利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶组织的化学染色方法
【专利摘要】本发明涉及利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶组织的化学染色方法，通过制片标本常规冰冻连续切片，滴加反应液后载玻片置于37℃水浴箱中10min，观察反应液由黄色变微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后PBS冲洗终止反应，伊红衬染10S，PBS冲洗，水性封片剂Clear?mount封片，完全干燥后可用中性树胶再次封片，双重染色NADPH-d的快速组织学染色完成后，自来水冲洗5min，采集图像，全部数据采用软件进行统计学处理。本发明技术方案法流程简单，无需水化、脱水等流程，而仅需在37℃条件下反应，5～10min内即出结果。
【专利说明】利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶组织的化学染色方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物染色【技术领域】，具体涉及一种还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶化学染色方法。
【背景技术】
[0002]先天性巨结肠(HD)是一种儿童常见的消化道发育畸形，可以引起婴儿肠梗阻和慢性便秘，在我国的发病率约为1:5000,为小儿外科最常见的先天性畸形之一,一般而言，在手术中根据术者经验及肠管的大体观察去判断病变段肠段范围，如术中行快速冰冻切片HE染色，遇到不典型病例或病理科医师经验不足，明显会影响肠管切除范围的判定，导致手术效果不佳，部分患儿还有反复的便秘或大便失禁，需再次手术切除剩余部分病变肠管，严重影响患儿的生活质量。
[0003]目前研究较多的术中快速诊断方法有:冰冻切片HE染色法、AchE染色、LDH染色法，但都不甚理想。如前所述，HE染色法可以观察肠壁有无神经节细胞的存在，神经纤维有无异常增生，如果全部切片都未见神经节细胞，则可诊断为HD。但小儿的神经节细胞发育是一个逐渐成熟的过程，尤其在新生儿时期，发育更是不成熟，故HE染色对于识别发育未成熟、结构不典型的神经节细胞有一定难度，因此经验在诊断上特别重要，直接影响诊断的准确率。与此相反，NADPH-d的快速染色法对于神经节细胞具有高识别性，Montedonico等认为特别适合诊断新生儿期HD。另外HE染色流程中需固定、脱水等较多步骤，耗时长。在HD病变段肠管中，AchE活性异常升高，通过AchE染色显色反应可看到胆碱能神经纤维大量增生，过去该流程要花费数小时，影响术中快速诊断的应用。Kobayashi等改进了新方法，使染色时间缩短到6min，使术中快速诊断成为可能。但AchE既存在于胆碱能神经元也存在于非胆碱能神经元，假阳性率高，且在新生儿中易出现假阴性，所以目前较少单纯用AchE染色来诊断HD。有报道称HE法和AchE染色两者结合可以更好诊断HD，但增加了大量操作步骤及时间，不利于术中快速诊断。至于LDH染色法，因能在神经节细胞中形成蓝紫色颗粒状淀物，有时候也能判断出无神经节细胞肠段的范围，但这种酶对神经节细胞及神经纤维缺乏特异性，而且一般要联合应用AchE染色，故不建议用于巨结肠的诊断。
【发明内容】
[0004]本发明只对现有技术存在的问题，旨在提供一种快速准确的染色方法，一种利用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶的化学染色方法。
[0005]本发明通过以下技术方案实现:
[0006]利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶NADPH-d组织的化学染色方法，其通过以下步骤完成:
[0007]I)制片标本常规冰冻连续切片,片厚4 μ m，多聚赖氨酸载玻片处理切片。
[0008]2) NADPH-d的快速组织学染色方法反应液组成:ImL0.lmol/L PB, pH8.0溶液中加入0.5mg NADPH-d,0.6mg氯化硝基四氮唑蓝ΝΒΤ、10 μ L 二甲基亚砜、3 μ L聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。反应液37°C提前预热，滴加反应液后载玻片置于37°C水浴箱中lOmin，观察反应液由黄色变微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后PBS冲洗终止反应，伊红衬染10S，PBS冲洗，水性封片剂Clear mount封片，完全干燥后可用中性树胶再次封片。
[0009]3)双重染色NADPH-d的快速组织学染色完成后，自来水冲洗5min，采集图像。
[0010]4)对数据进行统计学处理。
[0011]本发明的有益效果为:l)NADPH-d法流程简单，无需水化、脱水等流程，而仅需在37°C条件下反应，5?1min内即出结果；2)NADPH — d阳性切片经抗原修复后再用肠神经特异性单克隆TUJ-1验证，两者阳性神经丛及细胞分布一致，说明NADPH — d阳性神经节细胞即肠神经节细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是扩张段的NADPH-d的快速组织学染色；
[0013]图2是扩张段肌间神经丛及神经节细胞；
[0014]图3是狭窄段NADPH-d的快速组织学染色；
[0015]图4是狭窄阶段HE染色；
[0016]图5是扩张段NADPH-d阳性神经丛及神经节细胞。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0018]实施例1
[0019]材料与方法:
[0020]I)标本及分组本研究所用标本均取自手术中切除肠管，并经伦理委员会批准。自2008至2011年37例HD患儿术中切除的结肠，其中男27例，女10例，年龄5?19个月，平均11.6个月。分扩张段、移形段、狭窄段，制片后分批超低温冰箱保存，以非HD结肠造瘘切除标本作为阳性对照。分NADPH-d快速染色法组、冰冻切片HE染色法组。
[0021]2)制片标本常规冰冻连续切片，片厚4 μ m，多聚赖氨酸载玻片贴片，取奇数切片做NADPH-d的快速组织学染色，偶数切片做冰冻切片HE染色。
[0022]3) NADPH-d的快速组织学染色方法反应液组成:ImL0.1moI/LPB (pH8.0)液中加入0.5mg NADPH-d (Sigma) >0.6mg NBT (Sigma)、10 μ L 二甲基亚砜(苏州正兴化工研究院)、3uL Triton X_100 (北京拜尔迪生物公司)。滴加反应液后载玻片置于37°C水浴箱中lOmin，观察反应液由黄色变微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后PBS冲洗终止反应，水性封片剂封片。阴性对照:反应液中不加入NADPH-d。阳性对照:已知阳性组织(结肠造瘘切除标本)同时进行染色。
[0023]4)冰冻切片HE染色方法冰冻切片切好后，室温下干燥。4%多聚甲醛固定5min，蒸馏水洗2min，苏木素染(37°C)lmin，自来水冲洗5min，95%乙醇5s，伊红染液20?30s，70%乙醇洗2次，95%酒精30s，100%酒精30s，95%酒精2道每次30s，100%酒精2道每次30s，100%二甲苯2道，第一道lOmin，第二道5min，中性树胶封片后镜下观察。双重染色NADPH-d的快速组织学染色完成后，自来水冲洗5min，采集图像后再行冰冻切片HE染色，完成后相同条件下再次采集图像，存档后观察比较。
[0024]5)观察指标光镜下观察:①扩张段肌间神经丛着色情况，神经节细胞是否可轻易识别，与背景有无强烈反差。②移行段结果:神经丛、神经节细胞在数量、大小、分布范围与扩张段相比如何。③狭窄段有无阳性神经节细胞分布，背景着色情况。
[0025]6)统计学处理方法全部数据采用SPSS forwindowsl3.0软件进行统计学处理,两种不同处理组间比较采用配对X2检验，以P〈0.05为差异有统计学意义。
[0026]结果:
[0027]a.扩张段扩张段经冰冻切片HE染色后，30min内出结果，镜下肌间神经丛、神经节细胞隐约可见，背景组织细胞极多，故反差不大，若无丰富的经验积累，即使病理科医师也较难在短时间内分辨出神经节细胞，准确判断术中结肠切缘是否已达正常肠段。与此相反的是NADPH-d的快速组织学染色，滴加反应液后1min内出结果，背景清晰；低倍镜下可见环肌和纵肌之间丰富的神经丛，呈串珠状分布(见图1)，高倍镜下可见大量神经节细胞，其胞浆着紫色，胞核空白无着色(见图2)。为判断神经丛所处位置及与冰冻切片HE染色结果进行比对，故对原先NADPH-d处理的切片采集图像后再进行快速HE染色，结果证实原先串珠状分布的紫色组织，即为肌间神经丛；高倍镜下可清楚分辨核大、深染、胞质略呈嗜碱性的神经节细胞。
[0028]b.移行段低倍镜下可见少数着色神经丛，神经丛之间距离较大，分布较扩张段明显稀疏，高倍镜下神经节细胞可清楚分辨，但每个神经丛内节细胞数量及大小远不如扩张段。移行段双重染色后可证实沿肌间分布的神经丛，与单用NADPHd快速染色结果相符。
[0029]c.狭窄段狭窄段NADPH-d的快速组织学染色，镜下见背景清晰，无任何着色，未见神经丛及阳性神经节细胞(见图3)。快速HE染色，可见肌间杂乱分布的肥大神经纤维束，无任何阳性神经节细胞(见图4)，背景组织细胞繁多，不易判断结果。
[0030]d.两种方法诊断结果比较:快速NADPH-d法和HE法配对比较37例，结果NADPH-d法2例阴性，HE法有3例阴性，经统计学分析，两种方法阳性率差异无统计学意义(Ρ>0.05)，具体见表I。
[0031 ] 表I快速NADPH-d法和HE法结果比较(η = 37)
[0032]
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[0033]实施例2
[0034]材料与方法:
[0035]I)标本来源标本均取自于2009年I月一 2012年12月本院18例HD患儿巨结肠根治术术中切除的结肠，患儿男11例，女7例，年龄3?16个月，平均(8.6±3)月。标本分扩张段、移形段和狭窄段，肠管横切面常规冰冻切片，片厚4 μ m，多聚赖氨酸载玻片贴片，制片后分批超低温冰箱保存。随机奇数切片做NADPH — d法快速染色，偶数切片做Ache法染色。所用标本经医院伦理委员会批准同意。
[0036]2)改良NADPH — d酶组织化学反应:反应液由ImL0.1moI/LPB液(pH8.0)中加入
0.5mg NADPHd(Sigma)、10μ L二甲基亚砜(苏州正兴化工研究院)、0.6mg NBT(Sigma)、3μ LTriton X-1OO (北京拜尔迪生物公司)组成。反应液37°C提前预热，滴加反应液后再置于37°C水浴箱中5?lOmin，观察反应液由澄黄色变为微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后PBS冲洗终止反应，伊红衬染10S，PBS冲洗，水性封片剂Clear mount封片，完全干燥后可用中性树胶再次封片。
[0037]3)改良Ache酶组织化学反应:反应液由0.lmol/L醋酸缓冲液(pH5.8)6.5mL,碘化乙酰硫代胆碱5mg (Sigma), 0.lmol/L枸橼酸钠0.5mL, 5mmol/L六氰基铁酸钾ImL(Sigma)，0.25mol/L硫酸铜溶液0.2mL(Sigma)组成。反应液37°C预热，置入切片完全浸入，光镜下观察到黏膜下增生紊乱的神经丛后停止反应，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0038]4) HE染色方法:冰冻切片室温下干燥，固定，PBS洗2min，苏木素染(37°C ) I min,PBS冲洗，95%乙醇5S，伊红染20?30S，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0039]5)蛋白基因产物9.5 (protein gene product9.5,PGP9.5)免疫组织化学法:切片固定后加入封闭液lh，兔抗人多克隆一抗PGP9.5 (北京中杉)，工作浓度1:200，置于4°C冰箱过夜，PBS冲洗，加入相应二抗30min，冲洗后DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0040]6)D-1II Tubulin (TUJ-1)免疫荧光:NADPH_d法染色完成后采集图像，PBS冲洗5min,枸橼酸高压法抗原修复，室温冷却，PBS冲洗。光镜下再观察，原NADPH_d阳性细胞经抗原修复后无变化，背景同未处理前一致。切片加入封闭液lh，滴入鼠单克隆抗体TUJ-1 (福州迈新生物)置4°C冰箱过夜，PBS冲洗，加入FITC标记二抗，避光室温lh，荧光显微镜下观察阳性结果，PBS冲洗，加H0echst33258 (Sigma)染核5min，PBS冲洗，加入防荧光淬灭剂，不同波长下采集图像，保存，Image Pro Plus5.1软件图像重建分析。
[0041]7)观察指标:扩张段、移行段的肌间神经丛及黏膜下神经丛着色情况、阳性神经节细胞是否可轻易识别，与背景有无反差。狭窄段黏膜下神经丛有无增生、紊乱。肠神经元特异标记物TUJ-1及PGP9.5结果是否同NADPH-d及Ache法的结果一致。
[0042]8)统计学处理方法采用SPSS for windowsl3.0软件进行统计学分析。处理组间阳性率比较采用配对，检验(校正)，耗时比较采用亡检验。p〈0.05为差异有统计学意义。
[0043]结果:
[0044]a.改良NADPH-d法扩张段近端切缘切片滴加反应液后5_10min内肉眼即可观察到反应液由澄黄变为淡紫色，低倍镜下可见环肌和纵肌之间丰富的神经丛，呈串珠状分布，环肌层内亦有大量阳性神经纤维及少许体积较小的神经节细胞分布(见图5)。高倍镜下见阳性神经节细胞，胞核空白无着色，胞浆呈蓝紫色。该法的组织切片背景单一，为无色半透明，经伊红衬染后，不仅阳性神经丛更易辨认，环肌层间阳性神经纤维清晰可见，同时也提供了其他背景信息，如黏膜层及黏膜下层的情况。移行段低倍镜下可见较少着色神经丛，神经丛体积较小，分布较稀疏；高倍镜下神经节细胞可清楚分辨，但单个神经丛内节细胞数量及大小较扩张段明显变小，环肌层阳性神经纤维少。狭窄段NADPH-d法染色后镜下见背景清晰，无任何着色，未见NADPH-d阳性神经丛及阳性神经节细胞。
[0045]b.改良AchE法在扩张段可见Ache阳性肌问神经丛及节细胞分布，近黏膜肌层有黏膜下神经丛散在分布，量少。狭窄段AchE染色后见黏膜下层大量增生、肥厚、排列紊乱的AchE阳性神经丛，以近黏膜固有肌层为著。苏木素复染后结果更易判断。
[0046]c.HE染色扩张段切片HE染色后，光镜下见肌间神经丛、神经节细胞隐约可见，但不易识别，背景组织细胞极多，结果不易判断。狭窄段HE染色，可见肌间杂乱分布的肥大神经纤维束，无任何阳性神经节细胞。
[0047]d.PGP9.5免疫组化法扩张段见大量阳性神经丛，其胞核、胞浆均着色，环肌层亦有大量阳性神经纤维迁入，与NADPH-d法的结果一致。移行段神经丛分布相对稀疏。狭窄段黏膜下可见大量异常增生的PGP9.5阳性神经丛，与AchE结果一致。
[0048]e.TUJ-1免疫荧光为判断NADPH_d阳性节细胞及神经丛的特异性，故对原先NADPH-d处理的切片再行高压法抗原修复，加入神经元特异性抗体TUJ.1进行双重染色分析，结果与NADPH-d阳性部位一致，证实原先串珠状分布的蓝紫色组织，即为肌间神经丛及神经节细胞。组织切片再加用H0echst33258染核，细胞核显色蓝色荧光，背景显示更清晰，组织层次分明，阳性结果更易判断。用ImagePr0PlUS5.I专业软件图像重建，阳性肌间神经丛轻易可见。
[0049]f.NADPH-d 法和 AchE 法结果比较诊断阳性率 NADPH-d 法为 94.4% (17/18) ,Ache法为88.9% (6/18)，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。耗时NADPH-d法最短，为(7.0 ±1.7) min，Ache 法(30.9 ±2.2) min，组间比较差异有统计学意义(P〈0.001)。
[0050]实施例3
[0051]材料与方法:
[0052]I)所用标本经医院伦理委员会批准，均取自手术中切除肠管。自2009至2012年18例HD患儿术中切除的结肠，其中男11例，女7例，年龄3?16个月。分扩张段、移形段、狭窄段，制片后分批超低温冰箱保存，以非HD患儿结肠造瘘切除标本作为阳性对照。分还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)染色法组、HE染色法组、乙酰胆碱酯酶(AchE)染色组。
[0053]2)制片:标本常规冰冻连续切片，厚4μπι，多聚赖氨酸载玻片贴片，随机取奇数切片做NADPH-d的快速组织学染色，偶数切片做AchE染色和冰冻切片HE染色。
[0054]3)NADPH-d快速组织学染色方法:反应液组成:lml0.1moL/LPB (pH8.0)中加入
0.6mg NBT (Sigma公司)、10 μ I 二甲基亚砜(苏州正兴化工研究院)、3 μ ITriton Χ_100(北京拜尔迪生物公司)、0.5mg NADPH-d (Sigma公司)。滴加反应液后置37°C水浴箱中5?lOmin，观察反应液由黄色变微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗终止反应，水性封片剂封片。阴性对照:反应液中不加入NADPH-d。阳性对照:已知阳性组织(结肠造瘘切除标本)同时进行染色。
[0055]4)冰冻切片HE染色方法:冰冻切片室温下干燥，4%多聚甲醛固定5min，PBS漂洗2min，苏木素染色(370C ) lmin, PBS冲洗5min，95%乙醇5S，伊红染液20?30S，70%乙醇漂洗2次，95%乙醇30S，100%乙醇30S，95%乙醇2次每次30S，100%乙醇2次每次30S，100%二甲苯2次，每次5min，中性树胶封片后镜下观察。
[0056]5)AchE染色方法:反应液组成:碘化乙酰硫代胆碱5mg(Sigma公司)，0.1moL/L醋酸缓冲液(pH5.8) 6.5ml, 0.1moL/L 枸橼酸钠 0.5ml, 0.25moL/L 硫酸铜溶液 0.2ml,5mmoL/L六氰基铁酸钾lml。充分混匀后反应液为透绿色，最终pH为5.8。切片置人37°C反应液中，光镜下观察染色结果，完成后苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
[0057]6)免疫荧光染色:NADPH-d的快速组织学染色完成后，PBS冲洗5min，行柠檬酸高压法抗原修复，加入封闭液lh，鼠单克隆一抗B-1ll型微管蛋白(TUJ-1，福州迈新公司)置4°C冰箱过夜，PBS冲洗，加人FITC 二抗避光室温lh，Hoechst33258 (Sigma公司)染核5min，冲洗，米集图像。
[0058]7)观察指标:扩张段:肌问神经丛及黏膜下神经丛着色情况，神经节细胞是否可轻易识别，与背景有无反差。移行段:神经丛、神经节细胞在数量、大小、分布范围与扩张段比较如何。狭窄段:黏膜下神经丛是否增生、紊乱，有无阳性神经节细胞分布。采用IPP5.1软件分析图像。
[0059]8)统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析，不同处理组问阳性率比较采用四格表确切概率法检验，耗时比较采用单因素方差分析。
[0060]结果:
[0061]a.扩张段:切片经NADPH-d的快速组织学染色，滴加反应液后5?1min观察结果，背景清晰；低倍镜下可见环肌和纵肌之间丰富的神经丛，呈串珠状分布，高倍镜下可见大量神经节细胞，其胞质呈紫色，胞核空白无着色。对原先NADPH-d处理的切片再行高压法抗原修复，加入神经元特异性抗体TUJ-1进行双重染色分析，结果证实原先串珠状分布的蓝紫色组织，即为肌间神经丛及神经节细胞。扩张段冰冻切片HE染色后，25min内观察结果，镜下见肌问神经丛、神经节细胞隐约可见，背景组织细胞极多。扩张段AchE染色后，可见阳性肌间神经丛及节细胞分布，黏膜下层可见少许AchE阳性神经，未见增生、肥大、扭曲的神经丛。
[0062]b.移行段:NADPH-d法染色后低倍镜下可见少数着色神经丛，神经丛之间距离较大，分布较扩张段明显稀疏，高倍镜下神经节细胞可清楚分辨，但每个神经丛内节细胞数量及大小远不如扩张段。移行段HE染色后各层组织结构完整，神经丛体积小，分布稀疏，可见少量肌问神经节细胞。移行段AchE染色后，肌问及黏膜下层均可见阳性AchE神经丛，分布较稀疏，黏膜下神经丛未见明显增生，紊乱。
[0063]c.狭窄段:快速NADPH-d法染色后狭窄段镜下见背景清晰，无任何着色，未见神经丛及阳性神经节细胞。狭窄段HE染色，可见肌间杂乱分布的肥大神经纤维束，无任何阳性神经节细胞，背景组织细胞繁多，不易判断结果。狭窄段AchE染色后见黏膜下层大量增生、肥厚、排列紊乱的AchE阳性神经丛，以近黏膜固有肌层为明显。
[0064]d.诊断结果比较:3种不同方法中NADPH-d法阳性率最高94.4% (17/18)，HE法83.3% (15/18)，AchE 法 88.9% (16/18)，组问差异无统计学意义(P>0.05)。其中 NADPH.d法耗时最短(7.0± 1.7)min，HE 法(23.2±2.9)min, AchE 法(30.9±2.2)min，各组问比较差异有统计学意义(P〈0.01，表2)。
[0065]表2 3种方法比较结果(η = 18，x±s )
[0066]
【权利要求】
1.利用尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄递酶组织的化学染色方法，其特征在于包括以下步骤: 1)制片标本常规冰冻切片； 2)反应液37°C提前预热，滴加反应液后载玻片置于37°C水浴箱中lOmin，观察反应液由黄色变微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后PBS冲洗终止反应，伊红衬染10S, PBS冲洗,水性封片剂Clear mount封片，完全干燥后可用中性树胶再次封片； 3)双重染色NADPH-d的快速组织学染色完成后，自来水冲洗5min，采集图像； 4)对数据进行统计学处理。
2.根据权利要求1所述的化学染色方法，其特征在于:所述的切片为多聚赖氨酸载玻片切片，片厚4ym。
3.根据权利要求1所述的化学染色方法，其特征在于:所述的反应液组成为:ImL0.lmol/L PB ρΗ8.0 溶液中加入 0.5mgNADPH_d、0.6mg NBT、10 μ L 二甲基亚砜、3 μ LTriton X-lOO。
【文档编号】G01N1/30GK104198256SQ201410437721
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】朱利斌, 李仲荣, 陈肖鸣, 张普, 夏立广, 王永飚, 谢小志 申请人:温州医科大学附属第二医院