一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置及其制备方法
【专利摘要】一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置及其制备方法，涉及纳米填料毛细管色谱微柱制备。所述纳米填料毛细管色谱微柱制备装置设有离心机和离心填充装置，离心填充装置设有可拆卸PEEK接头、PEEK接口、PTFE套管、毛细管及离心管。取纳米粒子分散于丙酮中，浓度控制为1～50μg/μL，匀浆溶液混匀后振荡，得匀浆液；截取一段弹性石英毛细管，将粒径尺寸略大于毛细管内径的单个贯穿孔硅球压入毛细管一端作为出口柱塞；将带有出口柱塞的毛细管固定在离心填充装置中，在储液槽中注入匀浆液，称重离心，进行固定相填充；离心完成后，取下填充好的毛细管，在毛细管入口端填入一颗贯穿孔硅胶颗粒作为入口柱塞，即得纳米填料毛细管色谱微柱。
【专利说明】一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米填料毛细管色谱微柱制备，尤其涉及简单、快速、批量制备纳米填料毛细管色谱微柱的一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置及其制备方法。
【背景技术】
[0002]随着蛋白质组学和代谢组学研究的蓬勃发展，目前的色谱分离技术难以满足高分辨率、高选择性以及快速分析的要求，因而迫切需要新型高效、高专一性的色谱固定相。纳米材料因其均一的粒径分布、高比表面积、丰富的表面修饰化学和优良的稳定性逐渐引起人们对其色谱应用的重视。研究表明，无论是作为色谱填料还是富集材料，纳米材料确实具有分离效率高、富集效率高、稳定性好和选择性专一等优势。因此，如何有效地利用纳米填料成为色谱研究的重要课题。
[0003]众所周知，色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件之一，是色谱分离的核心。毛细管柱是液相色谱柱中的一种，多采用内径50?300 μ m的弹性石英管来制备。其较小的柱体积能显著降低柱填料和流动相的消耗，尤其适合微量与痕量样品的分离分析。目前，毛细管柱的填料主要为微米级颗粒，纳米级颗粒毛细管柱应用甚少，主要原因是纳米填料毛细管柱制备极其困难，大大限制了其应用。因此，如何制备纳米级填料的毛细管柱成为能否推广纳米色谱材料的关键问题之一。经调研，制备纳米填料毛细管色谱柱的方法主要是高压匀浆湿法填充。这种方法需要至少600bar的高压泵设备，单次填充只能得到一根毛细管柱，填充难度大、耗时长、填充速度不均一，且由于操作困难和繁琐等因素无法保证柱与柱之间的重现性，这些都大大限制了纳米填料毛细管柱的制备效率。
[0004]本 申请人:在中国专利CN102590402A中公开一种毛细管色谱柱的制备方法，将要填充的颗粒填料加入丙酮中，制备成匀浆液；将粒径尺寸大于毛细管内径的单个多孔硅球压入毛细管一端，再将单颗粒硅球推至毛细管内作为出口柱塞；将毛细管入口端与储液器联通，向储液器中加入匀浆液后置于离心机上离心，固定相在重力和离心力驱使下进入毛细管柱；另将一颗单颗粒硅球压入填充好的毛细管柱的入口端作为入口柱塞；将制备好的毛细管柱保存待用。
[0005]中国专利CN101923079A公开一种带有喷头的混合型毛细管色谱柱及其制备方法，将不同内径和长度的毛细管通过预处理后，根据需要在喷头端合成不同长度的聚合物整体材料，合成后在毛细管剩余部分，采用匀浆装柱法填充制备好的高效颗粒填料，并根据需求改变填充填料的种类、颗粒的大小、填充长度以及选择在尾端合成同样的材料，并在制备完成后用甲醇等试剂在高压恒流泵体系中压实、老化。制备好色谱柱在进行柱效评价后，应用于液-质联用系统中，可以有效解决传统的带喷头填充柱由于柱喷头随着毛细管色谱柱使用过程中因压力过大而导致部分填充颗粒填料破碎，在使用过程中脱出或堵塞毛细管色谱柱喷头的问题。
【发明内容】
[0006]本发明旨在克服纳米填料毛细管色谱微柱制备过程复杂、制备周期长、制备所需设备昂贵等问题，提供利用离心机的离心力代替机械泵的高液压进行纳米填料的一次性持续填充，操作简单，耗时短，且支持批量制备的一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置及其制备方法。
[0007]所述纳米填料毛细管色谱微柱制备装置设有离心机和离心填充装置，所述离心填充装置设有可拆卸PEEK接头、PEEK接口、PTFE套管、毛细管及离心管；所述毛细管插入PTFE套管后固定于PEEK接口上；PEEK接头与PEEK接口拧紧以固定毛细管并固定于离心管上；离心管插入离心机的转子中。
[0008]所述离心管上可设有离心管盖。
[0009]所述离心填充装置可采用粒径为150?950nm的纳米微球作为色谱填料，离心填充装置紧密连接于固定毛细管微柱，从而高效快速制备纳米填料毛细管色谱微柱。
[0010]所述纳米填料毛细管色谱微柱的制备方法，包括以下步骤:
[0011]I)制备匀浆液
[0012]取纳米粒子分散于丙酮中，浓度控制为I?50 μ g/μ L，匀浆溶液混匀后振荡，得匀浆液；
[0013]2)制备出口柱塞
[0014]截取一段弹性石英毛细管，将粒径尺寸略大于毛细管内径的单个贯穿孔硅球压入毛细管一端作为出口柱塞；
[0015]3)固定相填充
[0016]将带有出口柱塞的毛细管固定在离心填充装置中，在储液槽中注入匀浆液，称重离心，进行固定相填充；
[0017]4)制备入口柱塞
[0018]离心完成后，取下填充好的毛细管，在毛细管入口端填入一颗贯穿孔硅胶颗粒作为入口柱塞，即得纳米填料毛细管色谱微柱。
[0019]在步骤I)中，所述振荡可先手摇振荡使匀浆溶液初步混匀，然后在超声波振荡仪中振荡5?30min,使填料均勻分布于液体中。
[0020]本发明方法简便高效，所使用的纳米填料固定相不受材料、尺寸、结构、表面化学等性质的限制，适合于不同内径尺寸的毛细管色谱柱的批量制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是本发明所述纳米填料毛细管色谱微柱制备装置实施例的离心填充装置结构示意图。
[0022]图2是图1分解示意图。
[0023]图3是S12纳米微球SEM表征图。
[0024]图4是S12纳米微球TEM表征图。
[0025]图5是烷基修饰S12纳米填料FTIR表征图。在图5中，曲线a为S12，曲线b为Si02-C8。
[0026]图6是烷基修饰S12纳米填料毛细管色谱微柱柱床SEM表征图。
[0027]图7是Si02@Au-S_C18纳米填料毛细管色谱微柱富集醋酸生长抑素的色谱图。在图7中，曲线a为5μ g/mL醋酸生长抑素原样，曲线b为5μ g/mL醋酸生长抑素富集液。
[0028]图8是Si02@Au-S_C18纳米填料毛细管色谱微柱富集卵清蛋白的色谱图。在图8中，曲线a为10 μ g/mL卵清蛋白原样，曲线b为80 μ LlO μ g/mL卵清蛋白短柱I富集液，曲线c为80 μ LlO μ g/mL卵清蛋白短柱I富集液，曲线d为80 μ LlO μ g/mL卵清蛋白短柱I富集液。
【具体实施方式】
[0029]以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0030]参见图1和2，所述纳米填料毛细管色谱微柱制备装置实施例设有离心机和离心填充装置，所述离心填充装置设有可拆卸PEEK接头1、PEEK接口 2、PTFE套管3、毛细管4及离心管5 ;所述毛细管4插入PTFE套管3后固定于PEEK接口 2上；PEEK接头I与PEEK接口 2拧紧以固定毛细管并固定于离心管5上；离心管5插入离心机(在图1和2中未画出)的转子中。
[0031]所述离心管5上可设有离心管盖51。
[0032]所述离心填充装置可采用粒径为150?950nm的纳米微球作为色谱填料，离心填充装置紧密连接于固定毛细管微柱，从而高效快速制备纳米填料毛细管色谱微柱。
[0033]以下给出本发明所述纳米填料毛细管色谱微柱的制备方法实施例。
[0034]实施例1:烷基修饰S12纳米填料毛细管色谱微柱的制备
[0035]a烷基修饰S12纳米填料的合成
[0036]将无水乙醇、水与氨水以47: 9: 14的体积比混合加入圆底烧瓶中，磁力搅拌混合均匀，搅拌状态下加入上述1/14体积的正硅酸四乙酯。在一定温度下密闭搅拌反应6?1h ;之后在搅拌状态下加入上述半量体积的正硅酸四乙酯、无水乙醇、水等，继续反应6?1h,陈化I?2h，离心水洗至少3次，乙醇洗至少3次，110°C烘干4?6h，冷却后16h内在马弗炉中由室温程序升温至600?650°C。图3和4为合成的S12纳米填料扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图，可以看出所合成的纳米填料尺寸均一。取上述合成的S12微球分散于甲苯中(质量比为1: 449)，一次性加入溶有三乙胺的正辛基三乙氧基硅烷(质量比为4.8: 1.7), 110?120°C条件下磁性搅拌回流15?17h，水和乙醇分别洗至少3次后即可获得烷基修饰的S12纳米填料。图5为FTIR表征图，2850CHT1和2920cm—1处有一CH2的吸收峰，说明C8成功键合在S12表面。
[0037]b纳米填料毛细管色谱微柱的制备
[0038](I)制备匀浆液
[0039]取14mg正辛基三乙氧基硅烷修饰的S12纳米填料分散于ImL丙酮中，手摇振荡使匀浆溶液初步混匀，然后在超声波振荡仪中振荡5min，使填料均匀分布于丙酮中。
[0040](2)制备出口柱塞
[0041]截取内径100 μ m，外径365 μ m的弹性石英毛细管4根，每一根长度为5cm，将毛
细管一端置于盛有直径110 μ m贯穿孔硅胶颗粒的离心管中，轻敲离心管底部使单颗贯穿孔硅胶颗粒压入毛细管一端作为出口柱塞。
[0042](3)固定相填充
[0043]将上述4根毛细管分别固定在离心填充装置中(此处所用离心管为15mL离心管)，向储液槽中注入120 μ L匀浆液，称重离心，设置转速为12000r/min，离心时间为15min
进行填充。
[0044](4)制备入口柱塞
[0045]离心完成后，取下填充好的毛细管，在其入口端各填入一颗贯穿孔硅胶颗粒作为入口柱塞。
[0046](5)扫描电镜(SEM)表征柱床结构
[0047]在上述制备的4根纳米填料毛细管色谱微柱上各截取一段5mm柱床固定于L型金属台上进行扫面电镜的表征，柱床形貌如图6。从图中可以看出，离心填充方法制备的纳米填料毛细管色谱微柱具有优良的柱床均一性。 [0048]实施例2:Si02iAu-S-C18纳米填料毛细管色谱富集小柱的制备
[0049]a S12OAu-S-C18核壳结构纳米填料的制备
[0050]首先，将一定量按照实施例1制备的S12纳米微球分散于1mLl: I甲醇与水的溶液中，配制90mL0.03M的SnCl2溶液与上述纳米粒子分散液混合，磁性搅拌下反应45min，离心水洗8次后分散于4mL水中；其次，将1.5mLlg/100mL氯金酸加入到溶有25mg K2CO3的10mL水中，至少暗反应24h，形成老化液。在50mL老化液中加入ImL S12OSn2+分散液，磁性搅拌下逐滴加入合适浓度的盐酸羟胺溶液至反应液为亮蓝色，反应8~1h后再陈化lh，水洗至少6次后50~70°C过夜烘干。最后，取适量S12OAu纳米微球溶于5ml无水乙醇中，配制一定量的20mM十八烷基硫醇溶液，按一定比例混合，磁性搅拌下反应24h即可获得S12OAu-S-C18 纳米填料。
[0051]b Si02iAu-S-C18纳米填料毛细管色谱微柱的制备及评价
[0052]Si02@Au-S_C18纳米填料毛细管富集小柱的填充方法类似于实施例1，所取毛细管长度为1cm，固定相填充过程中毛细管固定在1.5mL离心管上，制备好的富集小柱长度为4mm。小柱制备好后采用液相色谱模式进行富集效果的评价。
[0053]将醋酸生长抑素(购买自生工生物工程(上海)股份有限公司)和卵清蛋白(购买自Sigma)分别配制成浓度为5 μ g/mL及10 μ g/mL的溶液作为样品，经过12000r/min离心上样、12000r/min离心洗脱、氮吹浓缩等步骤后收集富集液在lmL/mindOminS1^~80%ACN梯度条件下进行高效液相色谱的分离，在214nm波长下进行紫外检测，色谱分离如图7和8所示。可以看出，经过Si02@Au-S-C18纳米填料毛细管富集小柱的浓缩后，醋酸生长抑素和卵清蛋白的色谱响应值均显著增强。
【权利要求】
1.一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置，其特征在于设有离心机和离心填充装置，所述离心填充装置设有可拆卸PEEK接头、PEEK接口、PTFE套管、毛细管及离心管；所述毛细管插入PTFE套管后固定于PEEK接口上；PEEK接头与PEEK接口拧紧以固定毛细管并固定于离心管上；离心管插入离心机的转子中。
2.如权利要求1所述一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置，其特征在于所述离心管上设有离心管盖。
3.如权利要求1所述一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置，其特征在于所述离心填充装置采用粒径为150?950nm的纳米微球作为色谱填料，离心填充装置紧密连接于固定毛细管微柱。
4.一种纳米填料毛细管色谱微柱的制备方法，采用如权利要求1所述一种纳米填料毛细管色谱微柱制备装置，其特征在于包括以下步骤: 1)制备匀浆液 取纳米粒子分散于丙酮中，浓度控制为I?50 μ g/μ L，匀浆溶液混匀后振荡，得匀浆液； 2)制备出口柱塞 截取一段弹性石英毛细管，将粒径尺寸略大于毛细管内径的单个贯穿孔硅球压入毛细管一端作为出口柱塞； 3)固定相填充 将带有出口柱塞的毛细管固定在离心填充装置中，在储液槽中注入匀浆液，称重离心，进行固定相填充； 4)制备入口柱塞 离心完成后，取下填充好的毛细管，在毛细管入口端填入一颗贯穿孔硅胶颗粒作为入口柱塞，即得纳米填料毛细管色谱微柱。
5.如权利要求4所述一种纳米填料毛细管色谱微柱的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述振荡是先手摇振荡使匀浆溶液初步混匀，然后在超声波振荡仪中振荡5?30min，使填料均匀分布于液体中。
【文档编号】G01N30/60GK104034833SQ201410310772
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】张博, 王林, 周拙恒, 刘娅 申请人:厦门大学