一种蛋白质分子印迹聚离子液体膜电化学传感器的制造方法
【专利摘要】本发明涉及电分析化学和蛋白质识别传感器【技术领域】，公开了一种功能化离子液体的合成方法，及由该离子液体/羧基化多壁碳纳米管/玻碳电极构成的分子印迹电化学传感器的制备方法和应用。该分子印迹电化学传感器的制备方法：以可聚合的氨基功能化离子液体为功能单体，BSA为模板蛋白，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，过硫酸铵与四甲基乙二胺构成的氧化-还原体系为引发剂，经聚合，在羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极表面形成分子印迹聚合物膜，再将模板蛋白洗脱，得到可特异性识别模板蛋白质的分子印迹电化学传感器。本发明的分子印迹电化学传感器具有制备简单，材料成本低廉，选择性高，生物相容性好，可用于水溶液中蛋白质的识别和检测。
【专利说明】一种蛋白质分子印迹聚离子液体膜电化学传感器
【技术领域】
[0001] 本发明涉及聚离子液体、蛋白质印迹、分子识别及电化学传感器【技术领域】。具体涉 及一种功能化离子液体的合成方法，及由该离子液体/羧基化多壁碳纳米管/玻碳电极构 成的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前对蛋白质具有选择性的定量分析和生物传感等技术几乎都基于抗原-抗体 免疫反应来实现；抗体体系不仅造价昂贵，使用条件苛刻，而且对蛋白质识别时，结构不稳 定，通常只能使用一次。分子印迹技术是一种人工合成的、具有分子识别功能的新型分离技 术。合成能特异性识别模板蛋白质的分子印迹聚合物具有非常高的应用价值，并已经成功 应用于仿生传感器、色谱填料、生物材料模拟、固相萃取、酶和抗体等领域。
[0003] 在分子识别过程中主要是基于氢键作用力、静电作用力和几何构型使蛋白质和分 子印迹聚合物（MIP)结合。为了保证有足够的氢键作用力和静电作用力，一般采取在有机 溶剂中聚合的方法。但蛋白质的空间构型对MIP的选择性识别能力至关重要，制备MIP时 的各种条件要求尽量类似生物环境，这就使有机溶剂的使用受到限制。因此，合成新型功能 单体，并探索更温和的聚合条件对获取高性能分子印迹聚合物至关重要。
[0004] 目前用于蛋白质分子印迹的方法所用到的功能单体或者印迹材料，大多都不具有 生物相容性，还存在选择性识别蛋白能力差，操作复杂耗时，不能重复利用等不足。
[0005] 本发明实现了一种利用离子液体为功能单体制备蛋白质分子印迹电化学传感器 的方法。离子液体被称为"绿色溶剂"，具有良好生物相容性、宽的电化学窗口和高导电性， 使其适用于制备蛋白质分子印迹聚合物。以氨基功能化的离子液体为单体，在水溶液中聚 合后可制备出蛋白质印迹水凝胶聚合物，并有望保持蛋白质生物活性。碳纳米管羧基化之 后，具有良好的亲水性和生物相容性，可以用于电化学生物传感器的研究。本方法制备的 蛋白质分子印迹电化学传感器具有材料成本低廉、制备简单、操作方便、生物相容性好、稳 定性好、线性范围宽等优点，具有潜在的应用价值，对生物大分子的印迹聚合物的制备提供 了重要的指导意义。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的不足，本发明的目的之一是制备了一种同时具有氨基和乙 烯基功能基团的咪唑类离子液体。
[0007] 本发明的目的之二是提供了一种基于上述离子液体的能选择性识别蛋白质（如 牛血清蛋白）的分子印迹电化学传感器。
[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采取了如下技术措施。
[0009] 1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体，其合成方法如下：
[0010] 将3-溴丙基胺氢溴酸盐按照固液比4. 4g:30mL溶于无水乙腈，N2保护，升温至 55°C，然后将含有N-乙烯基咪唑的无水乙腈溶液在2h滴加完毕，然后继续反应12h，移除溶 齐[J，同时加二次水和甲苯洗涤，分液后水层溶于甲醇，滴加 Na2C03饱和甲醇溶液至pH为9 ; 蒸发溶剂，产物溶于四氟硼酸钠饱和溶液，搅拌lh，蒸发除水，甲醇离心洗涤，蒸发甲醇，得 到浅黄色的1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体；
[0011] 所述无水乙腈与含有N-乙烯基咪唑的无水乙腈溶液的体积比为1:1 ;
[0012] 所述3-溴丙基胺氢溴酸盐与N-乙烯基咪唑的质量比为4. 4:2. 8 ;
[0013] 一种利用上述离子液体作为功能单体制备蛋白质分子印迹电化学传感器的方法， 包括以下步骤：
[0014] (1)将多壁碳纳米管进行羧基化修饰得羧基化多壁碳纳米管；
[0015] (2)用羧基化多壁碳纳米管对玻碳电极表面进行修饰得羧基化多壁碳纳米管修饰 玻碳电极；
[0016] (3)利用步骤（2)制备的羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极、利用上述离子液体 作为功能单体制备蛋白质分子印迹电化学传感器，蛋白质优选牛血清白蛋白。
[0017] 具体的，一种利用上述离子液体作为功能单体制备蛋白质分子印迹电化学传感器 的方法，包括以下步骤：
[0018] (1)制备羧基化多壁碳纳米管：
[0019] 多壁碳纳米管溶于4mol · Γ1的硝酸中，加热回流，反应24h，待反应结束，用乙腈 离心洗涤酸化产物，至PH7,再用乙醇洗涤，于25°C下烘干；
[0020] 所述多壁碳纳米管与4mol · I71的硝酸的固液比为50mg:6mL ;
[0021] (2)制备羧基化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极MWCNT-C00H/CGE :
[0022] 将直径为3mm的玻碳电极用粒径为0. 05 μ m的氧化铝粉在抛光布上打磨至光亮 镜面，用二次水冲洗干净，再依次用硝酸、无水乙醇和二次水清洗，最后用N2吹干备用；称 取一定量步骤（1)制备的羧基化多壁碳纳米管，加入到二次水中，超声分散均匀，得羧基化 多壁碳纳米管溶液，其中羧基化多壁碳纳米管浓度为0. 5mg · ml/1，取6. 0 μ L羧基化多壁 碳纳米管溶液滴涂于玻碳电极表面，室温下晾干，即得羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极 (MWCNT-C00H/GCE)；
[0023] (3)制备蛋白质分子印迹电化学传感器：
[0024] 480 μ L 的 Tris-HCl 缓冲溶液（0· lmol · Ι71，ρΗ7· 4)中，加入 4. 8mg 牛血清白蛋 白使其完全溶解，再依次加入〇.〇28g上述离子液体、0.002g Ν，Ν' -亚甲基双丙烯酰胺、 15 μ LlOwt %过硫酸铵-5wt %四甲基乙二胺溶液（该溶液中过硫酸铵、四甲基乙二胺浓度 分别为l〇wt %、5wt % )，混匀，得混合溶液，取6. 0 μ L混合溶液滴涂在MWCNT-C00H/GCE 表面，35°C下聚合成膜，依次用10% (V/V)HAc-10% (m/v)SDS溶液、Tris-HCl缓冲溶液 (0. lmol4)、二次水洗涤，晾干，即得蛋白质分子印迹电化学传感器，即BSA分子印 迹电化学传感器。
[0025] 上述蛋白质分子印迹电化学传感器对蛋白质的识别过程，包括以下步骤：
[0026] 将蛋白质（BSA)分子溶解于Tris-HCl缓冲溶液（0· lmol4)中使其浓度 为1.0mg*mL'将蛋白质分子印迹传感器置于10mL该BSA溶液中，搅拌孵育10min。取出 传感器，依次用Tris-HCl缓冲溶液（0. lmol4)和二次水洗涤，除去电极表面物理 吸附的 BSA。以 l.Ommol I^KjFe^NWKjFe^Nh] (1:1)作探针，在含 0.4mol .LlCl 的 Tris-HCl(0. lmol ?L'pHTj)缓冲溶液中，采用循环伏安法分别研究识别BSA前后传感器 的伏安行为。
[0027] 与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
[0028] (1)由于在玻碳电极表面直接修饰离子液体聚合物膜后，聚合物膜在实验过程中 容易脱落，故本发明在玻碳电极表面用羧基化多壁碳纳米管修饰。羧基化多壁碳纳米管与 玻碳电极表面有较强的作用力，同时也与聚合物膜有较强的作用力，这样可以保证聚合物 膜在实验过程中的稳定性。而且，用羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极后，能提高电极的比 表面积。
[0029] (2)本发明制备的功能化离子液体无毒无污染，具有水溶性和生物相容性好的特 点。
[0030] (3)本发明制备分子印迹电化学传感器所用到的溶剂为缓冲水溶液，可以在水溶 液中实现蛋白质的印迹与检测。
[0031] (4)本发明制备的分子印迹电化学传感器操作简单、快速、选择性高、线性范围宽。
[0032] (5)本发明制备的电化学传感器对和蛋白质（如牛血清白蛋白）的识别测定选择 性好，线性范围宽，稳定性和重复性好，结果可信。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为羧基化多壁碳纳米管的傅立叶变换红外图谱（A)和扫描电子显微镜图（B)。 图1(A)的FT-IR光谱图中，3400CHT 1处有宽的强吸收峰，为-C00H上的0-H伸缩振动峰； 1656CHT1处为C = 0的伸缩振动；2958CHT1处为碳纳米管上sp2杂化的C = C双键上的C-H 伸缩振动。说明经ΗΝ03处理后，多壁碳纳米管表面修饰了羧基官能团。图1(B)显示当多 壁碳纳米管经过羧基化后，变成了小段的管状结构。
[0034] 图2为1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体的合成路线图。
[0035] 图3为制备分子印迹电化学传感器的过程示意图。
[0036] 图4中a为裸玻碳电极、b为羧基化多壁碳纳米管修饰电极、c为BSA分子印迹聚合 物膜修饰电极洗脱前、d为BSA分子印迹传感器识别BSA后、e为BSA分子印迹聚合物膜修 饰电极洗脱BSA后的伏安曲线。由图可知，当MWCNT-C00H修饰玻碳电极后，峰电流增加，说 明碳纳米管增加了电极的导电性。当在电极表面形成蛋白质（BSA)印迹聚离子液体膜后， 氧化-还原峰峰电流明显增加；用HAc-SDS洗脱BSA后，峰电流进一步增加（图4中e)，表 明蛋白质洗脱后，其在聚合物中形成的"孔穴"结构增加了电极的导电性；而重新吸附蛋白 质后，峰电流减小，说明不导电的BSA重新回到分子印迹"孔穴"结构中，阻碍了电子传递。
[0037] 图5中a为裸玻碳电极、b为羧基化多壁碳纳米管修饰电极、c为不加 BSA的聚离 子液体膜修饰电极洗脱前、d为吸附BSA后的非分子印迹聚合物膜修饰电极、e为洗脱后的 非分子印迹聚合物膜修饰电极的伏安曲线。由图可知，当MWCNT-C00H修饰玻碳电极后，电 流有所增加；当聚离子液体膜修饰至电极表面后，氧化-还原峰的峰电流也明显增加；但是 在洗脱和吸附过程中，氧化-还原峰的峰电流几乎不变，说明没有加 BSA模板蛋白的NIP材 料，不能识别BSA分子。
[0038] 图6为BSA分子印迹电化学传感器与非印迹传感器吸附BSA时的电流响应图。
[0039] 图7为BSA分子印迹电化学传感器对于不同浓度BSA的电流响应情况的校准曲 线。
[0040] 图8为BSA分子印迹电化学传感器对不同物质的电流响应图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体的实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明的技术方案和有益效果而不用于限制本发明的范围。此外，还应理解，在阅读了本发明所 讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落 于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0042] 以下实施例中所用多壁碳纳米管（型号TNM1)为中国科学院成都有机化学有限公 司生产，牛血清白蛋白（BSA)为上海如吉生物科技发展有限公司提供，其他原料及试剂均 为常规市售商品。
[0043] 实施例1
[0044] 一种羧基化多壁碳纳米管，其制备方法如下：
[0045] 50mg多壁碳纳米管（MWCNT)溶于6mL4mol · Γ1的硝酸中，加热回流反应24h。待 反应结束，用乙腈离心洗涤酸化产物，至PH7,再用乙醇洗涤，于25 °C下烘干。其FT-IR光谱 如图1⑷所示，SEM图谱如图1 (B)所示。
[0046] 实施例2
[0047] -种羧基化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极，其制备方法如下：
[0048] 将直径为3mm的玻碳电极用粒径为0. 05 μ m的氧化铝粉在抛光布上打磨至光亮 镜面，用二次水冲洗干净，再依次用硝酸溶液硝酸与二次水等体积混合溶液）、无 水乙醇和二次水各超声清洗2min，最后用N 2吹干备用。称取一定量实施例1制备的羧基 化多壁碳纳米管（MWCNT-C00H)，加入到二次水中，超声分散均匀，使MWCNT-C00H的浓度为 0. 5mg · mL'用移液器吸取6. 0 μ LMWCNT-C00H溶液滴涂于玻碳电极表面，室温下晾干，即 得羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极（MWCNT-C00H/GCE)。
[0049] 实施例3
[0050] 1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体，其合成方法如下：
[0051] 将4. 4g3-溴丙基胺氢溴酸盐（CAS号：5003-71-4)溶于30mL无水乙腈，Ν2保护， 升温至55°C，然后将30mL含有2. 8g Ν-乙烯基咪唑的无水乙腈溶液在2h滴加完毕，然后继 续反应12h，移除溶剂，同时加二次水和甲苯洗涤，分液后水层溶于甲醇，滴加 Na2C03饱和甲 醇溶液至pH为9。蒸发溶剂，产物中加四氟硼酸钠饱和溶液，搅拌lh，蒸发除水，甲醇离心 洗涤，蒸发甲醇，即得浅黄色1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体。
[0052] 产物表征结果：1H NMR(D20) δ :9. 07(s，1H)，7. 75(s，1H)，7. 58(s，1H)，7. 08(m， 1H)，5· 74 (d，1H)，5· 38 (d，1H)，4· 36 (t，2H)，3· 40 (t，2H)，2· 38 (m，2H) ;m/z = 152. 12889。
[0053] 本实施例所述的1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体的合成路线如图 2所示。
[0054] 实施例4
[0055] -种加模板蛋白的分子印迹（MI)电化学传感器，其制备方法如下：
[0056] 480 μ L 的 Tris-HCl 缓冲溶液（0· lmol · I71，ρΗ7· 4)中，加入 4. 8mg 牛血清白蛋白 (BSA)使其完全溶解。再依次加入0. 028g实施例3合成的离子液体、0. 002gN，Ν'-亚甲基双 丙烯酰胺、15 μ LlOwt%过硫酸铵-5wt%四甲基乙二胺溶液，混匀，得混合溶液。取6. 0 μ L 上述混合溶液滴涂在实施例2制备的MWCNT-COOH/GCE电极表面，35°C下聚合成膜。依次用 10% (v/v)HAc-10% (m/v)SDS(十二烷基硫酸钠）溶液、Tris-HCKO.lmol.L'pHTj)、： 次水洗涤，晾干，即得BSA分子印迹电化学传感器。其制备过程模拟图如图3所示。
[0057] 实施例5 (对比例）
[0058] -种不加模板蛋白的分子印迹电化学传感器，其制备方法如下：
[0059] 480 μ L 的 Tris-HCl 缓冲溶液（0· lmol .Ι^,ρΗ?· 4)中，依次加入 0· 028g 实施例 3 合成的离子液体、〇.〇〇2g N，N'_亚甲基双丙烯酰胺、MyLlOwt%过硫酸铵-5wt%四甲基乙 二胺溶液，混匀，得混合溶液。取6. 0 μ L上述混合溶液滴涂在实施例2制备的MWCNT-C00H/ GCE电极表面，35°C下聚合成膜。依次用10% (V/V)HAc-10% (m/v)SDS(十二烷基硫酸钠） 溶液、Tris-HCl缓冲溶液（0. lmol · Γ1，pH7. 4)、二次水洗涤，晾干，即得不加模板蛋白的分 子印迹电化学传感器，即非分子印迹电化学传感器。
[0060] 关于实施例4和5中，测定K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6] (1:1)的支持电解质的pH，是 通过不同pH对分子印迹传感器对模板蛋白质的电流响应曲线得到的。考察了 pH值为4. 0、 5. 0、6. 0、7. 0、7. 4、8. 0、8. 5的Tris-HCl缓冲溶液对传感器电流响应的影响。BSA的等电点 为4. 7,当溶液的pH〈4. 7时，BSA和离子液体的阳离子（IL+)都带正电，二者之间虽然相互 排斥，但仍能有一定的结合能力，这其中最主要的是氢键作用力；当ΡΗΜ. 7时，BSA带负电， IL+带正电，二者之间既可以形成氢键，也可以产生静电吸引，使得结合能力逐渐增强。在pH 值为5. 0处的峰电流最小，是因为靠近BSA等电点处，蛋白质变呈电中性，不易和IL+之间 产生强的静电引力。在pH值7. 4时，电流响应达到最大值，说明在中性条件下，蛋白质表现 出很高的活性，能够产生良好的印迹效果。当pH值继续增大时，BSA的印迹效应降低，这是 因为碱性条件下降低了离子液体与BSA的静电吸引力。因此，选用最佳pH值为7. 4的缓冲 体系，这也是与生理环境接近的pH值，能够保证蛋白质的多级结构尽量不发生改变。
[0061] 关于实施例4和5中，识别BSA的孵育时间是通过不同时间对 l.Ommol ?LljFdCNWKjFdCN^azl)的线性扫描伏安响应关系曲线确定。在0? 20min范围内考察了孵育时间对BSA分子印迹聚合物与1. 20X10_7mol ?I^BSA识别的影响。 以分子印迹电化学传感器结合BSA前后在l.Ommol · LljFdCNWKjFdCNh] (1:1)+0. 4mol 41(:1+0. lmol ?I^Tris-HCKpHTj)中的氧化峰的峰电流之差（ΛΙ)作为评价参数。 当孵育时间从〇min逐渐增加时，峰电流之差Λ I逐渐增大；7min后，Λ I增大的趋势变缓； 当达到10min时，Λ I基本不变，说明BSA与分子印迹聚合物的结合已趋于饱和。因此选择 10min为最佳孵育时间。
[0062] 实施例6
[0063] 实施例4和5制得的两种电化学传感器对BSA的识别过程如下：
[0064] 将BSA溶解于Tris-HCl缓冲溶液（0· lmol · ΙΛ ρΗ7· 4)中，使其浓度为 1. Omg 。将实施例4和5的电化学传感器分别置于10mL该BSA溶液中，搅拌孵育10min。 取出传感器，依次用Tris-HCl缓冲溶液（0. lmol4)和二次水洗涤，除去电极表面 物理吸附的BSA。以 L Ommol ?LljFe^NWKjFe^Nh] (1:1)作探针，在含(λ 4mol .LlCl 的Tris-HCl (0. lmol ·Ι^，ρΗ7. 4)缓冲溶液中，采用循环伏安法分别研究识别BSA前后传感 器的伏安行为。
[0065] 实施例7
[0066] 如图4所示，将各电化学传感器在-0. 2?0. 6V电位范围内对 l.Ommol ?LljFdCN^/KjFdCNh] (1:1)进行循环伏安（CV)扫描，扫描速度为0. lV·^， 支持电解质为〇. 4mol ?Ι^Κα+Ο. lmol ?PTris-HCl缓冲溶液（pH 7. 4)。图4中，a为裸玻 碳电极（实施例中用到的直径为3mm的玻碳电极）、b为羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极 (实施例2制备的）、c为BSA分子印迹聚合物膜修饰电极洗脱前（实施例4中间产物）、d 为分子印迹传感器识别BSA后（实施例6中孵育后）、e为印迹聚合物膜修饰电极洗脱BSA 后（实施例4的终产物）的伏安曲线。由图可知，当羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极后， 峰电流有所增加，说明碳纳米管增加了电子传导能力。当在电极表面形成BSA印迹聚离子 液体膜后，氧化-还原峰的峰电流显著增加；用10% (v/v)HAc-10% (m/v)SDS (十二烷基硫 酸钠）溶液洗脱BSA后，峰电流进一步增加（图4中e)，表明蛋白质洗脱后，其在聚合物形 成的孔穴结构增加了膜的导电性；而重新结合BSA后，峰电流减小，说明不导电的BSA重新 回到印迹"孔穴"结构中，阻碍了电子传递。
[0067] 如图5所示的各电化学传感器对1. Ommol ?LljFdCNWKjFdCNh] (1:1)的循 环伏安曲线，实验条件同图4。其中，a为裸玻碳电极（实施例中用到的直径为3mm的玻碳 电极）、b为羧基化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极（实施例2制备的）；c为聚离子液体膜 修饰电极（实施例5洗脱前）；d为非分子印迹电化学传感器吸附BSA后（实施例6中孵育 后）的电极；e为洗脱后的聚合物膜修饰电极（实施例5洗脱后）。由图可知，当羧基化多 壁碳纳米管饰玻碳电极后，电流有所增力P ;当聚离子液体膜修饰至电极表面后，氧化-还 原峰的峰电流显著增加；但是在洗脱和吸附过程中，氧化-还原峰的峰电流几乎不变，说明 没加 BSA模板蛋白的聚离子液体膜不能识别BSA分子。由伏安曲线的变化规律可以推断， 1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体作为BSA的印迹单体，制成的分子印迹聚合 物膜具有一定的分子识别能力。
[0068] 图6为实施例4制备的印迹电化学传感器与实施例5制备的非分子印迹电化学传 感器对1. Omg · ml^BSA的电流响应变化图，分子印迹电化学传感器的电流变化明显大于非 分子印迹电化学传感器，表现出明显的印迹效应。
[0069] 实施例8
[0070] 用微分脉冲伏安法考察了实施例4制备的分子印迹电化学传感器对于不同 浓度BSA的电流响应情况（具体操作同实施例6)，发现当BSA的浓度在1. 50X ΚΓ9? 1.50Xl(T6m〇l七1范围内，电流响应值ΛΙ与BSA浓度成良好的线性关系，如图7所示，其 中内插图为低浓度区的校准曲线。线性方程为：ΛΙ(μΑ) =6.85(:(1111101^1^)+0.4500^ =0· 9998)，检出限为 3. 91 X lO'mol · Γ1 (S/N = 3)。
[0071] 实施例9
[0072] 抗干扰性能是衡量电化学传感器的实用性的重要指标之一。本发明选用人血清蛋 白（HSA，第五组分）、马骨豁肌肌红蛋白（Myo)、牛血红蛋白（BHb)、细胞色素 c(cyt c)、鸡蛋 白蛋白（Ova)等蛋白分子和抗坏血酸（Ascorbic Acid)、甘氨酸（Gly)、L-组氨酸（L-His)、 L_半胱氨酸（L-Cys)等生物小分子为干扰物，考查了实施例4制备的BSA分子印迹电化学 传感器选择性识别BSA的能力。
[0073] 将BSA以及上述九种干扰物质分别溶解于Tris-HCl缓冲溶液（0. lmol · ΙΛ ρΗ7. 4)中，使各物质的浓度均控制为0. lmg · πι?Λ孵育时间均为10min。图8为BSA分子 印迹电化学传感器对不同物质的电流响应情况（具体实验操作同实施例6)。人血清蛋白 与牛血清蛋白的结构相似，分子量相当，因此，分子印迹电化学传感器对HSA的响应电流也 较大；马骨骼肌肌红蛋白与牛血红蛋白的结构与牛血清蛋白不同，等电点和分子量的大小 都不同，由图可知其电流响应值也较小；鸡蛋白蛋白的等电点为4. 7,细胞色素 c的等电点 为4. 5,与牛血清蛋白的等电点相当，但是二者分子量要小于牛血清蛋白，其在BSA分子印 迹聚合物上的结合效果不明显；抗坏血酸、甘氨酸、L-组氨酸和L-半胱氨酸等生物小分子 在BSA分子印迹电化学传感器上的电流响应极小。由实验结果可知，BSA分子印迹电化学 传感器对BSA有较强的选择性识别能力。
[0074] 实施例10
[0075] BSA分子印迹电化学传感器的重现性和稳定性测试如下：
[0076] 以同一传感器（实施例4所制备）连续测定1. 50 X 10_6mol ?I^BSA溶液5次（实 验方法同实施例6)，其吸附电流响应值的相对标准偏差（RSD)为3. 46%，具有较好的重现 性。将10% (v/V)HAc-10% (m/v)SDS(十二烷基硫酸钠）溶液酸洗过后的传感器放在4°C 的冰箱中，一周后，用其识别同浓度的BSA溶液，电流响应值降低8. 65%，具有良好的稳定 性。
【权利要求】
1. 1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体，其合成方法如下： 将3-溴丙基胺氢溴酸盐按照固液比4.4 g:30 mL溶于无水乙腈，N2保护，升温至55°C， 然后将含有N-乙烯基咪唑的无水乙腈溶液在2 h滴加完毕，然后继续反应12 h，移除溶剂， 同时加二次水和甲苯洗涤，分液后水层溶于甲醇，滴加 Na2C03饱和甲醇溶液至pH为9 ;蒸发 溶剂，产物溶于四氟硼酸钠饱和溶液，搅拌1 h，蒸发除水，甲醇离心洗涤，蒸发甲醇，得到浅 黄色的1-乙烯基-3-氨丙基咪唑四氟硼酸盐离子液体； 所述无水乙腈与含有N-乙烯基咪唑的无水乙腈溶液的体积比为1 : 1; 所述3-溴丙基胺氢溴酸盐与N-乙烯基咪唑的质量比为4.4 : 2.8。
2. -种利用权利要求1所述的离子液体作为功能单体制备蛋白质分子印迹电化学传 感器的方法，包括以下步骤： (1) 将多壁碳纳米管进行羧基化修饰得羧基化多壁碳纳米管MWCNT-COOH ; (2) 用羧基化多壁碳纳米管对玻碳电极进行表面修饰得羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳 电极； (3) 利用步骤（2)制备的羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极、利用权利要求1所述的离 子液体作为功能单体制备蛋白质分子印迹电化学传感器。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述蛋白质为牛血清白蛋白。
4. 一种利用权利要求1所述的离子液体作为功能单体制备蛋白质分子印迹电化学传 感器的方法，包括以下步骤： (1) 制备羧基化多壁碳纳米管： 多壁碳纳米管溶于4 mol· Γ1的硝酸中，加热回流，反应24 h，待反应结束，用乙腈离 心洗涤酸化产物，至pH 7,再用乙醇洗涤，于25°C下烘干； 所述多壁碳纳米管与4 mol · I71的硝酸的固液比为50 mg : 6 mL ; (2) 制备羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极MWCNT-COOH /CGE : 将直径为3 mm的玻碳电极用粒径为0. 05 μ m的氧化铝粉在抛光布上打磨至光亮镜 面，用二次水冲洗干净，再依次用硝酸、无水乙醇和二次水清洗，最后用N2吹干备用；称取 一定量步骤（1)制备的羧基化多壁碳纳米管，加入到二次水中，超声分散均匀得羧基化多 壁碳纳米管溶液，其中羧基化多壁碳纳米管浓度为〇. 5 mg · ml/1，取6. 0 μ L羧基化多壁 碳纳米管溶液滴涂于玻碳电极表面，室温下晾干，即得羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极 MWCNT-COOH /GCE ； (3) 制备蛋白质分子印迹电化学传感器： 480. L的0. 1 mol .L'pH 7. 4 Tris-HCl缓冲溶液中，加入4. 8 mg牛血清白蛋白使 其完全溶解，再依次加入〇. 028 g权利要求1所述的离子液体、0. 002 g Ν，Ν' -亚甲基双丙 烯酰胺、15 μ L 10wt%过硫酸铵-5wt%四甲基乙二胺溶液，混匀得混合溶液，取6. 0 μ L混 合溶液滴涂在MWCNT-COOH /GCE表面，35 °C下聚合成膜，洗脱牛血清白蛋白、晾干，得蛋白质 分子印迹电化学传感器。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述洗脱牛血清白蛋白的步骤为依次用 10v/v% HAc-10m/v% SDS 溶液、0· 1 mol · Γ1 的 pH 7. 4 Tris-HCl 缓冲溶液、二次水洗涤。
6. 根据权利要求3或4或5所述的方法制备的蛋白质分子印迹电化学传感器在定性或 者定量检测牛血清白蛋白中的应用。
【文档编号】G01N27/333GK104142361SQ201410378151
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】李春涯, 韩苗, 王炎英 申请人:中南民族大学