一种用作结合对的特异性结合反应培养基的水溶液的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种作为用于结合对的特异性结合反应培养基使用的水溶液，其中第一结合成员识别其互补第二结合成员，该溶液含有：a)一种控制pH的缓冲液；b)选自下述基团的化合物A：-由通式IR1-[[CR2R3]p-O]q-R4定义的化合物，其中R1是氢或羟基，各元件的R2独立地是氢或羟基，R3是氢、甲基、乙基，R4是氢或烷基，p是2到10的一个整数，q是1到100的一个整数，附带条件是该化合物至少携带两个羟基；-多元醇；-糖类；c)非离子洗涤剂。
【专利说明】一种用作结合对的特异性结合反应培养基的水溶液
[0001] 本申请是申请日为2004年2月26日、申请号为No. 200480042127. 4、发明名称为 "一种用作结合对的特异性结合反应培养基的水溶液"的中国发明专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及用作结合对的特异性结合反应培养基的水溶液。
[0003] 发明背景
[0004] 公知使用一种或多种抗体在一种试样中检测试验物质（分析物）的免疫测定技 术。免疫测定技术方法的发展增强了该试验的敏感性。尽管在近些年来有所发展，但仍然 希望消除非特异性的结合反应、交叉反应以及基质之中存在的化合物的影响。
[0005] 免疫测定法取决于结合成员对的第一结合成员（如一种抗原或配体）与结合成员 对的第二结合成员（如一种抗体或受体）特异性结合的能力。为了测定这种结合的延续， 用可检测部分标记含有这种结合成员的一方的共轭物。这种结合成员对可以是一种抗原和 针对该抗原的抗体。
[0006] 免疫测定法可以以竞争性的免疫测定法形式或以夹心免疫测定法形式进行。在竞 争性的免疫测定法形式中抗原可以被固定到固相材料上，而结合到固相材料上的可检测部 分的数量能够被检出、计量并将其与试样中存在的抗体的数量相关联。固相材料的实例包 括珠子、颗粒、微粒等等。在夹心免疫测定法形式中，将含有例如一种抗体的试样与一种蛋 白质例如抗原相接触。所述抗原被固定在固相材料上。固相材料的实例包括珠子、颗粒、微 粒等等。所述固相材料通常用一种已被可检测部分标记的第二抗原或抗体生成。然后分别 在所述固相材料上第二抗原或抗体分别与相应抗体或抗原结合，在一个或多个洗涤步骤以 去掉未结合的物质之后，加入一种指示剂物质例如显色物质，使其与可检测部分反应，产生 可检测信号，如颜色变化。然后检出该颜色变化，计量并将其与试样之中存在的抗体数量相 关联。此外应注意还需要各种稀释剂和缓冲液用于优化处理微粒、抗原、共轭物及参与化学 反应的其他试验组分。
[0007] 为了在免疫测定法中获得最佳结果，用于结合伙伴之间结合反应（例如抗体和抗 原反应或配体和受体生成复合体）的溶液必须提供一种培养基以优化抗体结合抗原的能 力，或必须提供一种培养基以优化配体结合受体的能力，同时强有力的降低甚至防止非特 异性相互作用、低亲合性结合和基质效应，以免生成错误信号。
[0008] 为了消除非特异性相互作用和交叉反应，有人在结合反应之后将洗涤剂加入洗涤 步骤所用的缓冲液中以去除非特异性结合。
[0009] 对于免疫测定法，像western印记分析、酶联免疫吸附试验（ELISA)等，使用含有 补充有牛血清白蛋白和〇. 01到〇. 〇5(v/v) Tween? 20的磷酸盐缓冲盐水的溶液作为培 养基，用于结合伙伴（例如抗体和抗原）之间的结合反应。但是常常发现用现有技术的这 种缓冲液不能避免非特异性或低亲合性结合、交叉反应和基质效应。例如，当研究一种涉及 多元分析物检测的CRP试验时，由于应用多元抗体而带来的交叉反应和基质效应看来已成 为一个问题，其不能通过利用常规的免疫测定缓冲液解决。
[0010] 因此本发明的目的是提供一种溶液，作为用于结合成员对的特异性结合反应的培 养基使用，其中强有力的降低或甚至防止非特异性结合、低亲合性结合、交叉反应和基质效 应。此外，本发明的目的是提供一种免疫测定方法，其中非特异性和低亲合性结合、交叉反 应和基质效应被降低或防止。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明的目的是通过使用一种水溶液作为用于结合成员对的特异性结合反应的 培养基而实现的，其中第一结合成员识别其互补的第二结合成员，该溶液含有
[0013] a)控制pH的一种缓冲液；
[0014] b)选自下组的化合物A :
[0015] -由通式I RHKRfL-OL-R4定义的化合物，其中R1是氢或羟基，各单元中R2独 立地是氢或羟基，R 3是氢、甲基、乙基，R4是氢或烷基，P是2到10的一个整数，q是1到100 的一个整数，附带条件是该化合物至少携带两个羟基；
[0016] -多元醇；
[0017]-糖类；
[0018] c)非离子洗涤剂。
[0019] 在化合物A的通式I中，如果R4是氢，相邻的残基R2也是氢。如果R 1是羟基，相 邻的残基R2是氢。在一个优选【具体实施方式】中，化合物A的分子式中的q是从1到50的 一个整数，更优选从1到30。
[0020] 本发明的发明人意外地发现本发明的水溶液可以降低免疫测定中的交叉反应、基 质效应、非特异性结合和低亲合性结合。此外，还发现使用本发明水溶液时可以防止嗜异性 的抗体（人抗小鼠抗体）带来的影响。另外，即使在应用于血浆的情况下，用该缓冲液能够 避免风湿（rheuma)因子、血红蛋白、胆红素和甘油三脂带来的负效果。
[0021] 在这里"结合成员对"包括一个"第一结合成员"和一个"第二结合成员"。两种结 合成员会彼此特异性结合。结合成员对的第一结合成员可以分别是抗原或配体。第二结合 成员（如分别为抗体或受体）特异性地识别并结合第一结合成员（如分别为抗原或配体）。 第二结合成员是相应的结合成员，因此也称为"相应结合成员"。技术人员会理解术语"第 一"结合成员和"第二"结合成员分别可以是例如抗原和相应抗体，或反之亦然。
[0022] 本发明的水溶液代表一种通用缓冲液，其在各种基质（例如血浆，血清等）中进行 的免疫测定和结合反应中作为培养基。在应用多分析物的情况下，例如如果使用蛋白质芯 片，需要同步孵育几个（或多个）分析物和几个抗体，经常发生非特异性结合和交叉反应。 在很多情况下观察到这种不希望得到的结合反应。利用现有技术公知的标准ELISA缓冲液 不能防止这种交叉反应影响。另外在现有技术中，与其它参照的方法相比，所采用的天然样 品可导致基质效应，这会引起错误的测量值。在此术语"基质"指天然样品（例如血清）之 中存在的所有化合物；术语"基质"特别是指有机的、尤其是生物化合物，例如蛋白质。
[0023] 本发明的水溶液分别可以用作结合对的结合反应的培养基，作为用于免疫测定和 结合反应的样品稀释缓冲液以及抗体和抗原的稀释缓冲液。进一步可应用于多分析物免 疫测定和蛋白质分析（proteomics)，其中能够防止不希望得到的突光体标记抗体的交叉反 应。荧光体标记抗体往往会以非特异性方式结合其它蛋白质。使用本发明的水溶液能够避 免这种影响。
[0024] 在免疫测定如ELISA和蛋白质芯片中，使用本发明的缓冲液可以展示出进一步的 积极效果。当用本发明缓冲液孵育带有固定抗体的表面时，该固定化抗体的活性有所增强。 这使得分析物与固定化抗体的结合增强。总之，本发明缓冲液除降低非特异性信号和非特 异性影响之外，还会增强分析物和抗体之间特异性结合反应阳性作用带来的特异性信号。 这种固定化抗体活性的所致增强提供更高的相应试验的敏感性。
[0025] 本发明的缓冲液可以用于免疫测定ELISA、EIA、FIA、侧向流式试验 (lateral-flow-test)、蛋白质芯片、多分析物试验、western印记、点印记、免疫组织化学、 受体配体试验和免疫PCR。
[0026] 发明详述
[0027] 在本发明一优选【具体实施方式】中，该水溶液进一步包括与免疫阻断非特异抗体结 合有效量的蛋白质。此蛋白质优选选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、胎牛血清。进一 步优选该蛋白质以〇. 1到2% (w/v)的浓度存在于水溶液中，更优选0. 5到1. 5% (w/v)范 围。这些蛋白质不能被免疫测定所用的任何抗体识别。这种未被识别的蛋白质可以免疫阻 断由样品之中可能存在的分子或化合物带来的非特异性抗体结合。
[0028] 在另一【具体实施方式】中，该水溶液含有选自下列的盐：NaCl、KC1、NH4C1。进一步 优选该水溶液具有l〇〇mM到1. 5mM的离子强度，更优选200mM到1M，甚至更优选200mM到 800mM，特别更优选200mM到600mM，最优选250mM到500mM。本发明人意外地发现用作用于 结合反应的培养基的该缓冲液在200mM到600mM范围内的高离子强度会进一步降低非特异 性结合和交叉反应，同时没有负面影响特异性结合反应。
[0029] 在特定优选【具体实施方式】中，该水溶液缓冲液选自Tris(三（羟甲基）_氨基甲 烷）、Pipes (哌嗪-1，4-双-2-乙烷磺酸）、Mes (4-吗啉代乙烷磺酸）、ifepes (4-(2-羟乙 基）-1-哌嗪-乙烷磺酸）、磷酸盐缓冲液。
[0030] 在另一优选【具体实施方式】中，化合物A选自下组：聚亚烷基二醇，聚丙二醇，丙二 醇，聚乙二醇，乙二醇，单糖，双糖，三糖，蔗糖，甘露糖，海藻糖，多元醇，甘油和其混合物。在 一优选【具体实施方式】中化合物A的浓度在0.5到25 % (v/v)范围之内，优选2.0到20 % (v/ v)，更优选2. 0到15 % (v/v)，进而更优选2. 0到10 % (v/v)，甚至更优选2. 0到7 % (v/v)， 最优选约5% (v/v)。如果化合物A是液相，该浓度则为％ (v/v)。如果该化合物A是固体 (例如糖类），该浓度应被理解为％ (w/v)。
[0031] 在另一优选【具体实施方式】中，该水溶液含有选自下述的通式化合物作为非离子洗 涤剂：
[0032] a)具有取代基R1和R2 (Rhph-R2)的取代的苯基，其中R1是C「C9烷基，R2 是-0-[CH2-CH2-0] a-H基团，其中" a"是5到40的一个整数，其中R2相对于R1在对位、间位 或邻位；
[0033] b)
[0034]
【权利要求】
1. 一种在结合对的特异性结合反应过程中达到降低基质效应或者降低或防止因嗜异 性抗体引起的效应的体外方法，其中第一结合成员识别其互补的第二结合成员，其中所述 的特异性结合反应是在血浆或血清的基质中进行的，所述方法包括使用水溶液作为所述特 异性结合反应的介质，该水溶液含有 a) 控制pH的缓冲剂； b) 选自下组的化合物A : -由通式I ^-[[CI^inp-OL-R4定义的化合物，其中R1是氢或羟基，各单元中R2独立地 是氢或羟基，R3是氢、甲基、乙基，R4是氢，P是2到10的整数，q是1到50的整数，附带条 件是该化合物至少携带两个羟基； -多元醇； 一糖类； c) 非离子型洗涤剂， 其中所述水溶液具有200mM-lM的离子强度。
2. 权利要求1的方法，其中所述的水溶液包含免疫阻断非特异性抗体结合的有效量的 蛋白质。
3. 权利要求2的方法，其中所述蛋白质选自牛血清白蛋白，卵清蛋白、酪蛋白或胎牛血 清。
4. 权利要求2的方法，其中所述蛋白质的浓度在0. 1到2% (w/v)范围之内。
5. 权利要求1的方法，其中所述的水溶液包含选自NaCl、KCl、NH4Cl的盐。
6. 权利要求1的方法，其中所述水溶液具有200-800mM的离子强度。
7. 权利要求1的方法，其中所述水溶液具有250-800mM的离子强度。
8. 权利要求1的方法，其中所述缓冲剂选自：三（羟甲基）_氨基甲烷，哌 嗪-1，4-双-2-乙烷磺酸，4-吗啉代乙烷磺酸，4-(2-羟乙基）-1-哌嗪-乙烷磺酸，磷酸盐 缓冲剂。
9. 权利要求1的方法，其中所述化合物A选自下组：聚亚烷基二醇，聚丙二醇，丙二醇， 聚乙二醇，乙二醇，单糖，双糖，三糖，蔗糖，甘露糖，海藻糖，多元醇，甘油，和其混合物。
10. 权利要求1的方法，其中所述化合物A的浓度在2. 0到20% (w/v或v/v)范围之 内。
11. 权利要求1的方法，其中所述化合物A的浓度在2. 0到15% (w/v或v/v)范围之 内。
12. 权利要求1的方法，其中所述化合物A的浓度在2. 0到10% (w/v或v/v)范围之 内。
13. 权利要求1的方法，其中所述化合物A的浓度在2.0到7% (w/v或v/v)范围之内。
14. 权利要求1的方法，其中所述非离子型洗涤剂为通式化合物，其选自 a) 具有取代基R1和R2的取代的苯基O^-Ph-R2)，其中R1是Q-C；烷基，R 2 是-0-[CH2-CH2-〇] a-H基团，其中" a"是5到40的整数，其中R2相对于R1在对位、间位或邻 位； b)
其中n、X、y及z都是5到40的整数，R是脂肪酸残基。
15. 权利要求1的方法，其中所述非离子型洗涤剂选自：十二烷基聚（乙二醇醚）m，其 中m是5到40的整数；1-0-正辛基-β-D-吡喃葡糖苷（正辛葡糖苷）；烷基酚聚（乙二 醇-醚） m，其中m是5到40的整数；1-0-正十二烷基-β-D-吡喃葡糖基（1-4) α-D-批 喃葡糖苷；十二烷基聚_(乙二醇醚）m，其中m是5到40的整数；聚（氧化乙烯）（20)-脱 水山梨醇单脂肪酸酯；辛基酚聚（乙二醇醚），其中m是5到40的整数。
16. 权利要求1的方法，其中所述非离子型洗涤剂的浓度在0.1-1. 0% (v/v)范围之 内。
17. 权利要求1的方法，其中所述非离子型洗涤剂的浓度在0.15-1. 0% (v/v)范围之 内。
18. 权利要求1的方法，其中所述非离子型洗涤剂的浓度在0.2-1. 0% (v/v)范围之 内。
19. 权利要求1的方法，其中所述非离子型洗涤剂的浓度在0.2-0. 8% (v/v)范围之 内。
20. 权利要求1的方法，其中所述非离子型洗涤剂与化合物A的比率为1 :15到1 :25。
21. 权利要求1的方法，其中所述水溶液不含有二硫苏糖醇。
22. 权利要求1的方法，其中pH被调整在5. 6到9. 6范围内。
23. 权利要求1的方法，其中所述水溶液能够防止KD值高至1(Γ7Μ的低亲合性结合。
24. 权利要求1的方法，其中所述水溶液能够防止KD值高至Hr%的低亲合性结合，并 将KD值为10_7Μ到10_8Μ范围内的中亲合性结合降低至少90%。
25. 权利要求1的方法，其中所述水溶液能够防止KD值为高至1(Γ7Μ的低亲合性结合， 并将K D值为10_7Μ到10_9Μ范围内的中亲合性结合降低至少90%。
26. 权利要求1的方法，其中所述水溶液能够增强抗体的结合活性。
27. 权利要求1到26的任一项的方法，其中所述结合反应是抗体抗原结合反应。
28. 权利要求1到26的任一项的方法，其中所述结合反应是受体配体结合反应。
29. 权利要求1到26的任一项的方法，其中所述水溶液用作样品及试剂的稀释缓冲液 或用作洗涤缓冲液。
30. 权利要求1的方法，其中所述被降低或防止的因嗜异性抗体引起的效应是所述嗜 异性抗体与反应中使用的抗体的结合。
31. 权利要求1的方法，其中所述被降低或防止的因嗜异性抗体引起的效应是所述嗜 异性抗体与反应中使用的俘获抗体的结合。
32. 权利要求1的方法，其中所述被降低或防止的因嗜异性抗体引起的效应是所述嗜 异性抗体与反应中使用的检测抗体的结合。
33.权利要求1的方法，其中所述嗜异性抗体为人抗小鼠抗体。
【文档编号】G01N33/53GK104090097SQ201410365848
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2004年2月26日 优先权日:2004年2月26日
【发明者】P·劳赫, T·波利夫克, A·策尔默 申请人:康多尔生物技术有限公司