一种基于荧光共振能量转移检测双酚a的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于荧光共振能量转移（FRET）检测环境激素中BPA的方法，属于分析化学领域，是采用有机荧光染料FAM作为FRET的供体分子、TAMRA作为FRET的受体分子，利用BPA适配体与BPA特异性结合的原理，利用荧光共振能量转移技术检测BPA的含量。该方法在BPA浓度为1.0×10-10-1.0×10-8mol/L范围内呈良好的线性，最低检测限可达7.0×10-11mol/L，其检测限大大低于国家卫生标准中对碳酸酯树脂和成型品中酚溶出量的要求，可准确测定水壶、水杯、奶瓶、食品容器等橡塑制品中BPA的含量。
【专利说明】一种基于荧光共振能量转移检测双酚A的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移检测BPA的方 法。
【背景技术】
[0002] 突光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，简称FRET)是处 于激发态的供体分子通过远程偶极作用将自身能力转移给近距离的处于基态的受体分子 的非辐射过程。受体分钟必须能吸收供体发射波长处的能量，故受体分子的激发波长必须 与供体分子的发射波长重叠。自 F5rster(F0rster T. Annals of Physics, 1948，2:55) 首次阐述了 FRET的机制以来，FRET广泛应用于核酸研究、蛋白质研究、细胞研究、免疫测定 等领域。
[0003] 核酸适配体（aptamer)，来源于拉丁文"aptus"，简称适配体，又称核酸适体或核 酸适配子，是一段由25-80个RNA或DNA碱基组成的寡核苷酸片段。适配体可以与目标物 通过适应性折叠相结合，形成发卡（hairpin)、假结（pseudoknot)、凸环（bulge)、G-四链 体（G-quartet)等特殊的三维结构。自从 1990 年 Tuerk 等（Tuerk C·，Gold L. Science 1990，249，505)首次利用指数富集系统进化的体外筛选技术（SELEX)筛选出噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA型适配体以来，适配体的研究工作得到了快速发展。仅1999年，NeXstar Pharmaceuticals公司和Colorado大学就筛选出超过100种的适配体。Ellington小组已 经创建了一个适配体数据库，里面包含了适配体的详细信息。
[0004] 双酚4化18?1^11〇14，简称8?4)全名2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，用于合成聚碳 酸酯和环氧树脂等材料，也可用作酚醛树脂、可塑性聚酯、抗氧剂及聚氯乙烯的稳定剂，被 广泛用于制造婴儿奶瓶、厨房用具及医疗设备。已有研究表明，BPA有模拟雌激素的效果，是 一种环境激素，可通过包装材料进入食品和饮料中，导致人体内分泌失调，威胁胎儿和儿童 健康，还可能与癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖有关。因此，建立一种操作简便、灵敏度高 的BPA检测方法是十分必要的。本发明利用荧光共振能量转移技术，采用有机荧光染料羟 基荧光素（FAM)作为FRET的供体分子、羧基四甲基罗丹明（TAMRA)作为FRET的受体分子， 利用BPA适配体与BPA特异性结合的原理，可准确测定样品中BPA的含量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，该检测方法 对BPA的检测灵敏度高、特异性好，在1. OX OX 10_8 mol/L浓度范围内对BPA的检 测呈现良好的线性，最低检测限为7. OX 10_n mol/L，可实现BPA的快速、准确测定。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，是基于BPA适配体与BPA特异性结合的 原理，利用荧光共振能量转移检测BPA的含量； 包括以下步骤： 1) 将DNA以8000 r/min的转速离心5 min后，加入50 mmol/L、pH值为7· 4的BR缓 冲液中充分振荡5-10 min，放入4°C冰箱备用； 2) 将步骤1)中的DNA加入到50 mmol/L、pH值为7. 4的BR缓冲液中，再加入Dl、T1 和T2,杂交反应2 h ; 3) 检测步骤2)反应后溶液的荧光信号，记为初始荧光信号值匕； 4) 向步骤3)检测后的溶液中加入待测溶液，特异性结合10 h ; 5) 检测步骤4)反应后溶液的荧光信号,记为反应荧光信号值F ; 6) 根据BPA浓度与荧光强度变化值的线性方程计算出BPA的浓度，进而得出待测溶液 中BPA的含量。
[0007] 步骤2)加入DNA后，BR缓冲液中DNA的浓度为1. 0X 10_7 mol/L。
[0008] 步骤 2)所述 D1 为 BPA 适配体探针，其序列为：5' - TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTG GATTTTTTATTTCTGGGGTTCAGTTCTTTTTTGT-3' （SEQ ID N0:1)。
[0009] 步骤2)所述T1为BPA适配体互补链1探针，其序列为： 5' -FAM-ATCCAGAAACGCGAACGA-3' （SEQ ID N0:2)。
[0010] 步骤2)所述T2为BPA适配体互补链2探针，其序列为： 5'-TAMRA-AACTGAACCCCAGAAAT-3' （SEQ ID N0:3)。
[0011] 突光信号检测所用突光分光光度仪的设定参数为：激发波长为485 nm，发射波长 为500 - 650 nm，入射狭缝为10 nm，发射狭缝为10 nm，光电倍增管电压为700 V。
[0012] 本发明的显著优点为： (1)本发明的操作步骤简单、特异性强、灵敏度高、成本低，实用性强，对BPA的最低检 测限为7. 0ΧΚΓ11 mol/L，大大低于国家卫生标准中对碳酸酯树脂和成型品中酚溶出量的 要求，可准确测定样品中BPA的含量。
[0013] (2)本发明所建立基于荧光共振能量转移检测BPA的荧光分析检测方法，操作简 便、检测限低，能够实现水壶、水杯、奶瓶、食品容器等橡塑制品中BPA的在线检测，且对检 测物质不造成破坏。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为本发明基于荧光共振能量转移检测双酚A的原理图。
[0015] 图2为本发明各反应溶液荧光谱图。
[0016] 图3为本发明实施例标准溶液的工作曲线。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0018] 本实施例所需仪器及试剂溶液如下：Fluorescence spectrophotometer (型号规 格：cary eclipse ;设备编号：EL02065703, Varian美国），精密酸度计(上海大普仪器有限 公司），三孔电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司），石英比色皿(江苏金坛市新航仪 器厂）；BPA、DNA (上海生工生物工程技术服务有限公司）。
[0019] BPA 适配体探针 D1 的序列：5' - TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTGGATTTTTTATTTCTGGG GTTCAGTTCTTTTTTGT-3,； BPA 适配体互补链 1 探针 T1 的序列：5' - FAM-ATCCAGAAACGCGAACGA-3 ; BPA 适配体互补链 2 探针 T2 的序列：5' -TAMRA-AACTGAACCCCAGAAAT-3'。
[0020] 一种基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，是基于BPA适配体与BPA特异性结 合的原理，利用荧光共振能量转移检测BPA的含量；包括以下步骤： 1) 将DNA以8000 r/min的转速离心5 min后，慢慢打开管盖，加入50 mmol/L、pH值 为7. 4的BR缓冲溶液后再盖上管盖，充分振荡10 min后，放入4°C冰箱备用； 2) 将 5μ L 6· 0ΧΚΓ6 mol/L 步骤 1)中的 DNA力口入至IJ 300μ L 50 mmol/L、pH值为 7. 4 的BR缓冲液中，再分别加入5yL 6.0X10_6 mol/L的T1、T2和D1，杂交反应2 h ; 3) 检测步骤2)反应后溶液的荧光信号，记为初始荧光信号值匕； 4) 用无水乙醇配制浓度为1. ΟΧ ΚΓ5 mol/L的BPA母液，再用二次水稀释母液得到浓 度依次为 1. ΟΧΚΓ'5. ΟΧΚΓ'Ι. 0Χ1(Γ9、5· OXlO'l. 0ΧΚΓ8 mol/L 的 BPA 标准溶液； 5) 向步骤3)检测后的溶液中分别加入步骤4)所配制的含BPA浓度为1. ΟΧ 1(Γ1(Ι、 5· ΟΧΚΓ'Ι. 0Χ1(Γ9、5· OXlO'l. 0Χ1(Γ8 mol/L 的标准溶液，特异性结合 10 h ; 6) 分别检测步骤5)反应后溶液的荧光信号，记为反应荧光信号值F ; 7) 根据BPA浓度与荧光强度变化值绘制标准溶液工作曲线，得出线性方程； 8) 将待测样品洗净、晾干，按2ml/cm2的比例加入蒸馏水，100°C浸泡30min后冷却至室 温，补水至原浸泡体积作为待测溶液；测定待测溶液的荧光信号值后，根据步骤7)得出的 BPA浓度对数值与荧光强度变化值的线性方程计算出待测溶液中BPA的浓度，进而得出待 测样品中BPA的含量。
[0021] 突光信号检测所用突光分光光度仪的设定参数为：激发波长为485 nm，发射波长 为500 nm，入射狭缝为10 nm，发射狭缝为10 nm，光电倍增管电压为700 V。
[0022] 从图2可以看出，当BPA适配体探针D1与BPA适配体互补链探针ΤΙ、T2结合后， 溶液荧光强度较低；当BPA与BPA适配体探针特异性结合反应完全后，BPA适配体互补链探 针ΤΙ、T2游离出来，使荧光强度显著增强，通过荧光分光光度计可准确测定其荧光信号值。
[0023] 从图3可以看出，BPA浓度和荧光强度变化值的线性方程为： Δ F=0. 2493+0. 0203X, R=0.9986 ； 其中AF=F -FQ:FQ为T1、T2与D1杂交后580 nm下的荧光强度与520 nm下的荧光 强度之比，F为加入BPA反应10 h后580 nm下的荧光强度与520 nm下的荧光强度之比，X 为BPA浓度的对数值，浓度单位为mol/L。
[0024] 利用本实施例的检测方法对奶瓶和PC塑料瓶中BPA的含量进行测定，结果见表1。
[0025] 表1不同样品中BPA含量的测定结果
【权利要求】
1. 一种基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，是基于BPA适配体与BPA特异性结合 的原理，利用荧光共振能量转移检测ΒΡΑ的含量；包括以下步骤： 1) 将DNA以8000 r/min的转速离心5 min后，加入50 mmol/L、pH值为7. 4的BR缓 冲液中充分振荡5-10 min，放入4°C冰箱备用； 2) 将步骤1)中的DNA加入到50 mmol/L、pH值为7. 4的BR缓冲液中，再加入Dl、T1 和T2,杂交反应2 h ; 3) 检测步骤2)反应后溶液的荧光信号，记为初始荧光信号值匕； 4) 向步骤3)检测后的溶液中加入待测溶液，特异性结合10 h ; 5) 检测步骤4)反应后溶液的荧光信号,记为反应荧光信号值F ; 6) 根据BPA浓度与荧光强度变化值的线性方程计算出BPA的浓度，进而得出待测溶液 中BPA的含量。
2. 根据权利要求1所述基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，其特征在于：步骤2) 加入DNA后，BR缓冲液中DNA的浓度为1. ΟΧ ΚΓ7 mol/L。
3. 根据权利要求1所述基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，其特征在于：步骤2) 所述 D1 为 BPA 适配体探针，其序列为：5' -TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTGGATTT TTTATTTCT GGGGTTCAGTTCTTTTTTGT-3'。
4. 根据权利要求1所述基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，其特征在于：步骤2) 所述T1为BPA适配体互补链1探针，其序列为：5' - FAM-ATCCAGAAACGCGAACGA-3。
5. 根据权利要求1所述基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，其特征在于：步骤2) 所述T2为BPA适配体互补链2探针，其序列为：5' -TAMRA-AACTGAACCCCAGAAAT-3'。
6. 根据权利要求1所述基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，其特征在于：荧光信 号检测所用荧光分光光度仪的设定参数为：激发波长为485 nm，发射波长为500 - 650 nm， 入射狭缝为10 nm，发射狭缝为10 nm，光电倍增管电压为700 V。
【文档编号】G01N21/64GK104155278SQ201410430253
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】李小晶, 唐熙, 戴金兰, 吕水源, 陈旻实, 卢丽君 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心