 我国加入WTO以后，畜牧产品交易频繁，该病在我国养牛业发达地区广泛流行。临床预防 和治疗中对该病还没有安全、高效的疫苗和药物，随着我国人民生活水平的提高，奶牛和肉 牛养殖业的迅猛发展，养牛成为我国农民致富的手段之一，同时国内大型养牛企业也加大 了牛养殖的投入，频繁的运输等因素使牛群发生BRDC的比率也随之上升。国外对牛群的 BRDC监测和防制一直非常重视，实行严格的检疫、建立BPIV3感染阴性种群作为防制BRDC 发生的有效措施，同时加强对健康牛群和可疑牛群的血清学监测，有针对性采取不同措施， 减少BPIV3的感染和BRDC的发生，为牛群养殖创造良好的条件。因此，对养殖群体定期进 行抗体阳性动物筛选，不断淘汰请群或者制定合适的综合防御措施，避免动物群的感染发 病，广泛而深入地开展BPIV3感染的流行病学调查，进行BPIV3检测技术的研究，研制和开 发BPIV3抗体和抗原监测试剂盒，为国内的BPIV3的防治提供技术支撑。
[0003] BPIV3的诊断目前主要依靠传统的分离病毒检测、免疫荧光检测和分子生物学检 测方法，酶联免疫吸附试验（ELISA)用于BPIV3的诊断仍处于研究阶段。由于ELISA更 适合短时间内检测大批量的血清样品，具有较好的特异性和较高的灵敏度，发展了 ELISA、 Dot-ELISA和阻断ELISA等几种方法。ELISA方法还有方便、易操作，利于在基层兽医部门 和大型养殖区进行现地检测等优点。BPIV3 N蛋白为核衣壳蛋白（NP)，由约515个氨基酸 组成，是病毒核衣壳的主要成份。NP编码基因为病毒的保守序列。NP含有两个结构域，一 个是N端结构域，与RNA结合，高度保守；另一个是C端结构域，裸露于装配完成后的核衣壳 表面，含有对蛋白酶敏感的磷酸化位点和抗原结合位点，与负链RNA病毒基因组模板的活 性有着密切关系。BPIV3 NP的C端与BPIV3抗体具有良好的反应原性，可以用于BPIV3感 染和疫苗免疫后的诊断。因此，选择BPIV3 NP的C端保守序列，构建表达工程菌株，用表达 的重组蛋白作为抗原，可建立检测牛副流感病毒3型抗体的间接ELISA诊断方法。
[0004] 迄今为止，还没有检索到检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA试剂盒的专利，特 别是核心试剂制备方法和制备该核心试剂的生物材料。
[0005]
【发明内容】
[0006] 本发明目的之一在于提供一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛 副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2,是以一种重组大肠 杆菌菌株，即可以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，能有效地进行 病毒感染和疫苗免疫后的诊断。
[0007] 本发明另一个目的是重组大肠杆菌菌株在制备牛副流感病毒3型抗体试剂盒中 的应用。
[0008] 本发明的技术方案是这样实现的：一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc 蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2,其特征在于：rN-C蛋白为NP基因 C'端编码区的330bp 编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因 C'端编码区为330碱基的原核表 达质粒；其具体的构建过程如下： (1) 克隆牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA片段：以分离的牛副流感病毒3型基因组 为模板RNA，通过RT-PCR方法扩增得到N基因 C'端330bp片段（含可表达的330bp)，经 测序分析确定该序列碱基无错配，该cDNA序列与牛副流感病毒3型全基因组在Genebank 中（登录号：JQ063064)对应序列完全相同； (2) 构建原核表达载体PGEX-NP2:将牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA片段与克 隆载体pCR-blunt (购于Invitrogen)连接，经限制性内切酶酶切鉴定无误后，将该序列定 向插入原核表达载体pGEX-6p-l (购于宝生物工程（大连）有限公司）的及I和5?/ I 多克隆位点； (3) 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2的构建：将步骤（2)所述的原 核表达载体PGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21感受态细胞（Escherichia coli BL21购自 北京全式金生物技术有限公司），经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性重组菌株； (4) 牛副流感病毒3型NP的C'端片段在大肠杆菌BL21中的表达：将步骤（3)所述的 重组大肠杆菌Escherichia coli BL2 I/ pGEX_NP2在含50mg/ml氨节青霉素（Amp)抗性 的LB液体培养基中培养，经异丙基硫代-13-0半乳糖昔（IPTG)诱导，Western-blot分 析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白，表达 的蛋白以分泌上清的形式存在于大肠杆菌BL21中，且具有免疫学活性； (5) 牛副流感病毒3型阴、阳性标准血清的制备：选择阴性健康犊牛作为免疫动物。 用制备的牛副流感病毒3型细胞培养物，灭活后与佐剂混合，分3次免疫28?35日龄的健 康牛(最后一次不加佐剂)，当ELISA检测效价达到1:600以上时，颈部动脉无菌采血，获得 的血液分离血清，即为合格的标准阳性血清。将健康阴性牛经颈动脉采血，即为标准阴性血 清。在所制备的阴、阳性标准血清中加入0.01%硫柳汞防腐，过滤除菌，无菌分装。
[0009] 2、一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/ PGEX-NP2在快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA试剂盒中的应用。
[0010] 3、根据权利要求2所述的快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA试剂盒，其特 征在于：包括盒体、包被有已纯化的表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNP2蛋白作为抗 原的酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、羊抗牛IgG酶标二抗、样品稀释液、底物显色A 液、底物显色B液、终止液和洗涤液；以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白 的重组大肠杆菌菌株为抗原，用牛副流感病毒3型阴、阳性标准血清为抗体，通过方阵滴定 实验确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，以方阵滴定确定的抗原最佳浓度包被酶标 板，进行该ELISA检测方法各最适反应条件的确定：封闭液的确定、样品稀释液的确定、血 清最佳反应时间的确定、酶标抗体反应时间的确定、底物最佳反应时间的确定。
[0011] 本发明的积极效果是：（1)生物安全性高，其原核表达载体PGEX-6P-1是分子生 物学中常用表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表达载体PGEX-NP2也没有 任何生物危险性。重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2是将原核表达载体 PGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21感受态细胞后经氨苄青霉素抗性筛选获得，不具生物危险 性。本发明所用的抗原酶标板是用牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白包被的，制备 过程中不涉及牛副流感病毒3型，因此没有牛副流感病毒3型逃逸、扩散的潜在危险。
[0012] (2)生产成本低，其牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒所需抗原是牛副流 感病毒3型NP基因 C'端表达蛋白rNc蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌Escherichia coli BL21 / pGEX-NP2在体外大量表达，适合大规模的生产，具有广泛的应用前景。
[0013] (3)牛副流感病毒3型抗体检测试剂盒，临床上检测牛副流感病毒3型可采用常规 的病毒分离鉴定和中和试验，不但步骤较为繁琐费时，且试验结果可重复性不高。而本发明 从血清学方面检测牛副流感病毒3型抗体，利用"抗原-抗体-抗抗体"结合原理，能快速、 准确、安全地诊断牛副流感病毒3型感染。可用于临床大规模的检测，有利于提前预防牛群 发生BRDC。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为本发明的技术路线。
[0015] 图2为牛副流感病毒NP基因 C'端扩增条带和表达载体pGEX-NP2酶切及PCR检 测的电泳图。A :NP基因片段的PCR产物，泳道1为DL 2000 DNA Marker，泳道2为PCR产 物；B :M 为 DL 2000 DNA Marker ;1，2: pGEX-NP2 的及Ua/ I 单酶切图；3: pGEX-NP2 阳性重组质粒；4: pGEX-NP2重组质粒PCR鉴定。
[0016] 图3为牛副流感病毒NP基因 C'端蛋白诱导表达的SDS-PAGE图。
[0017] 泳道1 :经诱导的BL21/ pGEX-NP2转化子诱导上清蛋白；泳道2 :提取的BL21/ PGEX-NP2转化子诱导全菌；泳道3 :诱导的BL21/pGEX-NP2转化子诱导沉淀；泳道4 :BL21/pGEX_6p_l空载体转化子诱导全菌；泳道M :ProteinMarker。
[0018] 图4为牛副流感病毒NP基因 C'端蛋白的Western-blot分析。
[0019] M 为 Protein Marker ;泳道 1 为 BL21/pGEX-NP2 转化子； 图5为pGEX-NP2蛋白IPTG浓度（mmol/mL)诱导优化。
[0020] M. Protein Ladder ;泳道 1-8: 1. 4、1. 2、1、0. 8、0. 6、0. 4、0. 2、0. 1 ;泳道9: empty vector control 图6为PGEX-NP2蛋白T、Time诱导条件优化。
[0021] M?蛋白质量标准；1-3: 4h、6h、8h ;4、8. empty vector control; 5-7:23°C、3CTC、 37。。。
[0022] 图7为纯化的牛副流感病毒NP基因 C'端蛋白的SDS-PAGE分析。
[0023] 泳道1是经纯化后重折叠上清中的NP基因 C'端蛋白；泳道2为纯化后重折叠沉 淀；M 为 Protein Marker。
[0024] 图8为抗原最佳包被条件优化。
[0025] 图9为最佳封闭液的优化。
[0026] 图10为最佳封闭时间的优化。
[0027] 图11为抗原包被浓度与被检血清稀释度的优化。
[0028] 图12为检验血清工作时间的确定。
[0029] 图13为酶标复合物最佳工作浓度的优化。
[0030] 图14为酶标复合物工作时间的优化。
[0031] 图15为底物显色时间的优化。 图16为对PCR扩增条件进行优化选择。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述：如图1所示， 实施例1 :表达诊断抗原重组质粒PGEX-NP2的构建及重组抗原蛋白表达鉴定 1材料 I. 1主要试剂 MDBK细胞购自中国兽医药品监察所。DMEM培养基、犊牛血清购自美国Invitrogen公 司。LA Taq DNA聚合酶、dNTP、fe?H II为TaKaRa产品。琼脂糖、LB液体培养基和固 体培养基，0. 25%考马斯亮兰染色液，氨苄青霉素（Amp)。
[0033] 病毒与质粒 牛副流感病毒3型NM09株第4代（BPIV3 NM09 F4)为实验室分离鉴定保存。原核表 达载体pGEX_6P_l购自Invitrogen公司。
[0034] 方法 2.1 BPIV3NM09毒株的培养以0.25%胰蛋白酶消化MDBK细胞，加入含6%小牛血 清的DMEM生长液分装克氏瓶静止培养，24h贴壁后换为含2%犊牛血清的DMEM维持液。待 细胞形成单层后，倾去培养液。将冻干的BPIV3 NM09种毒以维持液稀释后，取10 ml加于 细胞单层上37°C吸附30min，补加100 ml维持液，37°C继续培养。
[0035] 病毒RNA提取将病毒培养物反复冻融三次，取病毒原液300 W，加 Trizol (购 自Invitrogen公司）700 W，剧烈摇晃数次，加入200 W三氯甲烷，于4°C，12 000 g离心 5min，小心抽取上层液体，置于微量离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，于-20°C保存备用。 未接毒的MDBK细胞RNA也以同法制备。
[0036] 引物的设计与合成引物序列见表1，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
【权利要求】
1. 检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因C'端rNc 蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2,其特征在于：rNC蛋白为NP基因C'端编码区的330bp 编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为330碱基的原核表 达质粒；其具体的构建过程如下： (1) 克隆牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA片段：以分离的牛副流感病毒3型基因 组为模板RNA，通过RT-PCR方法扩增得到N基因C'端330bp片段含可表达的330bp，将 牛副流感病毒3型NP的C'端的330bp片段与克隆载体pCR-blunt连接，经限制性内切酶 酶切鉴定后，通过测序分析确定该序列碱基无错配，该cDNA序列与牛副流感病毒3型全基 因组在Genebank中登录号：JQ063064对应序列完全相同； (2) 构建原核表达载体PGEX-NP2:将上述测序准确的克隆质粒内的牛副流感病毒3型 NP的C'端的330bp片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-l的汉3?H I和I多克隆位点 之间； (3) 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2的构建：将步骤（2)所述的原 核表达载体PGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性 重组菌株； (4) 牛副流感病毒3型NP的C'端330bp片段在大肠杆菌BL21中的表达：将步骤（3) 所述的重组大肠杆菌BL21/ pGEX-NP2在含50mg/ml氨苄青霉素Amp抗性的LB液体培养 基中培养，经异丙基硫代_ 半乳糖昔IPTG诱导，Western-blot分析，证实该重组大肠 杆菌可以特异性地表达牛副流感病毒3型NP基因C'端rNc蛋白，重组蛋白大小为38KD， 以分泌上清的形式存在于大肠杆菌BL21中，且具有良好的免疫学活性。
2. -种表达牛副流感病毒3型NP基因C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/ pGEX-NP2 在快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA试剂盒中的应用。
3. 根据权利要求2所述的快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA试剂盒，其特征在 于：包括盒体、包被有已纯化的表达牛副流感病毒3型NP基因C'端rNc蛋白作为抗原的 酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、羊抗牛IgG酶标二抗、样品稀释液、底物显色A液、 底物显色B液、终止液和洗涤液；以表达的牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原， 用牛副流感病毒3型阳性标准血清为抗体，通过方阵滴定实验确定抗原最佳包被浓度和血 清最佳稀释度，以方阵滴定确定的抗原最佳浓度包被酶标板，进行该ELISA检测方法各最 适反应条件的确定：封闭液的确定、样品稀释液的确定、血清最佳反应时间的确定、酶标抗 体反应时间的确定、底物最佳反应时间的确定。
【文档编号】G01N33/569GK104391112SQ201410225816
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】王凤雪, 武华, 温永俊, 王炜, 曹丽 申请人:中国农业科学院特产研究所, 华威特（北京）生物科技有限公司