汞离子检测试剂盒及汞离子检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种汞离子检测试剂盒及汞离子检测方法。该试剂盒包含：金纳米粒子，用以与Hg2+结合而形成辣根过氧化物模拟酶；单链核酸，用以与所述金纳米粒子结合而增强所述辣根过氧化物模拟酶的催化活性；辣根过氧化物酶的特征底物；以及，辅助试剂，包含在以所述辣根过氧化物模拟酶催化所述氧化特征底物时所需的柠檬酸钠缓冲溶液。该检测方法主要依据该试剂盒实施。利用本发明的试剂盒及方法，可实现对于Hg2+的高灵敏检测，包括：对Hg2+检测的线性范围为10-1000nM，灵敏度可达到3.0nM，并具有简便快速、成本低，稳定性高等优点，可应用于环境、食品等样品中Hg2+的检测。
【专利说明】汞离子检测试剂盒及汞离子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明特别涉及一种利用单链核酸提高纳米金-汞离子模拟酶的稳定性及将之 应用于汞离子检测的方法，属于纳米科技领域。
【背景技术】
[0002] 酶是一类生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质。可以在适宜的环境中催化化学 反应，但是由于酶固有的特性，其应用也受到了一些限制，比如蛋白酶容易变性和水解，而 且高成本和严格的使用条件也限制了它们的应用。因此，开发一种具有类似催化活性的模 拟酶尤为重要。模拟酶是一类非蛋白结构但与天然酶有相似催化性能的人工合成催化剂。 自2007年阎锡蕴研究小组首次发现磁性四氧化三铁纳米粒子（Fe 304NPs)具有内在的过氧 化物模拟酶特性以来，纳米粒子作为模拟酶的研究备受人们关注，相继开展了诸如C 〇Fe204、 Fe203、FeS等磁性纳米粒子、二氧化铺纳米粒子、金属纳米粒子、碳纳米材料等纳米微粒模拟 酶的相关研究工作。与天然酶相比，模拟酶的制备、纯化和储存都比较容易，且价格低廉，能 够在比较苛刻的化学环境中使用。因此，开发纳米模拟酶具有很高的应用前景。
[0003] 纳米金粒子具有较弱的类辣根过氧化物酶的催化活性，在纳米金表面沉积Hg2+ 后，能大大提高其模拟过氧化物酶活性，基于此原理可以发展Hg2+的检测方法。但是，由于 Au/Hg 2+纳米合金对检测样品中的离子浓度耐受较低，因此，在Au/Hg2+纳米模拟酶应用于实 际样品检测时，一般需要进行复杂的样品前处理去除高浓度的盐，这将限制Au/Hg 2+纳米模 拟酶的实际应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种汞离子检测试剂盒，其主要是基于高效稳定的纳 米材料模拟酶而构建，并可以简单、灵敏地检测Hg 2+，从而克服现有技术中的不足。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种汞离子检测方法，其能方便快速、低成本较、高灵 敏、高稳定性的实现Hg 2+比色检测。
[0006] 为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括： 一种汞离子检测试剂盒，包含： 金纳米粒子，用以与Hg2+结合而形成辣根过氧化物模拟酶， 单链核酸，用以与所述金纳米粒子结合而增强所述辣根过氧化物模拟酶的催化活性， 辣根过氧化物酶的特征底物， 以及，辅助试剂，包含在以所述辣根过氧化物模拟酶催化所述氧化特征底物时所需的 柠檬酸钠缓冲溶液。
[0007] 进一步的，所述辅助试剂还包含在将所述单链核酸与金纳米粒子连接时所需的氯 化钠溶液。
[0008] -种汞离子检测方法，包括如下步骤： (1)将纳米金溶液、单链核酸溶液与氯化钠溶液充分混合，室温下孵育30 min以上； (2) 取步骤（1)最终所获混合溶液，并分别依次加入辣根过氧化物酶的特征底物、一系 列不同浓度的标准Hg2+溶液和柠檬酸钠缓冲溶液，均匀混合形成混合反应体系，反应lOmin 以上，再分别测定各混合反应体系在可见光波段，优选在波长为650 nm处的吸光值，并获得 汞离子浓度-吸光值标准曲线； (3) 取步骤（1)最终所获混合溶液，并依次加入辣根过氧化物酶的特征底物、待测溶液 和柠檬酸钠缓冲溶液，均匀混合形成混合反应体系，反应lOmin以上，再测定该混合反应体 系在可见光波段，优选在波长为650 nm处的的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待 测溶液中的Hg2+浓度。
[0009] 进一步的，所述金纳米粒子的粒径优选为15-50 nm。
[0010] 进一步的，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值优选为4. 0-5. 0。
[0011] 进一步的，所述单链核酸可具有SEQ ID No. 1所示序列，但不限于此。
[0012] 进一步的，所述辣根过氧化物酶的特征底物可选自但不限于3, 4-二羟基苯乙酸， 四甲基联苯胺（TMB)，邻苯二胺（0PD)，2, 2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐 (ABTS) 进一步的，步骤（1)最终所获混合溶液中所含氯化钠的浓度优选为1.0-3. 0 M。
[0013] 进一步的，所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4. 0-5. 0。
[0014] 进一步的，步骤（2)或步骤（3)中所述混合反应体系内所述特征底物的浓度优选 为 0· 1 mM-10. 0 禮。
[0015] 与现有技术相比，本发明的优点至少在于：通过将单链核酸（ssDNA)与金纳米粒 子（AuNP)复合，大幅提升了 AuNP-Hg2+模拟过氧化物酶的催化活性，并基于此原理开发了高 灵敏的汞离子（Hg2+)检测方法，其对Hg 2+检测的线性范围为10-1000 nM，灵敏度可达到3.0 nM，具有简便快速、成本低，稳定性高等优点，可应用于环境、食品等样品中Hg2+的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017] 图1是本发明一典型实施方案之中一种ssDNA增强AuNPs-Hg2+模拟酶催化活性 原理图； 图2是本发明实施例1中在单链核酸存在（a)和不存在（b)时AuNPs-Hg2+过氧化物模 拟酶催化活性的吸收图谱； 图3是本发明实施例1中所获Hg2+浓度-吸光值标准曲线； 图4是本发明实施例1中对于不同金属离子的选择性测试图谱。
【具体实施方式】
[0018] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实 施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据 附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0019] 在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅 示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大 的其他细节。
[0020] 以下实施例1-2中，所涉及的原料，如金纳米粒子溶液、ssDNA及其它试剂均可通 过市售途径获取。其中，ssDNA的序列如下：5' - ATACTACCGAGG-3'。
[0021] 实施例1 (1) 取80 yL稀释好的柠檬酸钠还原法制备的平均粒径为15 nm的金纳米粒子(浓度 为6X ΙΟ-1。M)，10 μ L 2 μ Μ的ssDNA溶液和10 μ L的氯化钠溶液（1. 0 M)充分混合， 室温下孵育30 min。而后离心去除游离的所述寡核苷酸，而保留所述寡核苷酸与金纳米粒 子的复合物； (2) 将步骤（1)中的混合液10 μ L置于酶标板中，依次加入44 μ L 1. 1 mM的TMB溶 液、28 μ L 5 Μ的H202溶液、40 μ L不同浓度（O-lOOOnM)的Hg2+溶液、78 μ L柠檬酸檬酸 钠缓冲溶液（0.04 Μ，ρΗ 4. 5)，充分震荡混匀。测定混合溶液反应10 min时650 nm处的吸 光值。由此方法获得Hg2+的检测标准曲线如图3所示，检测灵敏度可达到3.0 nM，检测线 性范围为10-1000 nM。
[0022] (3)自来水中Hg2+的检测：将自来水经0. 22 μ m微孔过滤膜过滤，超纯水稀释一 倍。参照上述步骤（1)和（2)方法，以简单处理后自来水样品代替Hg2+溶液，即可完成自来 水中Hg 2+的检测。
[0023] 又及，参照步骤（1) - (3)的操作及基本相同的反应条件，但未在检测体系中加入 ssDNA时，对于Hg2+检测的情况进行了分析，结果可参阅图2中的曲线b。而相应的，在加入 ssDNA时，其检测结果可参考图2中的曲线a。
[0024] 另外，参照步骤（1) - (3)的操作及基本相同的反应条件，还对其它金属离子进行 了比对性的检测，其最终检测结果可参阅图4。
[0025] 实施例2 (1) 取80 μ L稀释好的柠檬酸钠还原法制备的平均为30 nm的金纳米粒子(浓度为 4 X 10_1Q M)，10 μ L 3 μ Μ的ssDNA溶液和10 μ L的氯化钠溶液（1. 0 M)充分混合，室温 下孵育30 min。而后离心去除游离的所述寡核苷酸，而保留所述寡核苷酸与金纳米粒子的 复合物； (2) 将步骤（1)中的混合液10 μ L置于酶标板中，依次加入44 μ L 1. 5 mM的TMB溶 液、28 μ L 5. 5 Μ的H202溶液、40 μ L不同浓度（O-lOOOnM)的Hg2+溶液、78 μ L柠檬酸檬 酸钠缓冲溶液（0.04 M，pH 3. 5)，充分震荡混匀。测定混合溶液反应10 min时650 nm处的 吸光值。依据本实例所获得Hg2+的检测结果，亦可得出与实施例1相近之标准曲线。
[0026] (3)自来水中Hg2+的检测：将自来水经0. 22 μ m微孔过滤膜过滤，超纯水稀释一 倍。参照上述步骤（1)和（2)方法，以简单处理后自来水样品代替Hg2+溶液，即可完成自来 水中Hg 2+的检测。
[0027] 需要指出的是，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟 悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范 围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种汞离子检测试剂盒，其特征在于包含： 金纳米粒子，用以与Hg2+结合而形成辣根过氧化物模拟酶， 单链核酸，用以与所述金纳米粒子结合而增强所述辣根过氧化物模拟酶的催化活性， 辣根过氧化物酶的特征底物， 以及，辅助试剂，包含在以所述辣根过氧化物模拟酶催化所述氧化特征底物时所需的 柠檬酸钠缓冲溶液。
2. 根据权利要求1所述的汞离子检测试剂盒，其特征在于所述金纳米粒子的粒径为 15_50 nm〇
3. 根据权利要求1所述的汞离子检测试剂盒，其特征在于所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH 值为 4 0-5.0。
4. 根据权利要求1所述的汞离子检测试剂盒，其特征在于所述单链核酸具有SEQ ID No. 1所示序列。
5. 根据权利要求1所述的汞离子检测试剂盒，其特征在于所述辣根过氧化物酶的特征 底物包括3, 4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2, 2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑 啉-6-磺酸）二胺盐。
6. -种汞离子检测方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将纳米金溶液、单链核酸溶液与氯化钠溶液充分混合，室温下孵育30 min以上； (2) 取步骤（1)最终所获混合溶液，并分别依次加入辣根过氧化物酶的特征底物、一系 列不同浓度的标准Hg2+溶液和柠檬酸钠缓冲溶液，均匀混合形成混合反应体系，反应lOmin 以上，再分别测定各混合反应体系在可见光波段的吸光值，并获得汞离子浓度-吸光值标 准曲线； (3) 取步骤（1)最终所获混合溶液，并依次加入辣根过氧化物酶的特征底物、待测溶液 和柠檬酸钠缓冲溶液，均匀混合形成混合反应体系，反应lOmin以上，再测定该混合反应体 系在可见光波段的吸光值，并与所述标准曲线对照，从而测得待测溶液中的Hg 2+浓度。
7. 根据权利要求6所述的汞离子检测方法，其特征在于步骤（1)最终所获混合溶液中 所含氯化钠的浓度为1. 0-3. 0 M。
8. 根据权利要求6所述的汞离子检测方法，其特征在于所述柠檬酸钠缓冲溶液的pH值 为 4. 0-5. 0。
9. 根据权利要求6所述的汞离子检测方法，其特征在于所述辣根过氧化物酶的特征底 物包括3, 4-二羟基苯乙酸、四甲基联苯胺、邻苯二胺或2, 2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑 啉-6-磺酸）二胺盐。
10. 根据权利要求6或9所述的汞离子检测方法，其特征在于步骤（2)或步骤（3)中所 述混合反应体系中所述特征底物的浓度为0. 1 mM-10. 0 mM。
【文档编号】G01N21/31GK104155252SQ201410419168
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】彭池方, 泮秋立, 刘春丽, 刘丽强 申请人:江南大学