一种检测畜禽毛发中抗病毒药物残留量的方法
【专利摘要】本发明涉及以超高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法。
【专利说明】一种检测畜禽毛发中抗病毒药物残留量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物残留检测领域，特别是一种定性和定量检测畜禽毛发中金刚烷 胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法。
【背景技术】
[0002] 金刚烷胺是由人工合成饱和三环癸烷的氨基衍生物，用于亚洲A型流感病毒的预 防和早期治疗，也用于治疗帕金森病引起的神经障碍和预防动物常见的病毒类疾病如禽流 感等。金刚乙胺是金刚烷胺类似物，也用于预防和治疗A型流感病毒感染，临床疗效优于金 刚烷胺，且不良反应小于金刚烷胺。病毒灵，通用名：吗啉胍，吗啉胍对多种病毒（包括甲型 H1N1流感、流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、腺病毒等）有抑制作用。用于流感、流 行性腮腺炎、水痘、疱疹、滤泡性结膜炎等的防治。2012年12月我国爆发"速生鸡"事件，曝 光鸡在饲养过程中被违规喂食利巴韦林、金刚烷胺等抗病毒药物。违禁抗病毒药物的滥用 不仅造成鸡肉风味和品质的下降，更会导致细菌耐药性的发生和药物残留，并通过食物链 影响人类健康和破坏生态平衡，造成严重不良后果。美国食品药物管理局（FDA)早于2005 年就禁止将人类抗病毒药物用于畜禽类；我国于2005年12月发布《关于清查金刚烷胺等 抗病毒药物的紧急通知》，禁止金刚烷胺等抗病毒药作为兽用药，但由于其价格低廉、效果 良好，仍有不法分子大量使用金刚烷胺等抗病毒药物用于动物疾病的预防和治疗。滥用抗 病毒药物会导致动物中毒，使病毒产生不同程度的耐药性，并诱发病毒产生变异，严重影响 了国家动物疫病防控工作。
[0003] 药物残留监测通常检测活体动物的尿液或血液样本，或者检测宰杀后动物的组织 样本，如肌肉、肝脏等。由于兽药残留检测的时滞性，同时兽药在生物组织中受到酶类等生 物大分子的作用，通常易于代谢而具有较高的清除率，因此有时追溯一些非正常的或非法 使用的兽药则变得困难。建立快速灵敏的检测方法和寻找可活体取样的检材一直是兽药残 留分析研究的两个重要方向。在过去的十几年间，人们从法医学检测人体头发中兴奋剂等 违禁药物得到启发，探讨并研究了动物毛发作为检材的可行性。由于动物毛发易采集、运 输，保存，更重要的是可以在宰前做出安全性评价的特点，毛发中缺少血液循环，缺少降解 药物的各种活性物质和快速的排泄途径，使得药物代谢缓慢而可在毛发中的保留时间远远 长于其他组织。与一般的组织样品（肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和肺脏等）相比，毛发不需要将 动物屠宰就可获得，较之前者简单、方便。另外，由于毛发的结构和成分特点以及较低的代 谢活性，决定了药物进入毛发后在其中保留时间久，可作为长期检测样本，这是尿液或血液 无法比拟的，尤其对于半衰期较短的药物，如金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍等，在经过一定 时间的休药期后，从食用组织或血、尿中已无法检出药物残留证明是否使用过此禁用药物， 而毛发因药物在其中代谢缓慢，在较长一段时间内仍可作为检测样本，提供违禁药物使用 证明依据。检测畜禽毛发中是否含有抗病毒类药物残留，从而达到从养殖源头控制禁用药 物使用的目的。因此，研究建立畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍药物残留的检测方 法，对于有效监控该类药物的使用、保障我国动物性食品安全具有重要的意义。
[0004] 我国对金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留的检测方法研究相对较少，也未曾制 定国家标准和行业标准，仅有一个地方标准"DB32/T1163-2007.鸡肝中金刚烷胺残留检 测--液相色谱-串联质谱法"，文献方法有气相色谱法（GC)、液相色谱法（LC)及液相色 谱-串联质谱法（LC-MS/MS)。这些方法多应用于血液、医药和动物组织中金刚烷胺类药物 的测定，而畜禽毛发中抗病毒类药物残留量的检测方法未见报道。
[0005] 本发明与已有文献和专利相比，具有更高的回收率和更低的检测限及定量限，表 现为如下几点 ：
[0006] 1、首次对畜禽毛发中抗病毒类药物进行检测。
[0007] 2、空白猪毛和鸡毛添加浓度为2. 0、10. 0、100. 0 μ g/kg时，金刚烷胺方法的平 均回收率为89. 5%?108%，日内相对标准偏差为1.58%?3. 46%，日间相对标准偏差 为3. 85%?7. 48% ;金刚乙胺方法的平均回收率为86. 6%?107%，日内相对标准偏差 为2. 11 %?4. 51%，日间相对标准偏差为3. 27%?7. 67% ;吗啉胍方法的平均回收率为 85. 3%?102%，日内相对标准偏差为2. 94%?3. 74%，日间相对标准偏差为3. 95%? 7. 80%。
[0008] 3、采用内标法定量，金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍的检出限（L0D)均达0. 5 μ g/ kg，定量限（L0Q)均达 2. 0 μ g/kg。
[0009] 超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography\UPLC)是分离科 学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC(高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填 料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容 量。目前，超高效液相色谱仪已经开始逐渐地投入液相实验中。
[0010] 超高效液相色谱仪优点：
[0011] 超高效液相色谱法的原理与高效液相色谱法基本相同，所改变的地方有以下几 占·
[0012] (1)小颗粒、高性能微粒固定相的出现。高效液相色谱的色谱柱，例如常见的十八 烧基娃胶键合柱，它的粒径是5um，而超高效液相色谱的色谱柱，会达到3. 5um，甚至1. 7um。 这样的孔径更加利于物质分离。
[0013] (2)超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自 然成倍增大。故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵。
[0014] (3)高速采样速度的灵敏检测器。
[0015] (4)使用低扩散、低交叉污染自动进样器。配备了针内进样探头和压力辅助进样技 术；
[0016] (5)仪器整体系统优化设计。色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分 析方法与高效液相分析方法的自动转换。
[0017] 与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1. 7 倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。
[0018] 如今，超高效液相色谱仪主要应用于
[0019] (1)药物分析如天然产物中复杂组分的分析
[0020] (2)生化分析如蛋白质、多肽、代谢组学等生化样品
[0021] (3)食品分析如食品中农药残留的检测
[0022] (4)环境分析如水中微囊藻毒素的检测
[0023] (5)其他如化妆品中违禁品的检测
[0024] 超高效液相色谱方法的突出优点体现在节省分析时间和溶剂用量上，尤其对基 质复杂的痕量组分测定采用该方法以提高分析通量是今后发展的必然趋势。
[0025] 三重四极杆串联质谱工作原理：
[0026] 化合物分子在真空条件下受电子流的"轰击"或强电场等其他方法的作用，电离成 离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带正电荷的离子，这些离子 按质荷比（m/z)的大小被收集并记录的图谱。
[0027] 电喷雾电离（ESI):
[0028] 样品溶液在电场的作用下形成带高度电荷的雾状小液滴，在向质量分析器移动的 过程中，液滴因溶剂不断挥发而缩小，导致表面电荷密度不断增大，当电荷之间的排斥力足 以克服液滴的表面张力时，液滴发生裂分，如此反复进行，最后得到带单电荷或多电荷的离 子。
[0029] 三重四极杆串联质谱优点：
[0030] (1)不需进行衍生化。
[0031] (2)在单个分析中实现确认定量。
[0032] (3)在复杂很脏的基体中的低检测限。
[0033] (4)提高实验室效率/产出率（使用固相萃取技术）。
[0034] (5)更可靠和可值得信赖的测试结果。
[0035] (6)质量范围：5_1200amu
[0036] (7)分辨率：彡 0· 4Da
[0037] ⑶灵敏度高
[0038] (9)定量重现性好
【发明内容】
[0039] 本发明的目的在于提供了一种简便、快速、灵敏、准确且经济的检测畜禽毛发中金 刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法。
[0040] 本发明包括下列步骤：
[0041] a.取适量畜禽毛发试样，清洗并剪碎；
[0042] b.称取制备好的试样；
[0043] c.加入D15-金刚烷胺标准工作液，0. 2mol/L HCI溶液消解后用2. 0%三氯乙酸水 溶液+乙腈（1 :2V/V)溶液提取，加入氯化钠分层；
[0044] d.提取液于60°C下氮气吹干，用2%甲酸水溶液定容，待净化处理；
[0045] e.待净化液过MCX柱；
[0046] f.设定超高效液相色谱-电喷雾串联质谱条件；
[0047] g.净化液供超高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定；
[0048] h.数据处理与分析。
[0049] 本发明以超高效液相色谱-电喷雾串联质谱作为检测的基本原理，现代超高效液 相色谱-电喷雾串联质谱系统配置有化学工作站、计算机和软件系统在内的数据采集与处 理系统，可检测畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法。
[0050] 超高效液相色谱-电喷雾串联质谱分为两个步骤：数据采集与数据处理。储液器 中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固 定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动 时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分 离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪， 数据以图谱形式打印出来。
[0051] 标准溶液的配置：
[0052] 标准储备液：称取适量金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍标准品，用甲醇分别配制成 1. Omg/mL的标准储备液，于-18°C下避光储存。
[0053] 标准中间液：取上述标准储备液各lmL，用甲醇分别稀释成质量浓度为10. Omg/L 的标准中间液，于-18°C下避光储存。
[0054] 标准混合工作液：取上述标准中间液各lmL，用甲醇稀释成质量浓度为1. Omg/L的 标准混合工作液，于-4°C下避光储存。
[0055] D15-金刚烷胺标准工作液：称取适量D15-金刚烷胺标准品，用甲醇配制成1. Omg/ mL的标准储备液，然后用甲醇稀释成质量浓度为10. Omg/L的标准中间溶液，再用甲醇-水 (1:1)溶液稀释成质量浓度为200. 0 μ g/L的标准工作液，于-4°C下避光储存。
[0056] 此法根据选择离子定性，内标法定量。配制金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍混合标准 溶液质量浓度为〇. 5、2. 0、5. 0、10. 0、20. 0、100. 0 μ g/L的系列标准溶液，分别加入D15-金 刚烷胺标准工作液10. 〇 μ g/L进行测定，以定量离子峰面积（y)对浓度（X，μ g/L)做标准 曲线。结果显示，金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍在0. 5?100. 0 μ g/L范围内的线性关系良 好（r2 > 0. 999)。取空白猪毛和鸡毛样品，添加不同质量浓度的金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉 胍混合标准溶液，按照优化实验条件由高至低的质量浓度进行检测，直至信噪比等于3 (S/N =3)和信噪比等于10(S/N = 10)时，确定猪毛和鸡毛样品中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍 的检出限（L0D)均为0. 5 μ g/kg，定量限（L0Q)均为2. 0 μ g/kg。
[0057] 取空白猪毛和鸡毛样品，添加金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍混合标准溶液分别为 2. 0、10. 0、100. 0 μ g/kg，然后按照本方法进行样品前处理和测定，每个添加水平测定6次， 日内精密度通过Id内测定3个加标水平下的6个平行样品得到，日间精密度为连续6d(每 天测定1次）测定3个加标水平下的样品得到，结果显示，金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍添 加浓度为2. 0、10. 0、100. 0 μ g/kg时，方法的平均回收率为85. 3%?108%，日内相对标准 偏差为2. 81 %?4. 51%，日间相对标准偏差为4. 65%?7. 80%。精密度和相对标准偏差 见表1和表2。
[0058] 表1空白猪毛中添加金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍日内和日间精密度及相对标准 偏差（η = 6)
[0059]
【权利要求】
1. 一种检测畜禽毛发中金刚烷胺、金刚乙胺和吗啉胍残留量的方法，其特征在于包括 以下步骤： a. 取适量畜禽毛发试样，清洗并剪碎； b. 称取制备好的试样； c. 加入D15-金刚烷胺标准工作液，0. 2mol/L HCI溶液消解后用2. 0%三氯乙酸水溶液 +乙腈（1:2 V/V)溶液提取，加入氯化钠分层； d. 提取液于60摄氏度下氮气吹干，用2%甲酸水溶液定容，待净化处理； e. 待净化液过MCX柱； f. 设定超高效液相色谱-电喷雾串联质谱条件； g. 净化液供超高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定； h. 数据处理与分析。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用自来水洗出猪毛可见杂质，毛发于 l%SDS+5%吐温80+纯水（1 :1 :1)超声15分钟，蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发50°C 干燥，放干燥器中备用； 用剪刀剪碎成1-2 mm，称取毛发0. 5g于50mL离心管中，加入D15-金刚烷胺标准工作 液50. 〇μ?，0. 2mol / L HCI溶液5 mL，混匀后65°C消解2小时，取出，加入8mL 2. 0%三氯 乙酸水溶液+乙腈（1:2)，润旋30 s，超声提取30min后加入2g氯化钠，润漩混勻2 min, 5000 r/min离心10 min，取上清液于另一管中，60°C下用氮气吹干后，加入3 mL2%甲酸水 溶液溶解，溶解液加载至已依次用3 mL甲醇、3 mL水活化过的MCX柱中，再依次用3 mL2% 的甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗，减压抽干，用3 mL5%的氨水甲醇溶液（体积比）洗脱；洗脱 液在60°C下用氮气吹干后，用1 mL V(0. 1%甲酸水溶液）：V (甲醇）=90 :10的溶液溶解残 渣，涡旋30 s，经0. 22 mm滤膜过滤后，上机测定； 设定液相色谱条件为： 色谱柱：Eclipse Plus C18 (RRHD 1.8 Mm，2.1X100 mm);流动相 A 为 0.1% 甲酸水溶 液；B为甲醇；梯度洗脱程序：0?3· 0 min，2%?5%Β ;3· 0?5· 0 min，5%?90% Β ;5· 0?5· 1 min， 90%Β?2%Β ; 5· 1 ?7· 0 min，维持 2% Β ;流速(λ 25 mL/min ;柱温 30°C ;进样体积：5. 0 μ? ; 质谱条件：电离模式：电喷雾电离正离子模式（ESI + );检测方式：多反应监测（ MRM);毛细管电压：4 000 V;离子源温度（TEM) :325 °C ;干燥气温度：300 °C ;干燥气流 量：15 L/min ;雾化气压力：50 psi ;鞘气温度：400 °C ;鞘气流量：12 L/min ;。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用自来水洗出鸡毛可见杂质，毛发于 l%SDS+5%吐温80+纯水（1 :1 :1)超声15分钟，蒸馏水冲洗干净，用滤纸吸干；将毛发50°C 干燥，放干燥器中备用； 用剪刀剪碎成1-2 mm，称取毛发0. 5g于50mL离心管中，加入D15-金刚烷胺标准工作 液50. 〇μ?，0. 2mol / L HCI溶液5 mL，混匀后65°C消解2小时，取出，加入8mL 2. 0%三氯 乙酸水溶液+乙腈（1:2)，润旋30 s，超声提取40min后加入2g氯化钠，润漩混勻2 min, 5000 r/min离心10 min，取上清液于另一管中，60°C下用氮气吹干后，加入3 mL2%甲酸水 溶液溶解，溶解液加载至已依次用3 mL甲醇、3 mL水活化过的MCX柱中，再依次用3 mL2% 的甲酸水溶液、3 mL甲醇淋洗，减压抽干，用3 mL5%的氨水甲醇溶液（体积比）洗脱；洗脱 液在60°C下用氮气吹干后，用1 mL V(0. 1%甲酸水溶液）：V (甲醇）=90 :10的溶液溶解残 渣，涡旋30 s，经0. 22 mm滤膜过滤后，上机测定； 设定液相色谱条件为： 色谱柱：Eclipse Plus C18 (RRHD 1. 8 Mm，2. IX 100 mm);流动相 A 为 0· 1% 甲酸水溶 液；B为甲醇；梯度洗脱程序：0?3· 0 min，2%?5%Β ;3· 0?5· 0 min，5%?90% Β ;5· 0?5· 1 min， 90%Β?2%Β ; 5· 1 ?7· 0 min，维持 2% Β ;流速(λ 25 mL/min ;柱温 30°C ;进样体积：5. 0 μ? ; 质谱条件：电离模式：电喷雾电离正离子模式（ESI + );检测方式：多反应监测（ MRM);毛细管电压：4 000 V;离子源温度（TEM) :325 °C ;干燥气温度：300 °C ;干燥气流 量：15 L/min ;雾化气压力：50 psi ;鞘气温度：400 °C ;鞘气流量：12 L/min。
【文档编号】G01N30/88GK104155398SQ201410414448
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月21日 优先权日:2014年8月21日
【发明者】罗林广, 胡丽芳, 张大文, 廖且根, 霍俊宏 申请人:江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所