一种双向电泳蛋白质样品的定量方法
【专利摘要】本发明公开了一种双向电泳蛋白质样品的定量方法，包括：双向电泳蛋白样品制备；用双向电泳细胞裂解液配制1-2mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，取8支离心管，分别加入0-200μL牛血清白蛋白溶液，并用超纯水补足至1mL，使标准蛋白的终浓度为0-0.2mg.mL-1，然后每支离心管中加入0.01%考马斯亮蓝G-250或R-250染液5mL，充分混匀，得不同浓度标准混合溶液；双向电泳蛋白样品混合溶液制备；加样，描并框选荧光强度；绘制标准曲线；计算双向电泳蛋白样品的浓度。本发明操作简单，准确、快速且廉价。
【专利说明】一种双向电泳蛋白质样品的定量方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种蛋白质的定量方法。
[0002]
【背景技术】
[0003]蛋白质定量是细胞分子生物学实验中的重要环节。常用的蛋白定量方法有二喹啉甲酸法(BCA法)以及Bradford MM于1976年发明的考马斯亮蓝法(Bradford法)，两者都是基于吸光度值的定量方法。双向电泳(2-D)是蛋白质组学研究过程中的核心技术，由于2-D蛋白样品处理工艺复杂，所用试剂种类繁多。此过程中所使用的尿素、硫脲、曲拉通X-100 (Triton X-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)等试剂易与BCA、考马斯亮蓝(CBB)反应显色，从而影响吸光度值进而影响定量准确性，因此这两种方法都不能用于2-D实验。鉴于以上试剂兼容性问题的存在，伯乐公司(Bio-Rad)公司和通用电气公司(GE)各自研发出专门针对2-D的蛋白质定量试剂盒，但这些试剂盒都是基于分光光度法开发的，操作步骤较多，对实验者操作要求较高，且试剂盒价格不菲。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于 克服上述缺点而提供的一种操作简单，准确、快速且廉价的双向电泳蛋白质样品的定量方法。
[0005]本发明的一种双向电泳蛋白质样品的定量方法，包括如下步骤:
(1)双向电泳蛋白样品制备:取不同来源的生物样品IO-1OOmgJpl_5mL双向电泳细胞裂解液，重悬后收集于离心管冰上超声，每次超声10s，暂停10s，共计5个循环；4°C、14000g离心30min，将上清转移至新离心管，分装后_80°C保存，得双向电泳蛋白样品；
(2)用于绘制标准曲线的不同浓度标准混合溶液的制备:用双向电泳细胞裂解液配制l-2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，取8支离心管，分别加入0-200 μ L牛血清白蛋白溶液，并用超纯水补足至lmL，使标准蛋白的终浓度为0-0.2mg.mL—1，然后每支离心管中加入0.01%考马斯亮蓝G-250或R-250染液5mL，充分混匀，得不同浓度标准混合溶液，待测；
(3)双向电泳蛋白样品混合溶液制备:取10-100μ L双向电泳蛋白样品加入离心管中，用超纯水补足至lmL，再加入0.01%考马斯亮蓝G-250或R-250染液5mL，充分混匀，待测；
(4)加样:取孔板一块，在各孔中分别加入不同浓度标准混合溶液和双向电泳蛋白样品混合溶液200-1000 μ L ；
(5)扫描并框选荧光强度:加样完成后迅速将孔板去盖后用基因公司L1-COR的Odyssey近红外荧光成像系统，在680nm通道下扫描成像，并框选荧光区域；
(6)绘制标准曲线:记录各孔的荧光强度，以不同浓度标准蛋白混合溶液为横坐标(X)，对应的荧光强度为纵坐标(Y)，拟合标准曲线的回归方程；
(7)计算双向电泳蛋白样品的浓度:将双向电泳蛋白样品混合溶液孔的荧光强度代入回归方程，即可计算出待双向电泳蛋白样品的终浓度。在终浓度基础上乘以相应的稀释倍数即是双向电泳蛋白样品原液的浓度。
[0006]上述的一种双向电泳蛋白质样品的定量方法，其中:步骤(1)中双向电泳细胞裂解液中含有:7-9moI/L尿素、0-2moI/L硫脲、质量浓度4%的3- [ (3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、65mmol/L 二硫苏糖醇。
[0007]上述的一种双向电泳蛋白质样品的定量方法，其中:步骤(4)中孔板的规格为24、48或96孔。
[0008]本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，由以上技术方案可知，本发明基于考马斯亮蓝染色联合红外荧光成像法的蛋白质定量方法，以牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质定量的标准品，不同浓度的BSA和考马斯亮蓝G-250 (或R-250)混合形成蛋白-考马斯亮蓝结合物。使用近红外荧光扫描成系统绘制标准曲线用于双向电泳蛋白质样品的定量。经实验证明，在680nm所在波长下，在0.01mg/mL-0.2mg/mL的范围内，蛋白量与荧光强度表现出良好的线性和可重复性。本发明使蛋白质定量不受试剂兼容性的束缚，适用与包括2-D实验和一些试剂兼容性较差的蛋白样品。能使2-D蛋白质定量不再依赖于昂贵且操作繁琐的专用蛋白定量试剂盒。本发明还能用于一些试剂兼容性较差的蛋白样品的浓度的测定。
[0009]
【具体实施方式】
[0010]以下通过实施例和实验例来进一步说明本发明方法的有益效果。
[0011]实施例1:
一种能用于双向电泳技术的蛋白质的定量方法，以人胃腺癌SGC-7901细胞双向电泳蛋白样品为例，包括以下步骤:
(O双向电泳蛋白样品制备:取人胃腺癌SGC-7901细胞样品IOmgJP ImL双向电泳细胞裂解液(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、质量浓度4%的3-[(3_胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、65mmol/L 二硫苏糖醇)，重悬后收集于15mL离心管冰上超声，每次超声IOs,暂停IOs,共计5个循环jX^HOOOg离心30min,将上清转移至新离心管，分装后_80°C保存；
(2)不同浓度标准蛋白与考马斯亮蓝G-250混合溶液的制备(用于绘制标准曲线):用双向电泳细胞裂解液配制2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，分别取O μ L，5 μ L，15 μ L，25 μ L，35 μ L，50 μ L，75 μ L，100 μ L加入到编号为1-8的离心管中，用超纯水补足到ImL,使蛋白终浓度分别为 Omg.mL S 0.01mg.mL ^0.03mg.mL \ 0.05mg.mL \ 0.07mg.mL S 0.1mg.ml/1,0.15mg.ml/1,0.2mg.ml/1,然后每支离心管中加入0.01%考马斯亮蓝G-250染液5mL,充分混匀，待测；
(3)双向电泳蛋白样品混合溶液制备:取一支离心管，标记为9号，加入待测浓度的双向电泳蛋白样品溶液10 μ L，用超纯水补足lmL，再加入0.01%考马斯亮蓝G-250染液5mL，充分混匀，待测；
(4)加样:将离心管中的混合溶液充分混匀后，取96孔板一个，从1-8号离心管中各取混合液200 μ L，分别加入到第一排8个孔；从9号中取混合溶液200 μ L，分别加入到第二排的第I个孔；
(5)扫描并框选荧光强度:加样完成后迅速将96孔板去盖后用基因有限公司L1-COR的Odyssey近红外荧光成像系统，选择成像区域后用680nm通道扫描成像，并框选荧光区域(孔板各孔的圆形荧光区域);
(6)绘制标准曲线:记录680nm通道下各孔的荧光强度，以不同浓度标准蛋白混合溶液为横坐标(X)，对应的荧光强度为纵坐标(Y)，拟合标准曲线的回归方程为y = 34.96x +0.971，R2=0.991。
[0012](7)计算双向电泳蛋白样品的浓度:将SGC-7901蛋白样品混合溶液孔的荧光强度1.53代入回归方程，计算得双向电泳蛋白样品的浓度为0.016mg/mL，则原液浓度为
0.016X100 (稀释倍数)=1.60mg/mL。
[0013]实施例2
一种能用于双向电泳技术的蛋白质的定量方法，以人肝癌HepG2细胞双向电泳蛋白样品为例，包括以下步骤:
(1)双向电泳蛋白样品制备:取人肝癌IfepG2细胞样品lOOmg，加5mL双向电泳细胞裂解液(9mol/L尿素、质量浓度4%的3-[(3_胆酰胺基丙基)二甲基铵基]_1_丙磺酸盐、65mmol/L 二硫苏糖醇),重悬后收集于15mL离心管冰上超声,每次超声IOs,暂停IOs,共计5个循环；4°C、14000g离心30min，将上清转移至新离心管，分装后-80°C保存；
(2)不同浓度标准蛋白与考马斯亮蓝G-250混合溶液的制备(用于绘制标准曲线):用双向电泳细胞裂解液配制lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，取8支15mL离心管，编号为1-8 号，在 1-8 号管分别加入 0μ L、10y L、30y L、50y L、70y L、100y L、150y L、200y L 牛血清白蛋白溶液，并用超纯水补足至ImL,使标准蛋白的终浓度为:0mg.ml/1,0.01mg.mL-1,
0.03mg.mL \ 0.05mg.mL S 0.07mg.mL S 0.lmg.mL \ 0.15mg.HiL1j0.2mg.mL 1,然后每支离心管中加入0.01%考马斯亮蓝G-250染液5mL，充分混匀，待测；
(3)双向电泳蛋白样品与考马斯亮蓝G-250混合溶液制备:取一支离心管，标记为9号，加入待测浓度的双向电泳蛋白样品溶液50 μ L，用超纯水补足lmL，再加入0.01%考马斯亮蓝G-250染液5mL，充分混匀，待测；
(4)加样:将离心管中的混合溶液充分混匀后，取48孔板一块，从1-8号离心管中各取混合液500 μ L，分别加入到第一排8个孔；从9号中取混合液500 μ L，分别加入到第二排的第I个孔；
(5)扫描并框选荧光强度:加样完成后迅速将48孔板去盖后用基因有限公司L1-COR的Odyssey近红外荧光成像系统，选择成像区域后用680nm通道扫描成像，并框选荧光区域(孔板各孔的圆形荧光区域)；
(6)绘制标准曲线:记录680nm通道下各孔的荧光强度，以不同浓度标准蛋白混合溶液为横坐标(X)，对应的荧光强度为纵坐标(Y)，拟合标准曲线的回归方程为y = 32.632x+1.7561，R2 = 0.9942 ；
(7)计算双向电泳蛋白样品的浓度:将HepG2细胞蛋白质的荧光强度7.66代入回归方程，计算得双向电泳蛋白样品的浓度为0.18mg/mL，则原液浓度为0.18X20 (稀释倍数)=
3.60mg/mLo
[0014]实施例3
一种能用于双向电泳技术的蛋白质的定量方法，以人宫颈癌HeIa细胞双向电泳蛋白样品为例，包括以下步骤:(O双向电泳蛋白样品制备:取人宫颈癌Hela细胞样品50mg，加3mL双向电泳细胞裂解液(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、质量浓度为4%的3-[(3_胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、65mmol/L 二硫苏糖醇)，重悬后收集于15mL离心管冰上超声，每次超声IOs,暂停IOs,共计5个循环,411CUHOOOg离心30min,将上清转移至新离心管，分装后_80°C保存；
(2)不同浓度标准蛋白与考马斯亮蓝R-250混合溶液的制备(用于绘制标准曲线):用双向电泳细胞裂解液配制lmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，取8支15mL离心管，编号为1-8 号，在 1-8 号管分别加入 0μ L、10y L、30y L、50y L、70y L、100y L、150y L、200y L 牛血清白蛋白溶液，并用超纯水补足至ImL,使标准蛋白的终浓度为:0 mg.mL_1,0.01mg.mL-1,
0.03mg.mL \ 0.05mg.mL S 0.07mg.mL S 0.lmg.mL \ 0.15mg.HiL1j0.2mg.mL 1,然后每支离心管中加入0.01%考马斯亮蓝R-250染液5mL，充分混匀，待测；
(3)双向电泳蛋白样品与考马斯亮蓝R-250混合溶液制备:取一支离心管，标记为9号，加入待测浓度的双向电泳蛋白样品溶液100 μ L，用超纯水补足lmL，再加入0.01%考马斯亮蓝R-250染液5mL，充分混匀，待测；
(4)加样:将离心管中的混合溶液充分混匀后。取24孔板一块，从1-8号离心管中各取混合液1000 μ L，分别加入到第一排6个孔和第二排1，2孔；从9号中取混合液1000 μ L，分别加入到第三排的第I个孔；
(5)扫描并框选荧光强度:加样完成后迅速将24孔板去盖后用基因有限公司L1-COR的Odyssey近红外荧光 成像系统，选择成像区域后用680nm通道扫描成像，并框选荧光区域(孔板各孔的圆形荧光区域)；
(6)绘制标准曲线:记录680nm通道下的荧光强度，以不同浓度标准蛋白混合溶液为横坐标(X)，对应的荧光强度为纵坐标(Y)，拟合标准曲线的回归方程为I = 35.245x +1.639，R2 = 0.9899 ；
(7)计算双向电泳蛋白样品的浓度:将待测蛋白G-250蛋白样品孔的荧光强度7.52代入回归方程，计算得双向电泳蛋白样品的浓度为0.17mg/mL，则原液浓度为0.17X10 (稀释倍数)=1.70 mg/mL。
[0015]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【权利要求】
1.一种双向电泳蛋白质样品的定量方法，包括如下步骤:双向电泳蛋白样品制备:取不同来源的生物样品IO-1OOmgJp l_5mL双向电泳细胞裂解液，重悬后收集于离心管冰上超声，每次超声IOs,暂停IOs,共计5个循环jX^HOOOg离心30min,将上清转移至新离心管，分装后_80°C保存，得双向电泳蛋白样品； (2)用于绘制标准曲线的不同浓度标准混合溶液的制备:用双向电泳细胞裂解液配制l-2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液，取8支离心管，分别加入0-200 μ L牛血清白蛋白溶液，并用超纯水补足至lmL，使标准蛋白的终浓度为0-0.2mg.rnL—1，然后每支离心管中加入0.01%考马斯亮蓝G-250或R-250染液5mL，充分混匀，得不同浓度标准混合溶液，待测； (3)双向电泳蛋白样品混合溶液制备:取10-100μ L双向电泳蛋白样品加入离心管中，用超纯水补足至lmL，再加入0.01%考马斯亮蓝G-250或R-250染液5mL，充分混匀，待测； (4)加样:取孔板一块，在各孔中分别加入不同浓度标准混合溶液和双向电泳蛋白样品混合溶液200-1000 μ L ； (5)扫描并框选荧光强度:加样完成后迅速将孔板去盖后用基因公司L1-COR的Odyssey近红外荧光成像系统，在680nm通道下扫描成像，并框选荧光区域； (6)绘制标准曲线:记录各孔的荧光强度，以不同浓度标准蛋白混合溶液为横坐标(X)，对应的荧光强度为纵坐标(Y)，拟合标准曲线的回归方程； (7)计算双向电泳蛋白样品的浓度:将双向电泳蛋白样品混合溶液孔的荧光强度代入回归方程，即可计 算出待双向电泳蛋白样品的终浓度，在终浓度基础上乘以相应的稀释倍数即是双向电泳蛋白样品原液的浓度。
2.如权利要求1所述的一种双向电泳蛋白质样品的定量方法，其中:步骤(1)中双向电泳细胞裂解液中含有:7-9mol/L尿素、0-2mol/L硫脲、质量浓度4%的3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、65mmol/L 二硫苏糖醇。
3.如权利要求1或2所述的一种双向电泳蛋白质样品的定量方法，其中:步骤(4)中孔板的规格为24、48或96孔。
【文档编号】G01N21/64GK104020145SQ201410227258
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】刘云, 曹嵩, 李晓飞, 朱欣婷, 胡姗姗, 卜雯雯, 邓文文, 刘仕福 申请人:遵义医学院