快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸及其检测方法
【专利摘要】一种快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸及其检测方法，样本垫材质为玻璃纤维膜，金结合物垫含有胶体金抗N端PCT的抗体交联物；硝酸纤维素膜上的检测线为包被有固相化的另外一个配对抗PCT降钙素区域的抗体的T线，控制线为包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的C线。用滴定管加100微升样本到样本垫上；平放静置2-30分钟；2分钟以上，可以进行定性或半定量检测，对比试剂盒附带的比色卡，估计降钙素原含量范围；或者等待30分钟，使用专用的免疫层析定量读数仪，进行定量检测降钙素原浓度。其检测灵敏度达到0.1ng/ml水平；达到国际先进水平。成本低、使用方便、灵敏度高、检测时间短。
【专利说明】快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及检测人降钙素原的快速检测试纸及胶体金免疫层 析测试法，具体地说是一种应用双抗体夹心法原理的胶体金免疫层析法实现对人降钙素原 进行定量检测的方法。
【背景技术】
[0002] 目前临床诊断应用最广泛的是采用进口试剂检测血清和血浆中的降钙素原 (PCT)，包括化学发光免疫法（德国罗氏诊断试剂公司）、酶化学发光法（法国生物梅里埃公 司）和胶体金免疫层析技术（德国Brahms公司）。化学发光免疫法采用抗降钙素原（PCT) 抗体作为包被抗体，钌（罗氏）或酶（生物梅里埃）标记的抗pct抗体为示踪抗体。该检测 方法建立后，广泛用于发热病人是否由于细菌感染的筛查，从而让临床医生制定医学治疗 措施，包括抗生素治疗。治疗启动后，降钙素原（PCT)的检测有助于判断治疗效果。该方 法灵敏度和特异性高，然而，这类进口试剂盒检测操作复杂，费时，不宜作为献血员的筛查， 只能用作确诊试验。同时，这类进口试剂盒测试方法需要特殊设备、操作人员需要专门的操 作技能、一次测试从采样到孵育、洗板、显色需要很长的时间，浪费大量人力物力，难以在缺 少设备的边远山区、基层医院、诊所开展。
【发明内容】
[0003] 为解决以上问题，方便测试人全血、血清或血浆中降钙素原（PCT)水平的需求，本 发明提供了一种简单、可靠、成本低廉、灵敏度高的快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析 试纸及其检测方法；本检测方法采用双抗体夹心法，其抗体的选择不同于市场上现有试剂 盒的设计，即胶体金标记的抗体采用抗N端PCT的单克隆抗体；而包被用的抗体则采用抗 PCT降钙素区域的单克隆抗体；
[0004] 为了达到本发明的目的，本发明技术方案如下：一种快速检测人血降钙素原胶体 金免疫层析试纸，包括长方体状盒体、位于盒体内底部的长条形黏贴支架，在黏贴支架上 方从左到右依次黏贴有样本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；在硝酸纤维素膜上中 间部位从左到右设有一道检测线和一道控制线；其特点是：所述的样本垫材质为玻璃纤维 膜，经过主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理过夜；所述的金结合物垫是由 经过含Tris、S-17、牛血清白蛋白等的专用处理液处理过的玻璃纤维膜构成,含有胶体金抗 N端PCT单克隆抗体交联物；所述的硝酸纤维素膜上的检测线为包被有固相化的配对的抗 PCT降钙素区域的单克隆抗体的T线；所述的硝酸纤维素膜上的控制线为包被有羊抗鼠IgG 多克隆抗体的C线。
[0005] -种快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析检测方法，其特点是：被检测样本为 血液，包括人全血、血清或血浆，采用上述快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸，检 测步骤如下：1)用加样枪加 l〇〇ul或用滴定管加3滴血液样本到样本垫上；2)平放静置 2-30分钟；3) 2分钟后，进行定性或半定量检测，对比试剂盒附带的比色卡，估计人全血、血 清或血浆中降钙素原含量范围；4)或等待30分钟，使用专用的免疫层析定量读数仪，进行 定量检测人全血、血清或血浆中降钙素原的浓度。
[0006] 本发明运用胶体金标记鼠单克隆抗N端PCT单克隆抗体，以双抗体夹心法这一技 术来实现对人全血、血清或血浆中降钙素原（PCT)的定量检测。该方法用于测定人全血、 血清或血浆中降钙素原（PCT)水平。正常人全血、血清或血浆中降钙素原（PCT)水平低于 0. 05纳克/晕升。
[0007] 本发明采用双抗原夹心法和胶体金免疫层析技术，快速定量检测人全血、血清或 血浆中的一种或同时几种因子、抗原、蛋白，可用于炎症等感染类疾病的辅助诊断。本发明 成本低、操作简便、快速，操作无须大型专门仪器和场所，对操作人员也没有很高要求，且分 析结果清楚，易于判断，不受时间和地点限制、灵敏度高、检测时间短，可以快速检测人全 血、血清或血浆中降钙素原（PCT)的浓度，非常适合于在缺少设备的边远山区、基层医院、 诊所开展并能满足家庭或个人在诊断、保健、体检等方面的运用，甚至可以在床边进行；结 果可直观判断，适合处理个体和批量标本，一般人员按照说明书均可正确操作，并可最大限 度地避免实验过程中各种因素对结果的影响以及减轻操作人员的劳动强度；其检测灵敏度 达到0. lng/ml水平。操作简单便捷、检测速度快、节省人力物力为特点，正好弥补了化学发 光免疫法的这一不便，使得临床检验甚至可以在床边进行，只需简单仪器、设备及不需要复 杂的样本处理过程，结果立等可取，真正做到了床边检验（P0CT)。并可最大限度地避免实验 过程中各种因素对结果的影响以及减轻操作人员的劳动强度。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1是本发明快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸的结构示意图。
[0009] 图2是本发明的0. 5-10纳克/毫升降钙素原（PCT)水平的比色卡的标准测试颜 色。根据颜色深浅判断所测相应蛋白的含量范围。
【具体实施方式】
[0010] 从图1、图2可见，本发明的快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸，包括长 方体状盒体、位于盒体内底部的长条形黏贴支架，在黏贴支架上方从左到右依次黏贴有样 本垫、金结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；在硝酸纤维素膜上中间部位从左到右设有一道 检测线和一道控制线；所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过主要含Tris、酪蛋白钠盐、 PVP-10的处理液进行处理过夜；所述的金结合物垫是由经过含Tris、S-17、牛血清白蛋白 等的专用处理液处理过的玻璃纤维膜构成，含有胶体金抗N端PCT单克隆抗体交联物；所述 的硝酸纤维素膜上的检测线为包被有固相化的配对的抗PCT降钙素区域的单克隆抗体的T 线；所述的硝酸纤维素膜上的控制线为包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的C线。
[0011] 本发明的快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析检测方法，被检测样本为血液， 包括人全血、血清或血浆，采用上述快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸，检测步骤 如下：1)用加样枪加 l〇〇ul或用滴定管加3滴血液样本到样本垫上；2)平放静置2-30分 钟；3) 2分钟后，进行定性或半定量检测，对比试剂盒附带的比色卡，估计人全血、血清或血 浆中降钙素原含量范围；4)或等待30分钟，使用专用的免疫层析定量读数仪，进行定量检 测人全血、血清或血浆中降钙素原的浓度。
[0012] 当将样本滴入到试纸样本垫中，样本通过样本垫到达金结合物垫，样本中的PCT 可以结合特异的金标记抗N端PCT抗体，该抗原抗体复合物向着检测T线区和控制C线区 迁移，PCT-金标记抗体在T线区与配对抗体结合而产生酒红色颜色。剩余金标记抗体继续 向右前移，与固定在控制C线区的羊抗鼠抗体反应而形成第二条酒红色条带；根据样本中 降钙素原（PCT)浓度，T线颜色从白色到红色不等。颜色越深表明样本中降钙素原（PCT)含 量越多。图2是比色卡的〈0. 5ng/ml，正常、2ng/ml和10ng/ml降钙素原（PCT)的标准测试 颜色。
[0013] 胶体金标记的鼠抗人N端PCT单克隆抗体能特异地识别和捕获待检样本中的降钙 素原（PCT)，然后通过毛细作用移动到达检测区。在那里，已经捕获样本中PCT的胶体金-抗 体再捕获检测T线区中的抗PCT抗体，因此在检测区形成胶体金酒红色条带的颜色会深。如 果样本中降钙素原（PCT)含量少，到达检测T线区的裸露胶体金-抗体就会少，它们可以结 合位于检测T区的抗降钙素原（PCT)抗体就少，因此在检测T线区形成胶体金酒红色条带 的颜色越浅，反映样本中降钙素原（PCT)含量就越少；反之，在检测T线区形成胶体金酒红 色条带的颜色越深，反映样本中降钙素原（PCT)含量就越多。这就是采用夹心法原理的胶 体金免疫层析检测方法。
[0014] 实施例
[0015] 一、优化鼠抗人N端降钙素原（PCT)单克隆抗体胶体金结合
[0016] 为了达到检测降钙素原（PCT)的目的，我们制作了 3株单克隆抗降钙素原（PCT) 抗体。用ELISA测试了它的敏感性和特异性。这3株单克隆抗体识别降钙素原（PCT)的不 同抗原决定簇：N端PCT、降钙素区域、抗钙素区域。因为每个决定簇的电荷和疏水性是不同 的，与特异抗体的相互作用受不同因素的影响，如PH，离子强度和其他因素的存在，如化学 物质和蛋白等等。
[0017] 抗体与胶体金的交联（结合）。抗体与胶体金的结合主要取决于独立但相关的因 素三个：1)带负电荷的胶体金与带正电的蛋白质存在离子吸引力；2)抗体和胶体金表面之 间的疏水亲和力；3)蛋白质的氨基酸与胶体金可能的电子和硫原子亲和力。每个抗体的亲 和特征受这三个因素的影响，因此，每个抗体与胶体金的亲和结合会有所不同。我们调整了 pH值和胶体金的大小来优化抗体结合条件，认为应用25nm胶体金粒子可以达到最佳状态。 为达到这个目标，我们事先进行了滴定，最后交联，并纯化了该交联抗体。交联抗体最好在 蛋白质的等电点附近进行。不同pH值下（pH，7,8,9，10,等等）可用于鉴定蛋白质的等电 点。胶体金交联的抗体可存放直到下一步使用。
[0018] 二、组装并优化降钙素原（PCT)快速检测试纸
[0019] 本降钙素原（PCT)快速检测试纸的基本结构如图1所示。当试纸条浸入标本，如血 液，该样本可移动通过样本垫到达胶体金结合垫。任何标本中降钙素原（PCT)会特异性地 结合金标记抗体，通过毛细管作用迁移到检测T线区和控制C线区。根据样本中不同的降 钙素原（PCT)浓度，T线的颜色可从白色到酒红色变化。交联胶体金-PCT复合物将与在T 线的固定化抗降钙素原（PCT)抗体结合，而形成酒红色条带。T线的颜色反映样本中降钙素 原（PCT)的浓度，因此，样本中降钙素原（PCT)含量可以通过比较测试T线的颜色来确定。
[0020] 半定量检测：为达到这一个目的，我们设计了标准比色卡（见图2)。将T线条带 与比色卡比较，根据不同的颜色判断降钙素原（PCT)的浓度范围（见图2)。标准比色卡有 不同色度代表不同的降钙素原（PCT)浓度：〈0. 5纳克/毫升，正常；2纳克/毫升和10纳克 /毫升三档，可以用于判断被检样本中降钙素原（PCT)浓度范围：〈0. 5纳克/毫升，正常； 〈0.5?2纳克/毫升，2?10纳克/毫升，及大于10纳克/毫升。正常人的血液PCT水平 是〈0.05纳克/毫升。
[0021] 我们制作的快速检测试剂盒包括试纸条，由以下几个部分（见图1)组成：样本垫， 金结合物垫，硝酸纤维素膜（NC膜），吸水垫，黏贴支架，外盒。
[0022] 1)样本垫，材质为玻璃纤维膜，经过样本垫处理液（主要含Tris、酪蛋白钠盐、 PVP-10)处理过夜，样本垫用于去除样品中的大颗粒及缓冲检测系统以保障环境体系中 PCT抗原与特异性抗体交联。
[0023] 2)金结合物垫，经过专用处理液（含Tris、S_17、牛血清白蛋白等）处理过的玻璃 纤维膜,含有胶体金抗N端PCT抗体交联物。胶体金标记抗体的确切点样量需要严格测试， 以适合T线显色检测PCT，还要使多余胶体金标记抗体进入C区而显现颜色。胶体金标记抗 体不足时C区颜色将不会显示，成为失效条。过量的胶体金标记抗体到达T区可出现假阳 性。
[0024] 3)硝酸纤维素膜（NC膜）。在硝酸纤维素膜划线的第一个区是T线检测区，在硝 酸纤维素膜划线的第二个区是C线控制区。T线和C线在此膜包被成线状。T线含固相化 的抗PCT降钙素区域的单克隆抗体，以捕获胶体金交联抗体。当PCT-胶体金交联复合物从 交联垫以毛细运动到达C线时，该复合物将被羊抗鼠 IgG抗体捕获，而形成可见的酒红色条 带。C线为控制线，以便检验检测系统的有效性。如C线不出线，表明检验无效。
[0025] 4)吸水垫为Whatman滤纸，促进样本层析经过样本垫、胶体金-抗体结合物垫、硝 酸纤维素膜，到达吸水垫区，以吸收多余的样本而完成检测。
[0026] 5)黏贴支架为PVC支持垫：由薄PVC塑料制成以支撑上述组件。定量检测：为达 到这一个目的，我们设计了配套的免疫层析定量读数仪。
[0027] 评估检测试纸条，包括敏感性、特异性和准确性。检测试纸条浸入标准浓度的PCT 溶液（0.5-10纳克/毫升）以评估其敏感性和特异性。PCT溶液中含有肝素、EDTA、枸橼酸 钠、胆红素、血红素、胆固醇、甘油三酯和类风湿因子（IR)和蛋白对检测无干扰。
[0028] 本发明产品的阳性参考品符合率、重复性、稳定性、批间差、最低检出量等指标均 符合行业标准。
[0029] 本发明产品的最低检出量为0. Ing/mL。
[0030] 本发明产品的定性检测时间为2分钟，定量检测时间为30分钟。
[0031] 最低检测限：用降钙素原（PCT)企业标准品进行检测，最低检出限应不高于 0.lng/mL 〇
[0032] 特异性：
[0033] 阴性特异性：分别用含C反应蛋白（CRP)、白细胞介素6(IL_6)、人降钙素 (human calcitonin)、人抗|丐素 （human katacalcin)、人 α 降|丐素基因相关肤（human alpha-calcitonin gene-related peptide，alpha_CGRP)、人 β 降|丐素基因相关肤（human beta-calcitonin gene-related peptide，beta_CGRP)的 Ong/mL PCT 液进行检测，结果应 均为阴性。
[0034] 阳性特异性：分别用含C反应蛋白（CRP)、白细胞介素6(IL_6)、人降钙素 (human calcitonin)、人抗I丐素 （human katacalcin)、人 α 降I丐素基因相关肤（human alpha-calcitonin gene-related peptide，alpha_CGRP)、人 β 降I丐素基因相关肤（human beta-calcitonin gene-related peptide，beta_CGRP)的 0.5ng/mL PCT 液进行检测，结果 应均为阳性。
[0035] 阳性分级与剂量反应曲线
[0036] 取不同浓度的PCT参考品（用PCT阴性血清稀释的重组人PCT校准品或阳性参考 血清），经配套仪器测定，得到的剂量反应曲线的线性相关系数均r > 0. 950。
[0037] 准确度：参考血清1相对低值测定数值在±20%范围之内；参考血清2相对高值 测定数值在±20%范围之内。
[0038] 批内重复性（批内差）：测定同一批产品（n = 10)，观察用阴性血清稀释的重组人 PCT校准品或阳性参考血清的PCT液，经配套仪器测定，每个批次的测定数值批内重复性， CV 批内< 30%。
[0039] 批间重复性（批间差）：任意3个批次的产品，观察用阴性血清稀释的重组人PCT 校准品或阳性参考血清的PCT液，经配套仪器测定，每次的测定数值CV批间< 20%。
[0040] 加速稳定性试验：将试纸卡在37°C条件下放置21天后，分别检测5. 1-5. 6项，检 测结果应符合各项目的要求。
[0041] 干扰物试验：将试纸卡用血红素（Hemoglobin)、胆红素（Bilirubin)、甘 油三酯（Triglycerides)、肝素钠（Heparin)抗凝剂、亚胺培南（Irnipenem)、头孢 噻月亏（Cefotaxime)、万古霉素（Vancomycin)、多巴胺（Dopamine)、去甲肾上腺素 (Noradrenalin)、多巴酌·丁胺（Dobutamine)、利尿横胺（Furosemide)的 0ng/ml PCT 液检 测，结果应均为阴性。
【权利要求】
1. 一种快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸，包括长方体状盒体、位于盒体内 底部的长条形黏贴支架，在黏贴支架上方从左到右依次黏贴有样本垫、金结合物垫、硝酸纤 维素膜、吸水垫；在硝酸纤维素膜上中间部位从左到右设有一道检测线和一道控制线；其 特征在于：所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理 液进行处理过夜；所述的金结合物垫是由经过含Tris、S-17、牛血清白蛋白等的专用处理 液处理过的玻璃纤维膜构成，含有胶体金抗N端PCT的抗体交联物；所述的硝酸纤维素膜上 的检测线为包被有固相化的抗PCT降钙素区域的抗体的T线；所述的硝酸纤维素膜上的控 制线为包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的C线。
2. 根据权利要求1所述的一种快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸，其特征在 于：所述的T线包被有固相化的抗PCT降钙素区域的抗体，而金结合物垫中含有胶体金抗N 端PCT的抗体交联物。
3. 根据权利要求1所述的一种快速检测人血降钙素原胶体金免疫层析试纸，其特征在 于：所述样本垫材质为玻璃纤维膜，经过主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处 理过夜；玻璃纤维膜包被有固相化的抗PCT降钙素区域的抗体的T线和包被有羊抗鼠IgG 多克隆抗体的C线。
4. 一种快速检测降钙素原的胶体金免疫层析方法，其特征在于：被检测样本为血液 (血清、血浆及全血)，采用上述权利要求1至3任意一项所述的快速检测降钙素原的胶体金 免疫层析试纸； 1) 用加样枪加 l〇〇ul或用滴定管加3滴血液样本到样本垫上； 2) 平放静置2-30分钟； 3) 2分钟后，进行定性或半定量检测，对比试剂盒附带的比色卡，估计降钙素原含量范 围； 4) 或等待30分钟，使用专用的免疫层析定量读数仪，进行定量检测降钙素原的浓度。
【文档编号】G01N33/577GK104090109SQ201410360291
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】胡晓武 申请人:胡晓武