一种草鱼白细胞介素1β酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，公开了一种草鱼白细胞介素1β(IL-1β)竞争抑制酶联免疫检测试剂盒，它包含如下组分：(1)酶标板；(2)辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素1β多克隆抗体浓缩液；(3)样品稀释液；(4)浓缩洗涤液；(5)浓缩包被液；(6)显色底物；(7)终止液；(8)草鱼白细胞介素1β标准品。本发明试剂盒具有操作简单，重现性、准确性和特异性良好，检测线性范围广的特点。
【专利说明】-种草鱼白细胞介轰IP酶联免疫检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种草鱼白细胞介素1目竞争抑制酶联免疫 检测试剂盒。
【背景技术】
[000引 白细胞介素1目（interle址in-1目，比-1目）是一种重要的炎症介质和免疫因子， 在机体的免疫应答中发挥着广泛的调节作用，如激活T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的活 性，刺激巨瞻细胞分泌细胞因子和前列腺素等炎症介质，此外还可充当神经系统和免疫系 统间的传导信号，W监视生理失调和病原入侵。作为潜在的炎症介质和共刺激信号分子， 白细胞介素1目可W促进前列腺素（PG)的合成和诱导发热，提高巨瞻细胞的吞瞻活性， 并可调节其它细胞因子的表达。
[0003] 草鱼（Cteno地aryngodon idellus)属缠形目缠科雅罗鱼亚科草鱼属，是中国淡水 养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂 觸病、赤皮病和肠炎病等，加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使 病害日益加剧，因此研究草鱼免疫系统的各类免疫反应及其机制十分必要。白细胞介素1目 在草鱼免疫反应中具有广泛生物学活性，对免疫系统的调控发挥着必不可少的作用。但是， 目前草鱼白细胞介素1目的分泌检测方法并没建立，主要因为草鱼白细胞介素1目与哺乳 动物、两栖动物的白细胞介素1目分子结构差异较大，不能用其他物种的白细胞介素1目抗 体来识别草鱼鱼白细胞介素1目。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种草鱼白细胞介素1目酶联免疫检测试剂盒。 本发明还提供了该试剂盒的使用方法和用途。
[0005] 本发明利用重组表达的草鱼白细胞介素1目作为抗原包被酶标板W及免疫健康 白兔制备多克隆抗体，再用辣根过氧化物酶（HR巧标记该多克隆抗体，然后加入经赔育后 的待测样品和HRP标记的多克隆抗体混合液，让酶标板上重组草鱼白细胞介素1目与样品 中的草鱼白细胞介素1目竞争结合抗体，通计算抑制率来检测样品中草鱼白细胞介素1目 含量。
[0006] 本发明提供了一种草鱼白细胞介素1目酶联免疫检测试剂盒，它包含如下组分： (1) 96孔可拆卸的酶标板；（2)辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素1目多克隆抗体浓缩 液；（3)样品稀释液；(4)浓缩洗涂液；（5)浓缩包被液；(6)显色物底物；(7)终止液；(8)草 鱼白细胞介素1目标准品。
[0007] 其中，上述草鱼白细胞介素1目多克隆抗体是W重组草鱼白细胞介素1目蛋白为 抗原，免疫新西兰大白兔并利用多克隆抗体制备与纯化技术获得抗草鱼白细胞介素1目多 克隆抗体，该抗体可与草鱼白细胞介素1目特异的结合。
[0008] 进一步地，上述重组草鱼白细胞介素1目蛋白是通过将草鱼IL-I目基因序列克 隆到原核表达载体祀T-30a(+)中，构建重组原核表达载体，并将此载体转化至大肠杆菌 BL2UDE3)中进行原核表达所得（周红、杨潇、汪新艳，一种草鱼白细胞介素1目基因和蛋白 及其重组表达方法，中国专利申请号：201010221742. 9)。
[0009] 其中，上述辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素1目多克隆抗体为采用马 来醜亚胺活化的辣根过氧化物酶标记试剂盒（购自上海西宝生物科技有限公司，货号： AZK0012A)标记的草鱼白细胞介素1目多克隆抗体。
[0010] 优选地，上述多克隆抗体的浓度为5mg/ml。
[0011] 其中，上述样品稀释液为含0. 2%牛血清白蛋白炬SA)的洗涂液，每升稀释液中含 KH2PO4O. 2g，化2册〇42. 9g，化C18. Og, BSA2. Og,吐温-200. 5ml，PH7. 4 ;
[0012] 其中，上述浓缩洗涂液为含0. 5%吐温-20的0. 2M磯酸盐缓冲液，每升浓缩洗涂液 中含皿2口〇42. Og,化2册〇429. Og, NaClSO. Og,吐温"2〇5. Oml, PHL 4 ;
[001引其中，上述浓缩包被液为0. 5M的碳酸盐缓冲液，每升浓缩包被液中含化CO3I5. 9g， NaHCCyg. 3g，P册.6。
[0014] 其中，显色物底物TMB为可溶型单组分TMB底物溶液（购自天根生化科技有限公 司，货号：PA107-02)。
[0015] 其中，上述终止液为2M硫酸溶液。
[0016] 其中，上述草鱼白细胞介素1目标准品为按Img每管分装的重组草鱼白细胞介素 1目蛋白。
[0017] 本发明还提供了上述试剂盒的使用方法，它包括如步骤：
[0018] (1)包被；将浓缩包被液稀释10倍即为包被液，W包被液将重组草鱼白细胞介素 1目蛋白稀释至2 y g/mU根据待检样品数量，按100 y 1每孔加入酶标板孔中，4C赔育过夜 后甩干孔内液体，每孔加入洗涂液300 y 1，洗涂3次，每次3分钟。
[0019] (2)封闭；将浓缩洗涂液稀释10倍即为洗涂液，用洗涂液溶解5%脱脂奶粉、 0. 3% BSA即为封闭液，每孔加入封闭液300 yl，室温封闭两小时后，甩干，每孔加入洗涂液 300 U 1，洗涂3次，每次3分钟。
[0020] (3)酶标抗体与抗原的赔育：用样品稀释液将重组草鱼白细胞介素1目蛋白分别 稀释到Ing/血、2. Sng/血、5ng/血、7. Sng/血、IOng/血、15ng/mL作为标准品，样品稀释液作 为阴性对照，分别取标准品50 y 1、待测样品50 y 1、样品稀释液50 y 1与50 y 1适当稀释的 辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素1目多克隆抗体混匀后室温赔育2小时；待酶标板 封闭、洗涂后，加入上述抗原抗体混合液，室温赔育2小时。
[0021] (4)显色；甩干孔内液体，每孔加入洗涂液300 y 1，洗涂5次，每次3分钟。洗涂 后甩干孔内液体，然后每孔加入IOOy 1显色底物TMB，37°C反应30分钟后每孔加入50 y 1 2MH2SO4终止反应。
[0022] (5)读数、结果处理；采用酶标仪在450nm波长下读取吸光度值，根据所得数据计 算样品抑制率，样品抑制率％ =(阴性对照吸光值-标准品或待测样品吸光值）/阴性样 品吸光值X 100 %，最后W标准品抑制率为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标制作标准曲 线，通过标准曲线求出待测样品中草鱼白细胞介素1目的浓度。
[0023] 本发明进一步提供了上述试剂盒在制备草鱼免疫调节功能检测试剂中的用途。
[0024] 本发明W重组草鱼白细胞介素1目蛋白作为抗原，建立了检测草鱼白细胞介素 I目的化ISA方法，为检测草鱼血清或细胞培养上清中白细胞介素I目的蛋白表达水平提供 了快速高效的检测手段，该法稳定可靠，且成本较低。
【专利附图】
【附图说明】
[002引图1草鱼白细胞介素1目ELISA检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0026] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027] 实施例1本发明试剂盒的组成及其使用方法
[0028] 1.本发明试剂盒的组成
[0029] (1)96孔可拆卸酶标板；
[0030] (2)辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素1目多克隆抗体浓缩液；
[0031] (3)样品稀释液；含0. 2%牛血清白蛋白炬SA)的洗涂缓冲液，每升稀释缓冲液中 含 KH2PO4O. 2g，化2册〇42. 9g，化C18. Og, BSA2. Og,吐温-200. 5ml，PH7. 4 ;
[0032] (4)浓缩洗涂液；含0. 5 %吐温-20的0. 2M磯酸盐缓冲液，每升浓缩洗涂液中含 KH2PO42. Og,化2册〇429. Og, NaClSO. Og,吐温-205. Oml, PH7. 4 ;
[0033] 妨浓缩包被液；0. 5M的碳酸盐缓冲液，每升浓缩包被液中含化CO3I5. 9g， NaHCCyg. 3g，P册.6 ;
[0034] (6)显色底物；可溶型单组分TMB底物溶液；
[00对 （7)终止液；2M硫酸溶液；
[0036] (8)草鱼白细胞介素1目标准品：按Img每管分装的重组草鱼白细胞介素1目蛋 白。商品化的试剂盒组成见表1 ;
[0037] 表1本发明试剂盒的主要组分
[0038]
【权利要求】
1. 一种草鱼白细胞介素1β酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：它包含如下组分： (1) 酶标板； (2) 辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素1β多克隆抗体浓缩液； (3) 样品稀释液； (4) 浓缩洗涤液； (5) 浓缩包被液； (6) 显色底物； (7) 终止液； (8) 草鱼白细胞介素1β标准品。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述草鱼白细胞介素1β多克隆抗体 由如下方法制备： (1) 以重组草鱼白细胞介素1β蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔； (2) 利用多克隆抗体制备与纯化技术获得抗草鱼白细胞介素1β多克隆抗体。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的草鱼白细 胞介素1β多克隆抗体是由马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素1β 多克隆抗体。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述多克隆抗体的浓度为5mg/ml。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于： 所述样品稀释液为含〇. 2%牛血清白蛋白的洗涤液，每升稀释液中含KH2P040. 2g， Na2HP042. 9g，NaC18. 0g，牛血清白蛋白 2. 0g，吐温-200. 5ml，PH7. 4 ; 所述浓缩洗涤液为含〇. 5%吐温-20的0. 2M磷酸盐缓冲液，每升浓缩洗涤液中含 KH2P042. 0g，Na2HP0429. 0g，NaC180. 0g，吐温-205. 0ml，PH7. 4 ; 所述浓缩包被液为〇. 5M的碳酸盐缓冲液，每升浓缩包被液中含NaC0315.9g， NaHC0329. 3g, PH9. 6 ； 所述显色物底物为可溶型单组分TMB底物溶液； 所述终止液为2M硫酸溶液； 所述草鱼白细胞介素1β标准品为按lmg每管分装的重组草鱼白细胞介素1β蛋白。
6. 权利要求1-5任意一项所述试剂盒的使用方法，其特征在于：它包含如下步骤： (1) 包被：将浓缩包被液稀释10倍即为包被液，以包被液将重组草鱼白细胞介素1 β 蛋白稀释至2μ g/mL，根据待检样品数量，按?οομ 1每孔加入酶标板孔中，4°C孵育过夜后 甩干孔内液体，每孔加入洗涤液300 μ 1，洗涤3次，每次3分钟。 (2) 封闭：将浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液，用洗涤液溶解5%脱脂奶粉、0. 3%牛血 清白蛋白即为封闭液，每孔加入封闭液300 μ 1，室温封闭两小时后，甩干，每孔加入洗涤液 300 μ 1，洗涤3次，每次3分钟。 (3) 酶标抗体与抗原的孵育：用样品稀释液将重组草鱼白细胞介素1β蛋白分别稀释 至lj lng/mL、2. 5ng/mL、5ng/mL、7. 5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL 作为标准品，样品稀释液作为阴 性对照；分别取各浓度的标准品50 μ 1、待测样品50 μ 1、样品稀释液50 μ 1与50 μ 1适当稀 释的辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素1β多克隆抗体混匀后室温孵育2小时；待酶 标板封闭、洗漆后，加入上述抗原抗体混合液，室温孵育2小时。 (4) 显色：甩干孔内液体，每孔加入洗涤液300 μ 1，洗涤5次，每次3分钟；洗涤后 甩干孔内液体，然后每孔加入100 μ 1显色底物TMB，37°C反应30分钟后每孔加入50 μ 1 2MH2S04终止反应。 (5) 读数、结果处理：采用酶标仪在450nm波长下读取吸光度值；根据所得数据计算样 品抑制率，样品抑制率％ =(阴性对照吸光值-标准品或待测样品吸光值）/阴性样品吸光 值X 100% ;最后以标准品抑制率为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标制作标准曲线，通 过标准曲线求出待测样品中草鱼白细胞介素1β的浓度。
7.权利要求1-5任意一项所述的试剂盒在制备草鱼免疫调节功能检测试剂中的用途。
【文档编号】G01N33/68GK104237529SQ201410327933
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】周红, 杨潇 申请人:电子科技大学