一种矮牵牛染色体的制片方法
【专利摘要】本发明公开了一种矮牵牛染色体的制片方法，该方法为：于晴天早晨8:00-10:00取矮牵牛幼蕾，先置于0.002mol.L^8-羟基喹啉水溶液进行低温预处理，再转入卡诺氏固定液固定，经0.075mol.I/1氯化钾低渗，接着在lmol.L—HC1溶液60°C水浴解离，冲洗后蒸馏水低渗，醋酸洋红染色液染色。将幼蕾移入载玻片，切取雌蕊柱头部位，制片、镜检。本发明方法确定了不同倍性矮牵牛最佳取样时花蕾大小、预处理方法、解离及染色的方法和时间以及制片流程，获得的染色体分散均匀，易于计数或进行核型分析，具有操作简单方便效率高的优点，具有较好的应用前景。
【专利说明】一种矮牵牛染色体的制片方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及到一种矮牵牛染色体的制片方法。
【背景技术】
[0002] 矮牵牛Vilm.)原产于南美洲，又名碧冬茄为茄科碧冬茄属植 物，花朵硕大、色彩丰富，花型变化颇多，在国际上早已成为主要的盆花和装饰植物，广泛应 用于庭院、露天花坛、广场的美化装饰与绿化，被喻为"世界花坛花卉之王"。矮牵牛在美国 栽培十分普遍，常用在窗台美化、城市景观布置，其生产的规模和数量列美国花坛和庭园植 物的第二位；在欧洲的意大利、法国、西班牙、荷兰和德国等国，矮牵牛广泛用于街旁美化和 家庭装饰；在日本，矮牵牛常用于各式栽植槽的布置和公共场所的景观配置。我国矮牵牛于 20世纪初开始引种栽培，仅在大城市有零星栽培，直到 80年代初，开始从美国、荷兰、日本 等国引进，作为花坛后起之秀市场对矮牵牛需求越来越大，栽培范围越来越广泛现在己成 为一种重要花卉，普遍用于花坛、广场等装饰与绿化，对其进行品种选育和细胞遗传学等相 关研究具有重要意义。
[0003]远源杂交、倍性育种是植物遗传育种的重要方法，都需要对染色体的遗传行为进 行观察和分析，需要提供高质量的染色体图片，优良的细胞染色体制片方法是进行染色体 核型分析、染色体识别等研究的基础。
[0004]现有的染色体制片方法，根尖一般是观察有丝分裂最常用的材料，取材时根尖长 度很关键，根尖过长绝大部分细胞已经过了有丝分裂期，根尖过短则处于有丝分裂前期，需 要大量种子进行发芽培养试验，对无种子或种子稀少材料不适宜，且试验过程繁琐周期长。 对花丼植物而言，开花期长大量花蕾雌蕊很容易得到无需专门的培养，缩短了试验周期简 化了试验流程。幼小花蕾如取材大小适宜，其细胞有丝分裂指数（视野内观察到的有丝分 裂细胞数目/视野内观察到的总细胞数目X 100%)往往高于根尖。单利用矮牵牛花蕾雌蕊 进行染色体制片目前还未有报道。
[0005]有丝分裂中期时染色体浓缩变粗，能够显示出该物种所特有的染色体数目和形 态，有丝分裂中期适于做染色体的形态结构分析和计数，但中期时间较短不易观察。预处 理通过破坏纺锤丝的形成犾得更多的中期分裂相，还促使染色体染色体缩短和分散便于观 察，预处理方法主要有低温处理和化学药剂处理。现有资料中仅有蔡华等在《生物学通报》 20〇 6年41卷第4期49-5〇页发表的《观赏花卉矮牵牛与野生牵牛花的染色体核型比较》中 报道米用8-羟基喹啉预处理矮牵牛根尖，按照此方法以雌蕊柱头为材料重复试验，中期分 裂指数（撕内观察到的有丝分裂中期细臟目/撕内观察到的总细胞数目 χι〇〇%)偏 低。
[0006]植物细胞依靠细胞壁和胞间连相连接，为了得到分散良好的有丝分裂中期分裂 相，吊米取盐酸解尚方法，不同植物材料盐酸解离时间不尽相同，处理时间短细胞壁消除不 完全导致细胞分散不开，解离时间长对染色体结构破坏严重、染色效果差。
【发明内容】
[0007]为了克服现有矮牵牛染色体制片技术的不足,本发明的目的在于提供了一种二、 四倍体矮牵牛染色体制片方法，该方法以幼小花蕾雌蕊柱头作为材料，获得的染色体分散 均匀、背景浅、易观察到染色体数目和形态。
[0008]本发明所米用的技术方案为：一种矮牵牛染色体染色体的制片方法，该方法包括 如下步骤： (1) 于晴天早晨8:00-10:00取二倍体、四倍体矮牵牛长度分别为和5?8mm的不 包含萼片的幼蕾； (2) 分别将二、四倍体矮牵牛幼蕾分开放置于〇· 〇〇2m〇l· L/1 8-轻基喹啉水溶液中 2-6?低温避光预处理3小时，蒸馏水冲洗3-5次吸水纸吸干水后转入卡诺氏固定液固定 12-24小时，经体积浓度％%、体积浓度 8〇%乙醇依次冲洗然后转入体积浓度7〇%乙醇中4。〇 保存备用； (3) 将步骤（2)中备用的幼蕾先用蒸馏水冲洗3-5次，再用吸水纸吸千水，再经 0. 075mol· L_1氯化钾溶液进行低渗10分钟，在1 mol· L-hCl溶液6CTC水浴解离5分钟，蒸 馏水冲洗3-5次后蒸馏水低渗30分钟，吸水纸吸干水； (4) 转入体积百分浓度为45%的醋酸溶液配制的质量浓度为1%的洋红染色液中，在 2-6?低温下染色12-24小时； (5) 用镊子分别将二、四倍体矮牵牛幼蕾移入载玻片上，用刀片切取雌蕊中的柱头部位 去除其余部位，用另外一块载玻片十字交叉覆盖，用力按压不可移动，分开两载玻片，在两 片载玻片上材料处分别滴上I- 2滴1%洋红染色液，垂直覆上盖玻片，用吸水纸吸去溢出盖 玻片外多余洋红染色液；在盖玻片上覆盖5-6层吸水纸，一手压紧吸水纸，另一手用铅笔尾 端垂直均匀敲击盖玻片直至材料呈现雾状分散开，，再用拇指垂直用力按压玻片10秒，按 压时盖玻片不能移动，玻片置于酒精灯外焰来回晃动拷片1-2秒；先在低倍镜下找出处于 有丝分裂中期分裂相细胞，在100 X10倍油镜下进行染色体计数和显微照相。
[0009] 步骤（2)中所述卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。
[0010] 步骤（4)中步骤（4)中所述45% (体积百分浓度）醋酸溶液配制的1% (质量浓度） 洋红染色液配制方法为：先加入45ml乙酸再加水55ml混匀得到100ml体积浓度为45%醋 酸溶液，然后将洋红粉末1克缓慢倒入上述醋酸溶液中，边煮边搅拌，过滤后的滤液即为质 量浓度为1%的洋红染色液。
[0011] 为了增加染色效果，在质量浓度为1%的洋红染色液煮沸冷却后加质量浓度为4% 的铁明矾溶液广2滴，过滤后即可。
[0012] 有益效果：与现有技术相比，本发明所改进和优点在于： 1、取材时间和大小：矮牵牛最佳花蕾取样时间和大小尚未见报道，本发明确定了取样 时间为晴天早晨8:00-10:00,此时雌蕊柱头体细胞有丝分裂处于旺盛时期，有丝分裂指数 较高。二、四倍体矮牵牛由于倍性不同，雌蕊柱头体细胞处于有丝分裂旺盛时期花蕾(不包 含萼片)长度也不同，确定分别为3飞mm和fSmm，此时雄蕊花粉母细胞减数分裂结束不久。
[0013] 2、预处理改进：将药剂8-羟基喹啉水溶液和4°C低温结合预处理3小时，能够产 生以下更加明显效果：阻止或破坏纺垂体微管的形成、提高细胞有丝分裂中期指数；促进 染色体浓缩变短，减少染色体之间相互缠绕重叠；减少胞质粘度，促进染色体清晰。
[0014] 3、材料软化与染色：利用盐酸解离，解离时间长对染色体结构破坏严重、染色效果 差。本发明将花蕾经盐酸短时间解离后，转入45% (体积百分浓度)醋酸溶液配制的1% (质 量浓度)洋红染色液，在4°C低温下染色12-24小时，既能利用醋酸继续解离软化细胞壁、破 坏细胞质使染色背景清晰，对染色体结构影响也较小，较长染色时间使得染色体着色深。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1和图2分别为不同二倍体矮牵牛雌蕊柱头体细胞染色体制片在100X 10倍 ZEISS· Imager. A1光学显微镜下图片。
[0016] 图3和图4分别为不同四倍体矮牵牛雌蕊柱头体细胞染色体制片在100X 10倍 ZEISS. Imager. A1光学显微镜下图片。
[0017]
【具体实施方式】： 下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0018] 实施例1:利用二倍体矮牵牛雌蕊柱头体细胞进行染色体制片，其中二倍体矮牵 牛'梦幻'种子购买于浙江虹越花卉有限公司。
[0019] 质量浓度为1%的洋红染色液配制方法为：先加入45ml乙酸再加水55ml混匀得到 100ml体积浓度为45%醋酸溶液，然后将洋红粉末1克缓慢倒入上述醋酸溶液中，边煮边搅 拌，为增加染色效果煮沸冷却后加4% (质量浓度）铁明矾溶液广2滴，过滤即可使用。
[0020] 卡诺氏固定液配制方法为：无水乙醇300ml和冰醋酸100ml均匀混合。
[0021] 二倍体矮牵牛雌蕊柱头体细胞进行染色体制片方法包括如下步骤： (1)于晴天早晨8:00-10:00取二倍体矮牵牛长度为3?6圓不包含萼片的花蕾。
[0022] (2)放置于〇. 〇〇2mol. Γ1 8-羟基喹啉水溶液中4°C低温避光预处理3小时，蒸馏 水冲洗3次吸水纸吸干水后转入卡诺氏固定液固定24小时，经体积浓度为95%、体积浓度为 80%乙醇依次冲洗然后转入体积浓度为70%乙醇中4°C保存备用。
[0023] (3)将步骤（2)中备用的花蕾蒸馏水冲洗3次吸水纸吸千水，经0. 〇75mol. L71氯化 钾低渗10分钟，在1 mol. L-1HC1溶液60°C水浴解离5分钟，蒸馏水冲洗3次蒸馏水低渗30 分钟，吸水纸吸干水，得到低渗处理后的花蕾。
[0024] (4)将步骤（3)中低渗处理后的花蕾转入质量浓度为1%洋红染色液，在4Γ低温 下染色18小时，得到染色后的幼蕾。
[0025] (5)用镊子将染色后的幼蕾移入载玻片上，用刀片切取雌蕊中的柱头部位去除其 余部位，用另外一块载玻片十字交叉覆盖，用力按压不可移动，分开两载玻片，分别滴上1 -2 滴1%洋红染色液，垂直覆上盖玻片，用吸水纸吸去多余染色液。在玻片上覆盖5-6层吸水 纸，一手压紧吸水纸，另一手用铅笔尾端垂直均勻敲击玻片10余下使材料呈现雾状细胞分 散开，用拇指垂直用力按压玻片10秒(玻片不能移动)，玻片置于酒精灯外焰来回晃动拷片 1-2秒。依次在5倍、10倍和20倍低倍镜下找出处于有丝分裂中期分裂相细胞，在100X 10 倍油镜下进行染色体计数和显微照相。结果如图1和图2所示，处于有丝分裂中期分裂相 的体细胞分布相对集中，染色体分散良好、着色深背景色相对浅反差大易观察染色体，适合 染色体计数或进行核型分析，经计数染色体数目2n=14。
[0026]实施例2 :利用四倍体矮牵牛雌蕊柱头体细胞进行染色体制片 其中，四倍体矮牵牛'红霞'种子来源于江苏农林职业技术学院。
[0027]质量浓度为1%的洋红染色液配制方法为：先加入45ml乙酸再加水55ml混匀得到 100ml体积浓度为45%醋酸溶液，然后将洋红粉末1克缓慢倒入上述醋酸溶液中，边煮边搅 拌，为增加染色效果煮沸冷却后加4% (质量浓度）铁明矾溶液广2滴，过滤即可使用。
[0028] 卡诺氏固定液配制方法为：无水乙醇300ml和冰醋酸l〇〇ml均匀混合。
[0029]四倍体矮牵牛雌蕊柱头体细胞进行染色体制片的方法包括如下步骤： (1)于晴天早晨8:00-10:00取四倍体矮牵牛长度为5?8_不包含萼片的花蕾。
[0030] (2)放置于0· 002mol. Γ1 8-羟基喹啉水溶液中代低温避光预处理3小时，蒸馏 水冲洗3次吸水纸吸干水后转入卡诺氏固定液固定24小时,经体积浓度为95%、体积浓度为 S0%乙醇依次冲洗然后转入体积浓度为70%乙醇中4°C保存备用。
[0031] (3)将步骤（2)中备用的花蕾蒸馏水冲洗3次吸水纸吸干水，经〇· 〇75mol. L；1氯化 钾低渗10分钟，在1 mol. PHCl溶液6〇°C水浴解离5分钟，蒸馏水冲洗3次后蒸馏水低渗 3〇分钟，吸水纸吸干水，得到低渗处理后的花蕾。
[0032] (4)将步骤（3)中低渗处理后的花蕾转入质量浓度为1%洋红染色液，中在4°C低 温下染色12小时，得到染色后的幼蕾。
[0033] (5)用镊子将染色后的幼蕾移入载玻片上，用刀片切取雌蕊中的柱头部位去除其 余部位，用另外一块载玻片十字交叉覆盖，用力按压不可移动，分开两载玻片，分别滴上1 一2 滴1%洋红染色液，垂直覆上盖玻片，用吸水纸吸去多余染色液。在玻片上覆盖5-6层吸水 纸，一手压紧吸水纸，另一手用铅笔尾端垂直均匀敲击玻片10余下，使材料呈现雾状细胞 分散开，用拇指垂直用力按压玻片10秒(玻片不能移动)，玻片置于酒精灯外焰来回晃动拷 片1-2秒。先在低倍镜下找出处于有丝分裂中期分裂相细胞，在ιοοχ 1〇倍油镜下进行染 色体计数和显微照相。结果如图3和图4所示，处于有丝分裂中期分裂相的体细胞分布相 对集中，染色体分散良好、着色深背景色相对浅反差大易观察染色体，适合染色体计数或进 行核型分析，经计数染色体数目2n=28。
[0034] 实施例3 :与实施例1基本相同，所不同的是步骤（2)和步骤（3)和步骤（4): 步骤（2):将二倍体矮牵牛幼蕾分开放置于0. 002mol. L_1 8-羟基喹啉水溶液中6Γ低 温避光预处理3小时，蒸馏水冲洗5次吸水纸吸干水后转入卡诺氏固定液固定12小时，经 体积浓度95%、体积浓度80%乙醇依次冲洗然后转入体积浓度 7〇%乙醇中4?保存备用； 步骤（3):将步骤（2)中备用的幼蕾先用蒸馏水冲洗5次，再用吸水纸吸干水，再经 〇· 〇75m〇l. Γ1氯化钾溶液进行低渗10分钟，在1 mol· L_1HC1溶液60°c水浴解离5分钟，蒸 Μ水冲洗5次后蒸馏水低渗30分钟，吸水纸吸千水。
[0035] (4)将步骤（3)中低渗处理后的花蕾转入质量浓度为1%洋红染色液，在4°C低温 Τ染色24小时，得到染色后的幼蕾。
[QQ36] 实施例4:与实施例2基本相同，所不同的是步骤（2):将四倍体矮牵牛幼蕾分开放 置于〇. 002mol. L-1 8-羟基喹啉水溶液中2?低温避光预处理3小时，蒸馏水冲洗3次吸水 纸吸干水后转入卡诺氏固定液固定18小时，经体积浓度％%、体积浓度80%乙醇依次冲洗然 后转入体积浓度70%乙醇中4Γ保存备用。
【权利要求】
1. 一种矮牵牛染色体的制片方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： (1) 于晴天早晨8:00-10:00取二倍体、四倍体矮牵牛长度分别为3飞咖1和5?8圓的不 包含萼片的幼蕾； (2) 分别将二、四倍体矮牵牛幼蕾分开放置于0· 002mol. Γ1 8-羟基喹啉水溶液中 2-6°C低温避光预处理3小时，蒸馏水冲洗3-5次吸水纸吸干水后转入卡诺氏固定液固定 12-24小时，经体积浓度95%、体积浓度80%乙醇依次冲洗然后转入体积浓度70%乙醇中4°C 保存备用； (3) 将步骤（2)中备用的幼蕾先用蒸馏水冲洗3-5次，再用吸水纸吸干水，再经 0· 〇75mol. Γ1氯化钾溶液进行低渗10分钟，在1 mol. L-1HC1溶液6(TC水浴解离5分钟，蒸 馏水冲洗3-5次后蒸馏水低渗30分钟，吸水纸吸干水； (4) 转入体积百分浓度为45%的醋酸溶液配制的质量浓度为丨％的洋红染色液中，在 2-6°C低温下染色12-24小时； (5) 用镊子分别将二、四倍体矮牵牛幼蕾移入载玻片上，用刀片切取雌蕊中的柱头部位 去除其余部位，用另外一块载玻片十字交叉覆盖，用力按压不可移动，分开两载玻片，在两 片载玻片上材料处分别滴上1-2滴1%洋红染色液，垂直覆上盖玻片，用吸水纸吸去溢出盖 玻片外多余洋红染色液；在盖玻片上覆盖5-6层吸水纸，一手压紧吸水纸，另一手用铅笔尾 端垂直均匀敲击盖玻片直至材料呈现雾状分散开，，再用拇指垂直用力按压玻片10秒，按 压时盖玻片不能移动，玻片置于酒精灯外焰来回晃动拷片1-2秒；先在低倍镜下找出处于 有丝分裂中期分裂相细胞，在100X10倍油镜下进行染色体计数和显微照相。
2. 根据权利要求1所述的一种矮牵牛染色体的制片方法，其特征在于，步骤（2)中所述 卡诺氏固定液是由无水乙醇和冰醋酸按体积比3:1制成的。
3. 根据权利要求1所述的一种矮牵牛染色体的制片方法，其特征在于，步骤（4)中所述 45% (体积百分浓度）醋酸溶液配制的1% (质量浓度）洋红染色液配制方法为：先加入45tnl 乙酸再加水55ml混匀得到l〇〇ml体积浓度为45%醋酸溶液，然后将洋红粉末1克缓慢倒入 上述醋酸溶液中，边煮边搅拌，过滤后的滤液即为得到质量浓度为1%的洋红染色液。
4·根据权利要求3所述的一种矮牵牛染色体的制片方法，其特征在于，在质量浓度为 1%的洋红染色液煮沸冷却后加质量浓度为4%的铁明矾溶液1?2滴，过滤后即可。
【文档编号】G01N1/28GK104215485SQ201410453232
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】魏跃, 嵇怡, 樊开青, 刘艳, 张莹, 史红林, 陈啸寅, 颜志明, 王全智 申请人:江苏农林职业技术学院