一种外消旋托品酸的手性拆分方法
【专利摘要】本发明提供了一种外消旋托品酸的手性拆分方法：(1)将有机溶剂A、有机溶剂B与含有磺丁基醚-β-环糊精的磷酸盐缓冲液按照体积比0～10∶1～10∶10组成溶剂体系，混合均匀，静置分层，分液得到有机相和水相；(2)将外消旋托品酸用有机相溶解，制成样品；(3)采用高速逆流色谱法拆分外消旋托品酸；(4)从收集得到的前峰洗脱液和后峰洗脱液中回收，分别得到右旋托品酸单体和左旋托品酸单体；本发明首次采用逆流色谱拆分外消旋托品酸，所述方法适用于各种型号的制备型逆流色谱仪，分离得到的单体纯度大于96％、回收率大于91％。
【专利说明】一种外消旋托品酸的手性拆分方法
(—)
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种外消旋体的拆分方法，具体涉及一种从外消旋托品酸中拆分出左旋托品酸和右旋托品酸的方法。
(二)
【背景技术】
[0002]含有手性中心的化合物，其对映体通常具有极为相近的理化性质，但药理和毒理作用却存在很大差异，往往一种立体异构体有药效而它的镜像分子却很小，甚至完全没有药效或具有副作用。美国食品和药物管理局早在1992年就规定，今后凡开发具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分的结果。
[0003]托品酸是一种重要的药物中间体，可用于合成抗胆碱药山莨菪碱和托吡卡胺等。获得光学纯的托品酸也是药物合成的必然要求。因此，对外消旋托品酸进行手性拆分研究，建立快速、有效的拆分方法是一个具有理论及实际意义的课题。目前，外消旋托品酸的拆分方法主要有高效液相色谱固定相法、毛细管色谱法、离子对色谱法和酶催化拆分等。
[0004]高速逆流色谱技术(highspeed countercurrent chromatography, HSCCC)作为一种新兴的液-液分配色谱技术，得益于其两相均为液体的性质，可避免样品的不可逆吸附、失活和变性等问题，还具有一次性分离制备量大、仪器简单易维修且运行成本低等优点，对于手性分离来说是一种理想的制备色谱技术，因此逆流色谱技术近年来已逐步发展成为一种备受关注的制备色谱分离技术。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种采用高速逆流色谱技术拆分外消旋托品酸的方法。
[0006]为实现上述发明目的，本发明以外消旋托品酸为拆分对象，以磺丁基醚-β -环糊精作为手性试剂，将其添加到水相中，采用液-液分配手性萃取拆分的方法筛选溶剂体系，并用高速逆流色谱法得到左旋托品酸和右旋托品酸。
[0007]本发明采用的技术方案是:
[0008]一种外消旋托品酸的手性拆分方法，所述方法按如下步骤进行:
[0009](I)将有机溶剂Α、有机溶剂B与含有磺丁基醚-环糊精的磷酸盐缓冲液按照体积比O?10:1?10:10组成溶剂体系，混合均匀，静置分层，分液得到有机相和水相；所述磺丁基醚-β -环糊精的取代度为4.5?8.0 ;所述含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液的PH值为1.0?8.0 ;所述含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液中磺丁基醚-β -环糊精的浓度为0.02?0.40mol/L ;所述有机溶剂A为Cl?C8的烷烃；所述有机溶剂B为C2?C8的醚或C3?C8的酯类；
[0010](2)将外消旋托品酸用步骤⑴所得的有机相溶解，制成样品；
[0011](3)采用高速逆流色谱法拆分外消旋托品酸:以步骤(I)得到的有机相为固定相，水相为流动相，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为2?35°C，开启速度控制器，转速为200?2000rpm，以0.1?3.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后，即当流动相从色谱柱出口处流出时，将步骤(2)制得的样品由进样阀进样，紫外检测器在波长190?400nm下检测流出液，按照时间梯度，用自动部份收集器分别收集40min到ISOmin之间梯度时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液；所述前峰是指对映体双峰中先出来的主峰，所述后峰是指对映体双峰中后出来的主峰；
[0012](4)从步骤(3)中收集得到的前峰洗脱液中回收，得到右旋托品酸单体；从步骤
(3)中收集得到的后峰洗脱液中回收，得到左旋托品酸单体。
[0013]本发明所述外消旋托品酸的手性拆分方法步骤(I)中，所述的溶剂体系由有机溶剂A、有机溶剂B与含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液按照体积比O?10:1?10:10组成，其中所述有机溶剂A在所述溶剂体系中的体积含量可以为0，即所述溶剂体系可以由有机溶剂Α、有机溶剂B与含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液组成，或者仅由有机溶剂B与含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液组成。
[0014]本发明所述步骤(I)中，优选所述有机溶剂A为正己烷、正庚烷、正戊烷、环己烷或石油醚；优选所述有机溶剂B为乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯或甲酸乙酯；优选所述的含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液的PH值为1.5?4.5 ;优选所述的含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液中磺丁基醚-β -环糊精的浓度为0.05?0.30mol/L ;优选所述磺丁基醚-环糊精的取代度为5.5?8.0。
[0015]本发明所述步骤(I)中，优选所述溶剂体系为乙酸乙酯与pH值为2.7的含磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液以体积比1:1混合制成，其中所述含磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液中磺丁基醚-β -环糊精的浓度为0.lmol/L0
[0016]本发明所述步骤(2)中，优选所述样品中外消旋托品酸的浓度为I?10mg/mL。
[0017]本发明所述步骤(3)中，推荐所述梯度时间间隔为每0.5?5min收集一次，优选为每2min时间间隔收集一次洗脱液。
[0018]本发明所述步骤(3)中，优选所述柱温为5?30°C ;所述转速为800?1800rpm ；所述流动相泵入柱内的流速为0.5?2.5mL/min。
[0019]本发明所述步骤(4)中，所述的回收方法可以为:将前峰洗脱液和后峰洗脱液分别用盐酸调节PH值至I?2，再用乙酸乙酯萃取2?3次，合并乙酸乙酯层，用水洗至中性，无水硫酸钠干燥、过滤，滤液蒸除溶剂，即分别获得右旋托品酸单体和左旋托品酸单体。
[0020]具体的，最优的，推荐本发明所述拆分方法按照如下步骤进行:
[0021](I)将乙酸乙酯与pH值为2.7的含有磺丁基醚-环糊精的磷酸盐缓冲液按照体积比1:1组成溶剂体系，混合均匀，静置分层，分液得到有机相和水相；所述磺丁基醚-β -环糊精的取代度为5.5?8.0 ;所述含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液中磺丁基醚-β -环糊精的浓度为0.lmol/L ；
[0022](2)将外消旋托品酸用步骤⑴所得的有机相溶解，制成外消旋托品酸浓度为I?10mg/mL的样品；
[0023](3)采用高速逆流色谱法拆分外消旋托品酸:以步骤(I)得到的有机相为固定相，水相为流动相，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为5?25°C，开启速度控制器，转速为800?1800rpm，以0.5?2.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后，即当流动相从色谱柱出口处流出时，将步骤(2)制得的样品由进样阀进样，紫外检测器在波长190?400nm下检测流出液，按照时间梯度，用自动部份收集器分别收集40min到180min之间每2min时间间隔的洗脱液,并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液；
[0024](4)从步骤(3)中收集得到的前峰洗脱液中回收，得到右旋托品酸单体；从步骤
(3)中收集得到的后峰洗脱液中回收，得到左旋托品酸单体；所述回收的方法为:将前峰洗脱液和后峰洗脱液分别用盐酸调节PH值至I?2，再用乙酸乙酯萃取2?3次，合并乙酸乙酯层，用水洗至中性，无水硫酸钠干燥、过滤，滤液蒸除溶剂，即分别获得右旋托品酸单体和左旋托品酸单体。
[0025]本发明可采用分析型、半制备和制备型逆流色谱仪(分析型分离柱柱体积为20ml，半制备型分离柱柱体积为300ml，制备型分离柱柱体积为1000ml)，逆流色谱仪由恒流泵、主机(分离柱)、紫外检测器、记录仪等组成。
[0026]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明首次采用逆流色谱拆分外消旋托品酸，本方法可以基本达到分离目的，并且该方法适用于各种型号的制备型逆流色谱仪，可以分离得到左旋托品酸和右旋托品酸的单体，其纯度均大于96%、回收率大于91%。
(四)
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1:实施例1实验条件下的分析型高速逆流色谱图；
[0028]图2:实施例2实验条件下的分析型高速逆流色谱图；
[0029]图3:实施例3实验条件下的分析型高速逆流色谱图；
[0030]图4:实施例4实验条件下的分析型高速逆流色谱图；
[0031]图5:实施例5实验条件下的分析型高速逆流色谱图；
[0032]图6:实施例6实验条件下的分析型高速逆流色谱图；
[0033]图7:实施例7实验条件下的分析型高速逆流色谱图；
[0034]图8:实施例8实验条件下的半制备型高速逆流色谱图；
[0035]图9:图8中A部分(IlOmin?145min)洗脱液的高效液相色谱检测谱图，即右旋托品Ife ；
[0036]图10:图8中B部分(155min?180min)洗脱液的高效液相色谱检测谱图，即左旋托品酸。
(五)
【具体实施方式】
[0037]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0038]实施例1
[0039](I)将乙酸乙酯:含有磺丁基醚环糊精的磷酸盐缓冲液(用0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液配制，pH = 2.7，含有0.10mol/L磺丁基醚-β -环糊精，取代度为6.9)按照1:1的体积比配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
[0040](2)称取2.5mg外消旋托品酸用ImL有机相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
[0041](3)采用分析型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-20A)拆分外消旋托品酸:分离柱体积为20mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为10°C，开启速度控制器，转速为1800rpm，以0.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集55min到82min之间每2min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即55?67min内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即68?82min内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液。根据紫外检测谱图(见图1所示)，计算分离度为1.10。将含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液和含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于99%。高效液相色谱法检测条件为:BostonGreen ODS (5 μ m, 150mmX4.6mm)色谱柱；柱温:25°C;流动相:pH4.0水(0.5%乙酸-三乙胺调节，含25mmol吨―1羟丙基-β-环糊精):甲醇(95:5，v/v)等度洗脱；流速0.5mL/min ;检测波长254nm ;进样量:20 μ L。
[0042]实施例2
[0043](I)将乙酸乙酯:含有磺丁基醚环糊精的磷酸盐缓冲液(用0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液配制，PH = 2.7，含有0.10mol/L磺丁基醚-β -环糊精，取代度为6.9)按照1:1的体积比配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
[0044](2)称取2.5mg外消旋托品酸用ImL有机相相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
[0045](3)采用分析型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-20A)拆分外消旋托品酸:分离柱体积为20mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为25 °C，开启速度控制器，转速为1800rpm，以0.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集60min到10min之间每2min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即60?79min内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即80?10min内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液。根据紫外检测谱图(见图2所示)，计算分离度为0.85。将含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液和含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于98%。高效液相色谱的检测条件同实施例1。
[0046]实施例3
[0047](I)将乙酸乙酯:含有磺丁基醚-β_环糊精的磷酸盐缓冲液(用0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液配制，PH = 2.7，含有0.20mol/L磺丁基醚-β -环糊精，取代度为6.9)按照1:1的体积比配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
[0048](2)称取2.5mg外消旋托品酸用ImL有机相相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
[0049](3)采用分析型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-20A)拆分外消旋托品酸:分离柱体积为20mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为10°C，开启速度控制器，转速为1800rpm，以0.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集44min到65min之间每2min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即44?52min内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即53?65min内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液。根据紫外检测谱图(见图3所示)，计算分离度为0.76。将含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液和含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于97%。高效液相色谱的检测条件同实施例1。
[0050]实施例4
[0051](I)将乙酸乙酯:含有磺丁基醚环糊精的磷酸盐缓冲液(用0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液配制，PH = 2.0，含有0.10mol/L磺丁基醚-β -环糊精，取代度为6.9)按照1:1的体积比配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
[0052](2)称取2.5mg外消旋托品酸用ImL有机相相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
[0053](3)采用分析型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-20A)拆分外消旋托品酸:分离柱体积为20mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为10°C，开启速度控制器，转速为1800rpm，以0.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集55min到85min之间每2min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即55?67min内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即68?85min内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液。根据紫外检测谱图(见图4所示)，计算分离度为0.98。将含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液和含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于99%。高效液相色谱的检测条件同实施例1。
[0054]实施例5
[0055](I)将乙酸乙酯:含有磺丁基醚环糊精的磷酸盐缓冲液(用0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液配制，pH = 4.0，含有0.10mol/L磺丁基醚-β -环糊精，取代度为6.9)按照1:1的体积比配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
[0056](2)称取2.5mg外消旋托品酸用ImL有机相相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
[0057](3)采用分析型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-20A)拆分外消旋托品酸:分离柱体积为20mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为10°C，开启速度控制器，转速为1800rpm，以0.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集54min到90min之间每2min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即54?66min内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即67?90min内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液。根据紫外检测谱图(见图5所示)，计算分离度为0.83。将含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液和含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于98%。高效液相色谱的检测条件同实施例1。
[0058]实施例6
[0059](I)将正己烷:乙酸乙酯:含有磺丁基醚环糊精的磷酸盐缓冲液(用0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液配制，pH = 2.0，含有0.10mol/L磺丁基醚-β -环糊精，取代度为6.9)按照2:8:10的体积比配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
[0060](2)称取2.5mg外消旋托品酸用ImL有机相相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
[0061](3)采用分析型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-20A)拆分外消旋托品酸:分离柱体积为20mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为10°C，开启速度控制器，转速为1800rpm，以0.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集41min到63min之间每2min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即41?51min内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即52?63min内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液。根据紫外检测谱图(见图6所示)，计算分离度为0.97。将含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液和含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于99%。高效液相色谱的检测条件同实施例1。
[0062]实施例7
[0063](I)将正己烷:甲基叔丁基醚:含有磺丁基醚环糊精的磷酸盐缓冲液(用0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液配制，pH = 2.7，含有0.10mol/L磺丁基醚-β -环糊精，取代度为6.9)按照2:8:10的体积比配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
[0064](2)称取2.5mg外消旋托品酸用ImL有机相相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
[0065](3)采用分析型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-20A)拆分外消旋托品酸:分离柱体积为20mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为10°C，开启速度控制器，转速为1800rpm，以0.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集45min到75min之间每2min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即45?60min内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即61?75min内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液。根据紫外检测谱图(见图7所示)，计算分离度为0.53。将含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液和含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于96%。高效液相色谱的检测条件同实施例1。
[0066]实施例8
[0067](I)将乙酸乙酯:含有磺丁基醚环糊精的磷酸盐缓冲液(用0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液配制，PH= 2.7，含有0.lmol/L磺丁基醚-β-环糊精，取代度为6.9)按照1:1的体积比配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
[0068](2)称取10mg外消旋托品酸用1mL有机相相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
[0069](3)采用半制备型高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-200V)拆分外消旋托品酸:分离柱体积为200mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为10°C，开启速度控制器，转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集IlOmin到180min之间每2min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即110?145min内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即155?ISOmin内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液。根据紫外检测谱图(见图8所示)，计算分离度为0.64。将含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液和含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于96%。高效液相色谱的检测条件同实施例1。
[0070]从洗脱液中回收样品:将前峰洗脱液和后峰洗脱液分别用盐酸调节pH至I?2，再用乙酸乙酯萃取2?3次，合并乙酸乙酯层，用水洗至中性，无水硫酸钠干燥、过滤，滤液蒸除溶剂，即分别获得右旋托品酸单体和左旋托品酸单体。右旋托品酸单体，纯度为96.2%，回收率为92.8%，左旋托品酸单体，纯度为99.6%，回收率为91.4%。
【权利要求】
1.一种外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行: (1)将有机溶剂A、有机溶剂B与含有磺丁基醚-β-环糊精的磷酸盐缓冲液按照体积比O?10:1?10:10组成溶剂体系，混合均匀，静置分层，分液得到有机相和水相；所述磺丁基醚-β -环糊精的取代度为4.5?8.0 ;所述含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液的PH值为1.0?8.0 ;所述含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液中磺丁基醚-β -环糊精的浓度为0.02?0.40mol/L ;所述有机溶剂A为Cl?C8的烷烃；所述有机溶剂B为C2?C8的醚或C3?C8的酯类； (2)将外消旋托品酸用步骤(I)所得的有机相溶解，制成样品； (3)采用高速逆流色谱法拆分外消旋托品酸:以步骤(I)得到的有机相为固定相，水相为流动相，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为2?35°C，开启速度控制器，转速为200?2000rpm,以0.1?3.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后，即当流动相从色谱柱出口处流出时，将步骤⑵制得的样品由进样阀进样，紫外检测器在波长190?400nm下检测流出液，按照时间梯度，用自动部份收集器分别收集40min到ISOmin之间梯度时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分右旋托品酸单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分左旋托品酸单体的后峰洗脱液；所述前峰是指对映体双峰中先出来的主峰，所述后峰是指对映体双峰中后出来的主峰； (4)从步骤(3)中收集得到的前峰洗脱液中回收，得到右旋托品酸单体；从步骤(3)中收集得到的后峰洗脱液中回收，得到左旋托品酸单体。
2.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(I)中，所述有机溶剂A为正己烷、正庚烷、正戊烷、环己烷或石油醚。
3.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(I)中，所述有机溶剂B为乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯或甲酸乙酯。
4.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(I)中，所述含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液的pH值为1.5?4.5。
5.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(I)中，所述含有磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液中磺丁基醚-环糊精的浓度为0.05?0.30mol/L。
6.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(I)中，所述磺丁基醚-β -环糊精的取代度为5.5?8.0。
7.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(I)中，所述溶剂体系为乙酸乙酯与pH值为2.7的含磺丁基醚-β-环糊精的磷酸盐缓冲液以体积比1:1混合制成，其中所述含磺丁基醚-β -环糊精的磷酸盐缓冲液中磺丁基醚-环糊精的浓度为 0.lmol/Lo
8.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(2)中，所述样品中外消旋托品酸的浓度为I?10mg/mL。
9.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(3)中，所述梯度时间间隔为每0.5?5min收集一次。
10.如权利要求1所述的外消旋托品酸的手性拆分方法，其特征在于步骤(4)中，所述的回收方法为:将前峰洗脱液和后峰洗脱液分别用盐酸调节PH值至I?2，再用乙酸乙酯萃取2?3次，合并乙酸乙酯层，用水洗至中性，无水硫酸钠干燥、过滤，滤液蒸除溶剂，即分别获得右旋托品酸单体和左旋托品酸单体。
【文档编号】G01N30/06GK104237401SQ201410442446
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】童胜强, 张虎, 沈芒芒, 颜继忠 申请人:浙江工业大学