一种同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条。所述试纸条包括并列设置的第一胶条和第二胶条；所述第一胶条包括顺次搭接的第一样品垫、第一结合物垫、第一硝酸纤维素膜和第一吸水纸，其中所述第一结合物垫上涂覆有病毒抗体标记的胶体金，所述第一硝酸纤维素膜上包被有病毒抗体作为第一检测线并包被有抗胶体金上病毒抗体的抗体作为质控线；所述第二胶条包括顺次搭接的第二样品垫、第二结合物垫、第二硝酸纤维素膜和第二吸水纸，其中所述第二结合物垫上涂覆有病毒抗原标记的胶体金，所述第二硝酸纤维素膜上包被有抗人IgG抗体作为第二检测线并包被有抗人IgM抗体作为第三检测线；能同时检测病毒抗原及其IgM和IgG抗体。
【专利说明】一种同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条【技术领域】
[0001]本发明属于免疫检测分析【技术领域】，涉及一种同时检测病毒抗原及其特异性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)的胶体金免疫层析试纸条。
【背景技术】
[0002]流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是:急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般，秋冬季节是其高发期，所 引起的并发症和死亡现象非常严重。该病是由流感病毒引起流行性感冒，病毒属正粘病毒科，直径80~120nm，球形或丝状。流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型流感病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。甲型HlNl也就是一种甲型流感病毒，本病具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。正确诊断此病原体对迅速治愈具有十分重要的意义。
[0003]甲型流感病毒依据流感病毒血凝素蛋白(HA)的不同可分为1-16种亚型，根据病毒神经氨酸酶蛋白(NA)的不同可分为1-9种亚型，HA不同亚型可以与NA的不同亚型相互组合形成不同的流感病毒。
[0004]免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)是人类或者动物体内最重要的两种抗体。如图1所示，当机体感染流感病毒之后，起初未来得及引起机体的免疫反应，因此，此时只能检测到病毒抗原。之后，引起机体的免疫反应，刺激机体产生抗体IgM和IgG抗体。如图2所示，当机体感染流感病毒后，在体内最早出现的是流感病毒的IgM抗体，之后再出现流感病毒的特异性IgG抗体。因此，通过检测机体内病毒抗原，及其特异性的IgM抗体和IgG抗体的存在与否，可以诊断机体对流感病毒的免疫反应状态。若只能检测到病毒抗原，说明机体刚感染几天，若血清内检测出病毒特异性的IgM抗体，证明该机体有近期流感的发生，但由于IgM半衰期较短，IgM的检测阴性并不能证明机体未受到流感的感染，还需要检测半衰期较长、含量最高的IgG抗体，以明确诊断。而病毒抗原在机体内存在一个最高值，浓度也会随时间的变化而变化，会存在检测不到的情况。因此，通过同时检测流感病毒抗原及其特异性的IgM抗体和IgG抗体，能够准确的判断该机体的免疫学反应状态，从而根据检测结果，给出准确的检测结果，最终给以一定的临床治疗。遗憾的是，目前并没有同时检测流感病毒抗原及其特异性的IgM抗体和IgG抗体的试纸条。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，提供一种同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条。所述胶体金免疫层析试纸条不仅能在一次检测中同时检测病毒抗原及其特异性IgM抗体和IgG抗体，而且能够避免漏检，可以大大缩短检测时间和降低检测费用，达到现场检测的目的。[0006]为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案:
[0007]—种同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条，包括并列设置的第一胶条和第二胶条；所述第一胶条包括顺次搭接的第一样品垫、第一结合物垫、第一硝酸纤维素膜和第一吸水纸，其中所述第一结合物垫上涂覆有病毒抗体标记的胶体金，所述第一硝酸纤维素膜上包被有病毒抗体作为第一检测线并包被有抗胶体金上病毒抗体的抗体作为质控线；所述第二胶条包括顺次搭接的第二样品垫、第二结合物垫、第二硝酸纤维素膜和第二吸水纸，其中所述第二结合物垫上涂覆有病毒抗原标记的胶体金，所述第二硝酸纤维素膜上包被有抗人IgG抗体作为第二检测线并包被有抗人IgM抗体作为第三检测线。
[0008]作为本发明的优选技术方案，所述胶体金上病毒抗体为鼠源性抗体，所述作为质控线的抗体为羊抗鼠IgG。鼠源性抗体是目前商业化抗体中最常见的抗体形式，来源广泛，成本较低，并且特异性和稳定性好。所述病毒抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，制备所述多克隆抗体或单克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的，比如可以用相应病毒免疫动物，如鼠，从动物血清中纯化多克隆抗体，但是多克隆抗体相比单克隆抗体可能存在特异性不强的问题，有可能有假阳性结果的产生。具体到本发明，所述病毒抗体虽然可以采用多克隆抗体，但是单克隆抗体具有更明显的优势，因此是本发明的优选，制备所述单克隆抗体的方法比如可以是用相应病毒免疫动物，如鼠，取动物脾脏B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，从中获取特异性较强的单克隆抗体。
[0009]作为本发明的优选技术方案，所述抗人IgG抗体为兔抗人IgG抗体或羊抗人IgG抗体，优选为兔抗人IgG抗体。
[0010]作为本发明的优选技术方案，所述抗人IgM抗体为兔抗人IgM抗体或羊抗人IgM抗体，优选为兔抗人IgM抗体。
[0011]作为本发明的优选技术方案，所述病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒或副流感病毒，优选为甲型流感病毒、乙型流感病毒或腺病毒。
[0012]作为本发明的优选技术方案，所述胶体金的粒径为20?30nm。粒径范围在20?30nm的胶体金具有优异的分散性及在流体中的流动性，不会有团聚等现象的发生，有利于本发明中抗体和抗原间的免疫反应及随毛细作用下的移动。
[0013]作为本发明的优选技术方案，所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，优选为玻璃纤维膜。
[0014]作为本发明的优选技术方案，所述结合物垫为玻璃纤维膜。
[0015]作为本发明的优选技术方案，所述胶体金免疫层析试纸条还包括底板，所述第一胶条和第二胶条均设置在所述底板上。
[0016]优选地，所述底板为聚氯乙烯胶板。
[0017]作为本发明的优选技术方案，所述胶体金免疫层析试纸条还包括卡壳，所述第一胶条和第二胶条均置于所述卡壳内。
[0018]优选地，所述卡壳上开有加样区和显色区，所述加样区与所述第一样品垫和第二样品垫相对应，所述显色区与所述第一硝酸纤维素膜和第二硝酸纤维素膜相对应。
[0019]优选地，所述加样区的数量为2个，分别与所述第一样品垫和第二样品垫相对应。
[0020]优选地，所述显色区的数量为2个，分别与所述第一硝酸纤维素膜和第二硝酸纤维素膜相对应。[0021]本发明所述的胶体金免疫层析试纸条依照免疫捕获法原理和双抗体夹心法原理同时测定病毒抗原及其特异性IgM和IgG抗体，通过一次性操作即可联合检测出流感等病毒抗原及其特异性IgM和IgG抗体。这种胶体金免疫层析试纸条具有特异性强、价格低廉及读取结果快捷而直观等优点，不需要特殊仪器设备，也不需要专业人员的操作，检测结果的总体符合率较高，适合于现场检测。而且重要的是实现抗原和抗体的同时检测，避免漏检，起到双重保险作用，从而获取机体感染流感病毒的更多相关信息，具有重要的临床意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为机体感染流感病毒后，体内病毒抗原及其总抗体的浓度随时间的变化情况；
[0023]图2为机体感染流感病毒后，体内抗原/抗体随时间的变化情况；
[0024]图3为本发明同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条的示意图，其中，1:流感病毒抗原加样区；2:血清抗体检测加样区；3:抗原检测观测窗口 ；4:抗体检测观测窗口 ；5:第一检测线(Tl线)；6:质控线(C线)；7:第二检测线(T2线)8:第三检测线(T3 线)；
[0025]图4为本发明中的病毒抗原及抗体检测原理图；
[0026]图5为本发明病毒抗原阳性检测结果示意图；
[0027]图6为本发明病毒抗原/IgM抗体阳性检测结果示意图；
[0028]图7为本发明病毒抗原/IgM/IgG抗体阳性检测结果示意图；
[0029]图8为本发明病毒抗原/IgG抗体阳性检测结果示意图；
[0030]图9为本发明病毒IgM抗体阳性检测结果示意图；
[0031]图10为本发明病毒IgM/IgG抗体阳性检测结果示意图；
[0032]图11为本发明病毒IgG抗体阳性检测结果示意图；
[0033]图12为本发明病毒阴性检测结果示意图；
[0034]图13为本发明病毒无效检测结果示意图；
[0035]图14为本发明实施例中金纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片。
【具体实施方式】
[0036]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
[0037]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0038]本发明能够同时检测流感病毒抗原及其特异性IgM、IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条可按照下述方法制备(参考图2):
[0039]在聚氯乙烯(PVC)胶板上一端顺次相互搭接地贴上样品垫、结合物垫(两块)、硝酸纤维素膜、吸水纸，然后将PVC胶板及贴附的材料切成两条试纸条(宽度如4_)，并装入卡壳内，卡壳上开有两个加样区和两个显色区(观察区域)。
[0040]其中，所述样品垫为玻璃纤维膜；所述结合物垫包括:涂覆有流感病毒抗体标记的胶体金的第一结合物垫，涂覆有流感病毒抗原标记的胶体金的第二结合物垫；所述硝酸纤维素膜包括:第一硝酸纤维素膜和第二硝酸纤维素膜，所述第一硝酸纤维素膜上包被有:Tl线为流感病毒的包被抗体，C线为羊抗鼠IgG抗体，所述第二硝酸纤维素膜上包被有:T2线为兔抗人的IgG抗体，Τ3线为兔抗人的IgM抗体。
[0041]如图4所示，本发明能够同时检测流感病毒抗原及其特异性IgM、IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条的检测原理，具体如下:
[0042]在加样区(样品垫)加入被检测样品后，通过毛细作用，检测病毒抗原的区域中:样品中抗原-抗体-胶体金的结合物向吸水纸一端的方向移动。如果被检测样品中含有该流感病毒的抗原，样品移动到Tl线即流感病毒的包被抗体的包被线时，抗原-抗体-胶体金的结合物被捕获，在Tl线处生成抗体-抗原-抗体-胶体金的结合物，因此显示一条红色条带；样品继续流动，流动到C线即羊抗鼠IgG抗体时,会出现一条红色条带,证明该试纸条的有效性。若检测的实际样品中不存在病毒抗原，则在Tl线处不会显示红色条带。在检测血清抗体的区域，加入待检测的血清时，如果样品中的IgG含有针对流感病毒抗原的IgG抗体，当样品通过T2线即抗人的IgG抗体包被线时，样品中的IgG抗体与抗人IgG抗体结合，则IgG-抗原-胶体金的结合物被捕获，在T2线显示一条红色条带；样品继续移动至T3处即抗人的IgM包被线时，样品中的IgM抗体与抗人IgM抗体结合，则IgM-抗原-胶体金的结合物被捕获，在T3线显示一条红色条带。若检测的实际样品中没有针对该流感病毒的IgG和IgM抗体时，则在T2和T3线处不会显示红色条带。若只有C线显色，则都为阴性，证明该机体未感染流感。只要C线不显色，证明该试纸条无效，需要重新检测实际样品。各种检测结果示意图如图5-13所示，并且表I汇总了各种检测结果的解释。
[0043]表I检测结果统计(“ + ”显色，不显色)
[0044]
【权利要求】
1.一种同时检测病毒抗原和抗体的胶体金免疫层析试纸条，包括并列设置的第一胶条和第二胶条；所述第一胶条包括顺次搭接的第一样品垫、第一结合物垫、第一硝酸纤维素膜和第一吸水纸，其中所述第一结合物垫上涂覆有病毒抗体标记的胶体金，所述第一硝酸纤维素膜上包被有病毒抗体作为第一检测线并包被有抗胶体金上病毒抗体的抗体作为质控线；所述第二胶条包括顺次搭接的第二样品垫、第二结合物垫、第二硝酸纤维素膜和第二吸水纸，其中所述第二结合物垫上涂覆有病毒抗原标记的胶体金，所述第二硝酸纤维素膜上包被有抗人IgG抗体作为第二检测线并包被有抗人IgM抗体作为第三检测线。
2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金上病毒抗体为鼠源性抗体，所述作为质控线的抗体为羊抗鼠IgG。
3.根据权利要求1或2所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗人IgG抗体为兔抗人IgG抗体或羊抗人IgG抗体，优选为兔抗人IgG抗体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗人IgM抗体为兔抗人IgM抗体或羊抗人IgM抗体，优选为兔抗人IgM抗体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒或副流感病毒，优选为甲型流感病毒、乙型流感病毒或腺病毒。
6.根据权利要求1-5任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金的粒径为20?30nm。
7.根据权利要求1-6任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维膜或聚酯纤维膜，优选为玻璃纤维膜。
8.根据权利要求1-7任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合物垫为玻璃纤维膜。
9.根据权利要求1-8任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金免疫层析试纸条还包括底板，所述第一胶条和第二胶条均设置在所述底板上； 优选地，所述底板为聚氯乙烯胶板。
10.根据权利要求1-9任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金免疫层析试纸条还包括卡壳，所述第一胶条和第二胶条均置于所述卡壳内； 优选地，所述卡壳上开有加样区和显色区，所述加样区与所述第一样品垫和第二样品垫相对应，所述显色区与所述第一硝酸纤维素膜和第二硝酸纤维素膜相对应； 优选地，所述加样区的数量为2个，分别与所述第一样品垫和第二样品垫相对应； 优选地，所述显色区的数量为2个，分别与所述第一硝酸纤维素膜和第二硝酸纤维素膜相对应。
【文档编号】G01N33/577GK103983776SQ201410228165
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】蒋兴宇, 曹丰晶, 张伟, 陈翊平, 赵大龙 申请人:国家纳米科学中心