一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒，包括组织细胞分散酶、抗生素溶液、两性霉素溶液、EGTA-Trypsin溶液、含血清培养基DF10、无血清培养基Kertin-SFM、标本保存液、标本清洗液、凝胶包被培养瓶、细胞固定液、细胞分散酶、细胞过滤膜、中性红染色液和胶原凝胶制备试剂；该试剂盒的检测操作流程包括原代细胞培养、胶原凝胶胶滴内的培养和化疗药物敏感性的分析。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明试剂盒能最大程度的保护肿瘤细胞活性，缩短药敏检测时间，本发明试剂盒包含了肿瘤细胞原代培养与化疗药物检测所需的所有试剂，耗材都为一次性用品，减少了实验过程中细菌污染，使用方便。
【专利说明】一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及临床检测领域，具体是一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肿瘤化疗耐药是导致化疗失败的主要原因之一，如何制定个体化化疗方案提高化 疗疗效是临床亟待解决的难题。大量临床研究表明，肿瘤体外药物敏感性检测与临床疗效 存在一定的相关性，体外药敏检测能较好的指导临床用药，提高临床疗效。
[0003] 目前肿瘤药物敏感性检测方法有如下几种：软琼脂克隆形成实验（HTCA)、四唑蓝 比色法（MTT)、差别染色细胞毒检测方法（DiSC)以及三磷酸腺苷生物发光法。但是这些方 法均有不同程度的不足，限制了他们在临床的应用，目前临床上迫切需要切实可行的检测 方法进行药敏实验。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种保留肿瘤细胞活力及生物学活性、实用方便、减少细 菌污染的肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒，包括（1)组织细胞分散酶：胶原酶95?105mg， 溶于4. 5?5.5ml PBS溶液中，过滤除菌，4°C冷藏；（2)2X抗生素溶液：青霉素1.9? 2. lg，硫酸卡那霉素0. 9?1. lg，溶于18?22ml PBS中，过滤除菌，4°C冷藏；（3)两性霉 素溶液：两性霉素 B 24?26mg，溶于95?105ml 0. 9%氯化钠注射液中，过滤除菌，4°C冷 藏；（4)EGTA_Trypsin 溶液：EGTA 36 ?40mg，Trypsin 28 ?32mg，溶于 Hank' s 液中，室温 静置lh，过滤除菌，4°C冷藏；（5)含血清培养基DF10 :FBS 45?55ml，2X抗生素溶液，溶 于480?520ml DF培养基中，4°C冷藏；(6)无血清培养基Kertin-SFM，4°C冷藏；（7)标本 保存液：FBS 48?52ml，2X抗生素溶液4. 9?5. lml，两性霉素溶液4. 8?5. 2ml，溶于 480?520ml DF培养基中，分装于50ml离心管中，4°C冷藏；（8)标本清洗液：2 X抗生素溶 液4. 9?5. lml，两性霉素溶液4. 9?5. lml，溶于480?520ml生理盐水中，常温保存；（9) 凝胶包被培养瓶：鼠尾胶原凝胶包被的培养瓶常温保存备用；（10)细胞固定液：1〇%中性 福尔马林液；（11)细胞分散酶：〇. 2%胰蛋白酶，4°C冷藏；（12)细胞过滤膜：一次性过滤尼 龙膜250 μ m和300 μ m两种规格；（13)中性红染色液：4°C冷藏；（14)胶原凝胶制备试剂： 将鼠尾胶原凝胶溶液、10X 10F12液和缓冲液以8:1:1的比例按顺序充分混合均匀，4°C冷 藏备用。
[0006] 一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒的检测操作流程，具体步骤如下： (1)原代细胞培养：①于手术台上取得新鲜肿瘤标本，用含有抗生素的生理盐水冲洗数 遍后置于含有抗生素的保存液中；②超净台上用无菌器械将肿瘤标本上的坏死以及血块等 杂质剔除，再次用含有抗生素的生理盐水冲洗数遍，置于平皿中；③用无菌剪刀将标本剪碎 至ImmXImmX 1mm，呈米糊状；④将标本用不含血清的细胞培养液转移至离心管中，并加入 细胞分散酶，离心管置于35?36°C水浴中消化1?2h ;⑤组织消化呈匀浆状后，离心机以 1250?1350rpm的转速离心4?5min ;⑥去除上清，用EGTA-Trypsin液继续消化2?5min ; ⑦用含血清的细胞培养液终止消化，并用300 μ m尼龙膜过滤；⑧过滤后将分散的细胞再次 以1250?1350rpm的离心转速4?6min ;⑨去除上清，加入DF10含血清细胞培养液，充分 吹打；⑩将制备好的细胞悬液加入胶原凝胶包被的培养瓶中培养，并置于37°C且含5%C0 2 的培养箱培养24?48h ; (2) 胶原凝胶胶滴内的培养：①显微镜观察肿瘤细胞大量贴壁后，弃去培养瓶中液体， 用0. 2%胰蛋白酶消化瓶内细胞，并轻轻吹打，以除血细胞、死细胞及杂质；②显微镜观察大 量贴壁细胞自瓶壁脱落后用含血清细胞培养液终止胰蛋白酶消化，并冲洗培养瓶数遍，将 含有活细胞的液体回收至离心管中；③离心管用1250?1350rpm的转速离心4?6min ;④ 去除上清，用微量移液器将细胞吹散，进行细胞计数，调整至最终的细胞浓度为1X 1〇5个/ ml ;⑤于冰上配置胶原混合液，将A液（鼠尾胶原凝胶溶液)、B液（10XF12液)和C液(缓冲 液）以8:1:1的比例按照顺序进行充分混匀；⑥用DF10细胞培养液终止消化，并用250 μ m 尼龙膜过滤；⑦将细胞液以1250?1350rpm的转速离心4?6min，再按照细胞分散液：胶原 混合液=1:10的比例制成含有细胞的胶原混合液；⑧在六孔板上按照每孔3滴，每滴30ul (最终细胞数为3X 103每滴）进行种板；⑨将接种好的六孔板置于37°C，5%C02培养箱中培 养30min待胶原凝固；⑩胶原胶滴凝固后，在每个孔中加入2?4ml含血清的细胞培养液， 培养箱培养23?25h ;在每个孔中加入25?35ul配置好的化疗药物，并设置对照，继续于 37°C，5%C02培养箱中培养23?25h ;去除六孔板中的细胞培养液，每孔加入4ml不含血清 细胞培养液，震荡摇匀，置于36?38°C，5%C02培养箱中14?16min，并重复2遍充分洗去 化疗药物；每孔加入4ml Kertin-SFM无血清细胞培养液，于培养箱中培养5?7天； (3) 化疗药物敏感性的分析：①在六孔板的每孔中加入35?45ul中性红染液，充分摇 匀，置于培养箱中培养1?2h ;②去除孔中液体，每孔加入3?5ml PBS液，室温震荡后去 除PBS ;③每孔加入10%中性福尔马林液，室温静置40?50min ;④移除10%中性福尔马林 液，将培养板置于清水中8?12min ;⑤室温风干后用Image Pro Plus软件对每个胶原凝 胶胶滴进行染色比色分析，并通过细胞形态学以及着色程度的差异区别肿瘤细胞以及非肿 瘤细胞。
[0007] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 1、试剂盒能最大程度的保护肿瘤细胞活性及肿瘤细胞生物学特性，缩短药敏检测时 间。
[0008] 2、试剂盒包含了肿瘤细胞原代培养与化疗药物检测所需的所有试剂，耗材都为一 次性用品，减少了实验过程中细菌污染，使用方便。
【具体实施方式】
[0009] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0010] 本发明实施例中，一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒，包括 (1) 组织细胞分散酶：胶原酶95?105mg，溶于4. 5?5. 5ml PBS溶液中，过滤除菌， 4°C冷藏，特殊的组织酶配方能快速的分散癌细胞团快，并最大限度的减少酶消化过程中对 细胞的毒性； (2) 2X抗生素溶液：青霉素1. 9?2. lg，硫酸卡那霉素0. 9?1. lg，溶于18?22ml PBS中，过滤除菌，4°C冷藏； (3) 两性霉素溶液：两性霉素 B 24?26mg，溶于95?105ml 0. 9%氯化钠注射液中， 过滤除菌，4°C冷藏； (4) EGTA_Trypsin 溶液：EGTA 36 ?40mg，Trypsin 28 ?32mg，溶于 Hank's 液中，室温 静置lh，过滤除菌，4°C冷藏； (5) 含血清培养基DF10 :FBS 45?55ml，2 X抗生素溶液，溶于480?520ml DF培养 基中，4°C冷藏，肿瘤细胞专用培养基，能促进肿瘤细胞生长，保持良好细胞活力； (6) 无血清培养基Kertin-SFM，4°C冷藏，无血清培养基能保证肿瘤细胞的良好增殖， 同时抑制成纤维细胞增殖； (7) 标本保存液：FBS 48?52ml，2 X抗生素溶液4. 9?5. lml，两性霉素溶液4. 8? 5. 2ml，溶于480?520ml DF培养基中，分装于50ml离心管中，4°C冷藏； (8) 标本清洗液：2 X抗生素溶液4. 9?5. lml，两性霉素溶液4. 9?5. lml，溶于480? 520ml生理盐水中，常温保存； (9) 凝胶包被培养瓶：鼠尾胶原凝胶包被的培养瓶常温保存备用，凝胶包被培养瓶培 养能促进肿瘤细胞贴壁，去除血细胞、死细胞及杂质细胞干扰； (10) 细胞固定液：1〇%中性福尔马林液，将胶滴中的细胞进行固定； (11) 细胞分散酶：〇. 2%胰蛋白酶，4°C冷藏，能快速、有效的消化贴壁的细胞； (12) 细胞过滤膜：一次性过滤尼龙膜250 μ m和300 μ m两种规格，能有效除去未消化 的组织块； (13) 中性红染色液：4°C冷藏，利用三维培养的肿瘤细胞与正常细胞的中性红染色特点 不同，便于在定量时排除成纤维细胞的干扰； (14) 胶原凝胶制备试剂：将鼠尾胶原凝胶溶液、10X 10F12液和缓冲液以8:1:1的比例 按顺序充分混合均匀，4°C冷藏备用，胶原凝胶作为细胞外基质，能模拟癌细胞在体内的生 长环境，癌细胞在胶原凝胶中立体生长，呈现与体内相似的增殖形态与功能特质。
[0011] 一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒的检测操作流程，具体步骤如下： (1) 原代细胞培养：①于手术台上取得新鲜肿瘤标本，用含有抗生素的生理盐水冲洗 数遍后置于含有抗生素的保存液中；②超净台上用无菌器械将肿瘤标本上的坏死以及血块 等杂质剔除，再次用含有抗生素的生理盐水冲洗数遍，置于平皿中；③用无菌剪刀将标本剪 碎至ImmXImmX 1mm，呈米糊状；④将标本用不含血清的细胞培养液转移至离心管中，并加 入细胞分散酶，离心管置于35°C水浴中消化2h ;⑤组织消化呈匀浆状后，离心机以1300rpm 的转速离心5min ;⑥去除上清，用EGTA-Trypsin液继续消化4min ;⑦用含血清的细胞培养 液终止消化，并用300 μ m尼龙膜过滤；⑧过滤后将分散的细胞再次以1300rpm的离心转速 5min ;⑨去除上清，加入DF10含血清细胞培养液，充分吹打；⑩将制备好的细胞悬液加入胶 原凝胶包被的培养瓶中培养，并置于37°C且含5%C0 2的培养箱培养36h ; (2) 胶原凝胶胶滴内的培养：①显微镜观察肿瘤细胞大量贴壁后，弃去培养瓶中液体，
【权利要求】
1. 一种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，包括（1)组织细胞分散酶：胶原 酶95?105mg，溶于4. 5?5. 5ml PBS溶液中，过滤除菌，4°C冷藏；（2) 2 X抗生素溶液：青 霉素1. 9?2. lg，硫酸卡那霉素0. 9?1. lg，溶于18?22ml PBS中，过滤除菌，4°C冷藏； (3)两性霉素溶液：两性霉素 B 24?26mg，溶于95?105ml 0. 9 %氯化钠注射液中，过滤除 菌，4°C冷藏；（4) EGTA-Trypsin 溶液：EGTA 36 ?40mg，Trypsin 28 ?32mg，溶于 Hank's 液 中，室温静置lh，过滤除菌，4°C冷藏；（5)含血清培养基DF10 :FBS 45?55ml，2X抗生素溶 液，溶于480?520ml DF培养基中，4°C冷藏；（6)无血清培养基Kertin-SFM，4°C冷藏；（7) 标本保存液：FBS 48?52ml，2 X抗生素溶液4. 9?5. lml，两性霉素溶液4. 8?5. 2ml，溶 于480?520ml DF培养基中，分装于50ml离心管中，4°C冷藏；（8)标本清洗液：2 X抗生素 溶液4. 9?5. lml，两性霉素溶液4. 9?5. lml，溶于480?520ml生理盐水中，常温保存； (9)凝胶包被培养瓶：鼠尾胶原凝胶包被的培养瓶常温保存备用；（10)细胞固定液：10%中 性福尔马林液；（11)细胞分散酶：〇. 2%胰蛋白酶，4°C冷藏；（12)细胞过滤膜：一次性过滤 尼龙膜250 μ m和300 μ m两种规格；（13)中性红染色液：4°C冷藏；（14)胶原凝胶制备试 齐U :将鼠尾胶原凝胶溶液、l〇X 10F12液和缓冲液以8:1:1的比例按顺序充分混合均匀，4°C 冷藏备用。
2. -种肿瘤化疗药物敏感性检测试剂盒的检测操作流程，其特征在于，具体步骤如 下： (1) 原代细胞培养：①于手术台上取得新鲜肿瘤标本，用含有抗生素的生理盐水冲洗数 遍后置于含有抗生素的保存液中；②超净台上用无菌器械将肿瘤标本上的坏死以及血块等 杂质剔除，再次用含有抗生素的生理盐水冲洗数遍，置于平皿中；③用无菌剪刀将标本剪碎 至ImmXImmX 1mm，呈米糊状；④将标本用不含血清的细胞培养液转移至离心管中，并加入 细胞分散酶，离心管置于35?36°C水浴中消化1?2h ;⑤组织消化呈匀浆状后，离心机以 1250?1350rpm的转速离心4?5min ;⑥去除上清，用EGTA-Trypsin液继续消化2?5min ; ⑦用含血清的细胞培养液终止消化，并用300 μ m尼龙膜过滤；⑧过滤后将分散的细胞再次 以1250?1350rpm的离心转速4?6min ;⑨去除上清，加入DF10含血清细胞培养液，充分 吹打；⑩将制备好的细胞悬液加入胶原凝胶包被的培养瓶中培养，并置于37°C且含5%C0 2 的培养箱培养24?48h ; (2) 胶原凝胶胶滴内的培养：①显微镜观察肿瘤细胞大量贴壁后，弃去培养瓶中液体， 用0. 2%胰蛋白酶消化瓶内细胞，并轻轻吹打，以除血细胞、死细胞及杂质；②显微镜观察大 量贴壁细胞自瓶壁脱落后用含血清细胞培养液终止胰蛋白酶消化，并冲洗培养瓶数遍，将 含有活细胞的液体回收至离心管中；③离心管用1250?1350rpm的转速离心4?6min ;④ 去除上清，用微量移液器将细胞吹散，进行细胞计数，调整至最终的细胞浓度为1X 1〇5个/ ml ;⑤于冰上配置胶原混合液，将A液（鼠尾胶原凝胶溶液)、B液（10XF12液)和C液(缓冲 液）以8:1:1的比例按照顺序进行充分混匀；⑥用DF10细胞培养液终止消化，并用250 μ m 尼龙膜过滤；⑦将细胞液以1250?1350rpm的转速离心4?6min，再按照细胞分散液：胶原 混合液=1:10的比例制成含有细胞的胶原混合液；⑧在六孔板上按照每孔3滴，每滴30ul (最终细胞数为3 X 103每滴)进行种板；⑨将接种好的六孔板置于37°C，5%C02培养箱中培养 30min待胶原凝固；⑩胶原胶滴凝固后，在每个孔中加入2?4ml含血清的细胞培养液，培 养箱培养23?25h ;在每个孔中加入25?35ul配置好的化疗药物，并设置对照，继续于 37°C，5%C02培养箱中培养23?25h ;去除六孔板中的细胞培养液，每孔加入4ml不含血 清细胞培养液，震荡摇匀，置于36?38°C，5%C02培养箱中14?16min，并重复2遍充分洗 去化疗药物；每孔加入4ml Kertin-SFM无血清细胞培养液，于培养箱中培养5?7天； (3)化疗药物敏感性的分析：①在六孔板的每孔中加入35?45ul中性红染液，充分摇 匀，置于培养箱中培养1?2h ;②去除孔中液体，每孔加入3?5ml PBS液，室温震荡后去 除PBS ;③每孔加入10%中性福尔马林液，室温静置40?50min ;④移除10%中性福尔马林 液，将培养板置于清水中8?12min ;⑤室温风干后用Image Pro Plus软件对每个胶原凝 胶胶滴进行染色比色分析，并通过细胞形态学以及着色程度的差异区别肿瘤细胞以及非肿 瘤细胞。
【文档编号】G01N21/78GK104111254SQ201410323075
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】李维 申请人:李维