一种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒，所述试剂盒包括：(1)双标记酶结合物；(2)阴阳性对照物；(3)发光液；(4)微孔包被板。双标记酶结合物采用改良高碘酸钠氧化法。本发明还公开了这种试剂盒的制备方法和使用方法，本发明试剂盒的优点是相比较单独检测抗原或抗体的试剂，本发明试剂盒可以得到3个检测结果，能够全部测出体内仅有抗原、仅有抗体、抗原抗体均有的情况，且灵敏度高。
【专利说明】-种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒及其制备 方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种人类免疫缺陷病毒抗 原抗体联合检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 获得性免疫缺陷综合征，又称艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syn^ome, AIDS),是由人类免疫缺陷病化IV)感染所引起的一种免疫缺陷性疾病。HIV为逆转录RNA 病毒，根据血清学反应和病毒核酸序列测定，HIV可分为HIV-I型和HIV-2型，二者之间存 在一定的免疫交叉反应，绝大多数艾滋病由HIV-I型引起。HIV有3个结构基因；编码核也 蛋白的gag基因，编码逆转录酶与整合酶的POl基因和编码胞膜蛋白的env基因。在感染 后的10?14d内，病毒RNA进入细胞并呈指数水平上升，随后下降并保持稳定，进入HIV无 症状期。从HIV感染到能够检测出HIV抗体该一时期，被称作"窗口期"，在窗口期，能够通 过病毒RNA、p24抗原和CD4淋己细胞水平来确定HIV感染。
[0003] 据统计，全球估计有3590至4430万人与人类免疫缺陷病毒相伴生存，其中430至 640万人属于新发感染病例，有280至350万人死于艾滋病，该些数字并在不断增长中。2013 年我国艾滋病病毒感染者约100万人，因艾滋病死亡约24万人，居亚洲第2位。梅毒感染 者近年来持续上升，为己类传染病第H位，目前，艾滋病已成为严重威胁世界人民健康的公 共卫生问题。
[0004] 艾滋病毒的检测十几年来一直沿用传统的酶免方法，但随着民众法律意识的强 化、对健康关注度的提升W及院方医疗风险防范意识的普及等，传统酶免检测的灵敏度和 特异性得到了挑战。但鉴于方法学的限制，酶免技术已经很难再有改进，本发明专利即提供 一种抗原抗体联合检测的试剂盒。本发明试剂盒将HIV抗原与抗p24抗体一起包被固相载 体，可同时检测样品中的抗体和p24抗原，该一技术的应用使得HIV感染的常规检测窗口 期明显缩短。筛查人类免疫缺陷病毒化IV)抗体可W使HIV感染者的平均存活时间增加 1.5年W上。
【发明内容】
[0005] 为解决传统酶免检测的灵敏度不高和特异性差的问题，本发明采用的技术方案 是：
[0006] -种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒，所述试剂盒包括：
[0007] (1)双标记酶结合物；
[0008] (2)阴阳性对照物；
[0009] (3)发光液；所述发光液包括发光液1和发光液2,发光液1为含有0. 7g/L鲁米 诺（Luminol)，0. 9g/L肉桂酸，0. 2g/L4-楓苯测酸，0. 25g/L对楓苯酷，25ml/L二甲基甲醜 胺（DMF)，5g/L聚己帰醇（PVA)，8g/L聚己帰化咯焼丽（PVP)，3g/L聚己二醇600 (PEG-600)， 4g/L己二胺四己酸（邸TA)，160万单位/L硫酸庆大霉素，0. 4g/L过氧化脈，pH9. O的 0. Imol/L的Tris缓冲液；发光液2为含有0. Img/ml吓巧醋衍生物、3g/L聚己二醇 600(PEG-600)、0. 1% TWEEN-20pH9. 0 的 0. Imol/L 的 Tris 缓冲液；
[0010] (4)微孔包被板。
[0011] 进一步，所述双标记酶结合物的制备方法是；采用改良高楓酸轴氧化法，将辣根过 氧化物酶标记到HIV嵌合抗原上，采用邸C法（常用方法，业内人都知道）将碱性磯酸酶标 记到另一 P24单抗上，将嵌合抗原-HRP按照0. 1 y g/ml，p24m油-ALP按照0. 2 y g/ml稀释 到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶结合物稀释液中，作为酶工作液，于2?8°C下储 存。
[0012] 进一步，所述微孔板包被制备方法是；将包含有甜36,甜41，甜120的嵌合抗原和 p24单抗用0. 02M磯酸盐缓冲液稀释至1?10 y g/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料 微孔板中，37C包被2小时或2-8C包被16小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS缓冲液洗板， 然后加入含0. 5% BSA的磯酸盐缓冲液封闭微孔板，37C封闭2小时或2-8C封闭16小时； 弃去孔内液体，甩干后于37C烘干4小时；装入铅铅袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于 2 ?8〇C。
[001引进一步，所述阴阳性对照物分比为：阴性混合人血清作为阴性对照，在阴性血清中 加入HIV-I抗体作为阳性对照1，在阴性血清中加入HIV-2抗体作为阳性对照2,在阴性血 清中加入p24抗原作为阳性对照3。
[0014] 本发明还公开了该种试剂盒的使用方法：
[0015] (1)将50 y 1阴性对照和H个阳性对照及待检样品分别加入微孔板不同微孔中， 37 C赔育30分钟；
[0016] (2)用含有tween20的Tris盐缓冲液清洗微孔板5次，拍干；
[0017] (3)每孔加入50 y 1双标记酶结合物，37C赔育30分钟；
[0018] (4)同第（2)步完成清洗后，每孔各加入IOOy 1发光液1，赔育5分钟用光子计数 器读数，所测发光值W阴性对照的2. 1倍作为cutoff判定值进行S/C0计算；
[0019] (5)完成读数后同第（2)步完成清洗后，每孔加入100 Ul发光液2,赔育10分钟 用光子计数器读数，所测发光值W阴性对照的2. 1倍作为cutoff判定值进行S/C0计算；
[0020] 做第（4)步所测S/C0值大于等于1的样本判定为抗体阳性；
[002。 （7)第妨步所测S/C0值大于等于1的样本判定为抗原阳性；
[0022] (8)第（6)步和第（7)步所测S/C0的和为抗原抗体联合检测结果。
[0023] 本发明的HIV化学发光免疫定量测定试剂盒，采用双标记，双底物的化学发光免 疫分析检测方法，突破了传统单标记、单底物的检测技术，具有W下优点：
[0024] (1)相比较单独检测抗原或抗体的试剂，本发明试剂盒可W得到3个检测结果，能 够全部测出体内仅有抗原、仅有抗体、抗原抗体均有的情况，且灵敏度高，在体内抗原或抗 体量很少时也能测出，弥补了单独检测抗原或抗体的不足；相比较抗原抗体联检、单独标记 的试剂，本发明试剂盒增强了灵敏度，能更加有效的区分"窗口期"、"无症状期"、"艾滋病发 病期"等阶段，为临床诊断治疗提供了更加准确可靠的结果，能更好的对患者进行治疗；
[00巧](2)反应快速，可W在30min内出结果，操作简便，无污染；
【具体实施方式】
[0026] 实施例1
[0027] -种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒，所述试剂盒包括：
[0028] (1)双标记酶结合物；
[0029] (2)阴阳性对照物；
[0030] (3)发光液；所述发光液包括发光液1和发光液2,发光液1为含有0. 7g/L鲁米 诺，0. 9g/L肉桂酸，0. 2g/L4-楓苯测酸，0. 25g/L对楓苯酷，25ml/L二甲基甲醜胺，5g/L聚 己帰醇，8g/L聚己帰化咯焼丽，3g/L聚己二醇600,4g/L己二胺四己酸，160万单位/L硫酸 庆大霉素，0. 4g/L过氧化脈，pH9. 0的0. Imol/L的Tris缓冲液；发光液2为含有0. Img/ml 吓巧醋衍生物、3g/L聚己二醇600、0. 1% TWEEN-20pH9. 0的0. Imol/L的Tris缓冲液；
[0031] (4)微孔包被板。
[00础 实施例2
[0033] 实施例1所述试剂盒的制备方法
[0034] 1、微孔板包被；将包含有甜36,甜41，甜120的嵌合抗原和p24单抗用0. 02M磯酸 盐缓冲液稀释至1?lOug/mU同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中，37C包被2小 时或2-8C包被16小时；弃去孔内液体，用抑7. 4PBS缓冲液洗板，然后加入含0. 5% BSA的 磯酸盐缓冲液封闭微孔板，37C封闭2小时或2-8C封闭16小时；弃去孔内液体，甩干后于 37C烘干4小时；装入铅铅袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2?8C ;
[00巧]2、双标记酶结合物制备：采用改良高楓酸轴氧化法，将辣根过氧化物酶标记到 HIV嵌合抗原上，采用邸C法将碱性磯酸酶标记到另一 P24单抗上，将嵌合抗原-HRP按照 0. 1 y g/ml，p24m油-ALP按照0. 2 y g/ml稀释到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶结合 物稀释液中，作为酶工作液，于2?8C下储存；
[003引 3、阴阳性对照物；采用阴性混合人血清作为阴性对照，在阴性血清中加入HIV-I 抗体作为阳性对照1，在阴性血清中加入HIV-2抗体作为阳性对照2,在阴性血清中加入p24 抗原作为阳性对照3 ;
[0037] 4、发光底物液1，发光底物液2 ;发光液1为含有0. 7g/L鲁米诺（Luminol)，0.9g/ L肉桂酸，0. 2g/L4-楓苯测酸，0. 25g/L对楓苯酷，25ml/L二甲基甲醜胺（DMF)，5g/L聚己 帰醇（PVA)，8g/L聚己帰化咯焼丽（PVP)，3g/L聚己二醇600 (PEG-600)，4g/L己二胺四 己酸（邸TA)，160万单位/L硫酸庆大霉素，0. 4g/L过氧化脈，pH9. 0的0. Imol/L的Tris 缓冲液；发光液2为含有0. Img/ml吓巧醋衍生物、3g/L聚己二醇600(阳G-600)、0. 1% TWEEN-20pH9. 0 的 0. Imol/L 的 Tris 缓冲液。
[00測 实施例3
[0039] 实施例1所述试剂盒的使用方法
[0040] (1)将50 U 1阴性对照和H个阳性对照及待检样品分别加入微孔板不同微孔中， 37 C赔育30分钟；
[00川 （2)用含有tween20的Tris盐缓冲液清洗微孔板5次，拍干；
[0042] (3)每孔加入50 U 1双标记酶结合物，37C赔育30分钟；
[0043] (4)同第（2)步完成清洗后，每孔各加入IOOy 1发光液1，赔育5分钟用光子计数 器读数，所测发光值W阴性对照的2. 1倍作为cutoff判定值进行S/C0计算；
[0044] (5)完成读书后同第（2)步完成清洗后，每孔加入100 Ul发光液2,赔育10分钟 用光子计数器读数，所测发光值W阴性对照的2. 1倍作为cutoff判定值进行S/C0计算；
[0045] (6)第（4)步所测S/C0值大于等于1的样本判定为抗体阳性；
[004引 （7)第妨步所测S/C0值大于等于1的样本判定为抗原阳性；
[0047] (8)第（6)步和第（7)步所测S/C0的和为抗原抗体联合检测结果。
[004引 实施例4
[004引 1.国豕参考品
[0050] 1. 1.使用国家参考品对试剂盒进行评估，结果如下。
[0051] 表1 HIV抗体国家参考品检测结果
[0052]
【权利要求】
1. 一种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (1) 双标记酶结合物； (2) 阴阳性对照物； (3) 发光液；所述发光液包括发光液1和发光液2,发光液1为含有0. 7g/L鲁米诺， 0. 9g/L肉桂酸，0. 2g/L4-碘苯硼酸，0. 25g/L对碘苯酚，25ml/L二甲基甲酰胺，5g/L聚乙烯 醇，8g/L聚乙烯吡咯烷酮，3g/L聚乙二醇600,4g/L乙二胺四乙酸，160万单位/L硫酸庆大 霉素，0. 4g/L过氧化脲，pH9. 0的0. lmol/L的Tris缓冲液；发光液2为含有0. lmg/ml吖啶 酯衍生物、3g/L 聚乙二醇 600、0. 1% TWEEN-20pH9. 0 的 0. lmol/L 的 Tris 缓冲液； (4) 微孔包被板。
2. 根据权利要求1所述的一种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在 于，所述双标记酶结合物的制备方法是：采用改良高碘酸钠氧化法，将辣根过氧化物酶标记 到HIV嵌合抗原上，采用EDC法将碱性磷酸酶标记到另一 P24单抗上，将嵌合抗原-HRP按 照0. 1 μ g/ml，p24mab-ALP按照0. 2 μ g/ml稀释到含有牛血清白蛋白和proclin300的酶结 合物稀释液中，作为酶工作液，于2?8°C下储存。
3. 根据权利要求1所述的一种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒,其特征 在于，所述微孔板包被制备方法是：将包含有gp36, gp41，gpl20的嵌合抗原和p24单抗用 0. 02M磷酸盐缓冲液稀释至1?10 μ g/mL，同时加入到96孔白色不透明塑料微孔板中， 37°C包被2小时或2-8°C包被16小时；弃去孔内液体，用pH7. 4PBS缓冲液洗板，然后加入 含0. 5% BSA的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，37°C封闭2小时或2-8°C封闭16小时；弃去孔内 液体，甩干后于37°C烘干4小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2?8°C。
4. 根据权利要求1所述的一种人类免疫缺陷病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在 于，所述阴阳性对照物分别为：阴性混合人血清作为阴性对照，在阴性血清中加入HIV-1抗 体作为阳性对照1，在阴性血清中加入HIV-2抗体作为阳性对照2,在阴性血清中加入p24 抗原作为阳性对照3。
5. 权利要求1-4任一权利要求所述本发明试剂盒的使用方法： (1) 将50μ 1阴性对照和三个阳性对照及待检样品分别加入微孔板不同微孔中，37°C 孵育30分钟； (2) 用含有tween20的Tris盐缓冲液清洗微孔板5次，拍干； (3) 每孔加入50 μ 1双标记酶结合物，37°C孵育30分钟； (4) 同第⑵步完成清洗后，每孔各加入ΙΟΟμΙ发光液1，孵育5分钟用光子计数器读 数，所测发光值以阴性对照的2. 1倍作为cutoff判定值进行S/C0计算； (5) 完成读数后同第（2)步完成清洗后，每孔加入100μ 1发光液2,孵育10分钟用光 子计数器读数，所测发光值以阴性对照的2. 1倍作为cutoff判定值进行S/C0计算； (6) 第（4)步所测S/C0值大于等于1的样本判定为抗体阳性； (7) 第（5)步所测S/C0值大于等于1的样本判定为抗原阳性； (8) 第（6)步和第（7)步所测S/C0的和为抗原抗体联合检测结果。
【文档编号】G01N33/535GK104237510SQ201410466445
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】刘萍, 栾大伟, 张振斌, 侯玉文, 杨桂霞, 李克锦 申请人:博奥赛斯（天津）生物科技有限公司