基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法，该方法采用离体的心肌细胞培养，构建高性能且成本低廉的心肌细胞传感器，采用图像采集、RGB图像转灰度图像、图像二值化、图像矩阵化和峰值检测算法计算检测出心肌细胞机械搏动时搏动图像的变化，并使用搏动图像差异值来量化心肌细胞机械搏动，实现心肌细胞机械搏动的速率、幅度和搏动间隙的检测；通过分析药物作用下的心肌细胞机械搏动状态随时间的变化，评价药物的心脏毒性；较现有的药物心脏毒性检测分析方法，本发明具有无标记，无损，成本低廉，操作步骤简单，并能够直观，长时间且单一性地观察评价药物的心脏毒性等优点。
【专利说明】 基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物心脏毒性检测分析技术，尤其涉及一种基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法。
【背景技术】
[0002]心脏安全是新药开发、批准和使用中最为关注的问题，但是目前许多药物由于在心脏安全上存在问题而受到限制或从市场上撤回，从而造成药物损耗。引起尖端扭转(况?)是大多药物对心脏的副作用。1(1？是一种室性心动过速，在心电图上表现为基线处附近的振荡形态。1(1？的成因是心肌细胞膜上的快速延迟整流1(+离子通道1X1'受到抑制，而I&由人类相关基因仏服册61:1161—8-80-80-1-6181:6(1 ^6116,112^6)编码。1X1'是人类心室肌细胞主要的复极化电流，当受到抑制时，会引起去极化与复极化的时间延长，最终导致1(1？。因此，为了评估药物是否会产生1(1？，研发中的候选药物需要进行抑制的筛选。鉴于药物心脏安全性评价的重要性，目前国内外，大量的离体组织、在体动物、生物方法和模型等用于进行药物分析。离体组织和在体动物实验方法可以直接测试药物心脏毒性，但同时具有通量较低、操作复杂且成本较高等缺点。证如抑制剂与受体蛋白的生物方法无法体现心脏在药物作用后的连续和长时间地变化过程。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法，该方法在药物心脏毒性检测分析系统上实现，所述药物心脏毒性检测分析系统包括:心肌细胞传感器培养板、正立显微镜、摄像头和计算机；其中，心肌细胞传感器培养板固定在正立显微镜的载物台上《⑶摄像头固定在正立显微镜上方《⑶摄像头通过旧8连接线与计算机连接；该方法包括以下步骤:
(1)心肌细胞培养:获取待测心肌细胞，在高糖培养基中培养，制成心肌细胞的细胞悬液；经过活细胞计数后，将原细胞悬液配制成170，000个加1的细胞悬液；最后在心肌细胞传感器培养板中任意选择一个孔中加入100沿细胞悬液，使孔中细胞数量为17000个丨孔，将心肌细胞传感器培养板置于培养箱培养96小时，使得心肌细胞良好贴附于心肌细胞传感器培养板的表面，构建出心肌细胞传感器；
(2)配制待测药物标准样品溶液:用二甲基亚砜(0130)配制成1.6禮的标准样品溶液储存液；用高糖培养基依次稀释储存液，得到不同浓度梯度的工作液；
(3)对照组心肌细胞传感器机械搏动状态检测:首先将心肌细胞传感器培养板放置在正立显微镜的在载物台上，使用40倍物镜和10倍目镜，调整正立显微镜载物台的位置和调焦旋钮，在视野中能清晰看到心肌细胞；其次通过计算机控制冗0摄像头进行心肌细胞搏动图像采集，然后计算心肌细胞的机械搏动曲线；最后通过心肌细胞的机械搏动曲线计算对照组搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数，处理过程包括以下子步骤:
(3.1)将采集的心肌细胞搏动图像的第一帧作为对照帧图像；
(3.2)将对照帧图像进行灰度化，采用的灰度化公式为:
0^=^0.299+0X0^ 587+8^0.114
其中，以^7指图像像素二值化后的灰度值，和8分别指原始图像像素红、绿和蓝通道的值；
(3.3)采用大律法对步骤3.2灰度化后的图像进行二值化，将I记为图像前景和背景的分割阈值，％记为前景像素点数与图像总像素点数的比例，图像前景平均灰度为％ 为背景像素点数与图像总像素点数的比例，图像背景平均灰度为％ ；将11记为图像的总平均灰度，计算公式为；6记为最大类间方差，从最小灰度到最大灰度值遍历I，依据计算公式(+-11)2,当I使得6最大时，取此时的I为最佳的分割阈值；然后依据I，将图像像素灰度值小于I的取为0，图像像素灰度值大于I的取为1，实现灰度图像的二值化；
(3.4)采集随后的心肌细胞搏动图像的序列帧图像作为实时帧图像，按照步骤(3.2)和(3.3)对实时帧图像进行灰度化和二值化处理；
(3.5)将灰度化后的实时帧图像与灰度化后的对照帧图像做图像减法，获得减法图像；然后将减法图像进行图像像素点的矩阵化，获得图像矩阵，此时矩阵元素值为-1、0和1三者其中之一；
(3.6)对图像矩阵元素进行绝对值化，然后对绝对值化后的图像矩阵进行元素求和，其和即为搏动图像差异值；
(3.7)以时间为横坐标，步骤3.6计算出的实时帧图像的搏动图像差异值为纵坐标绘制曲线，该曲线即为心肌细胞机械搏动曲线；
(3.8)对心肌细胞机械搏动曲线进行小波变换，采用7层多尺度分析方法；
(3.9)将7层多尺度分析结果中的近似分量八7、细节分量01、02和03进行置零，然后采用小波逆变换重构心肌细胞机械搏动曲线，即得到去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线.(3.10)计算去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的均方差，并将其定为阈值:将去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线中大于阈值的位点记为1，小于阈值的位点记为0，然后再进行差分，曲线结果数值为1、0和-1三者之一；其中曲线值为1的位点为波峰位点的左边缘，曲线值为-1的位点为波峰位点的右边缘；
(3.11)依据步骤(3.10)中得出的左边缘和右边缘位点，求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最大值，最大值位点即为波峰位点；求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最小值，最小值位点即为波谷位点；最大值与最小值的差即为心肌细胞机械搏动幅度；连续的波峰位点之间的时间间隔比值，即为心肌细胞机械搏动间隙；
(3.12)每隔30秒统计波峰位点个数、搏动幅度和搏动间隙，将统计波峰位点个数记为30秒内心肌细胞搏动的平均速率；以时间为X轴，心肌细胞搏动的平均速率为7轴，构建心肌细胞搏动平均速率曲线；以时间为X轴，搏动幅度为7轴，构建心肌细胞搏动幅度曲线；以时间为X轴，心肌细胞搏动间隙为1轴，构建心肌细胞搏动间隙曲线； (4)分析药物溶液样品的心脏毒性:将步骤(2)稀释后的体积为20沿的不同浓度梯度的工作液分别加入心肌细胞传感器培养板中，重复步骤(3),检测心肌细胞在不同浓度梯度的工作液作用下的搏动曲线、搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数；将所得的搏动速率、搏动幅度和搏动间隙与步骤(3)对照组所得的相同参数，采用归一化处理，即以对照组的每个时间点的状态参数作为基准，药物作用下的状态参数与同一时刻对照组的基准相比，进行归一化计算，通过计算结果，便可分析药物心脏毒性对心肌细胞搏动速率，搏动幅度和搏动间隙的影响。
[0005]本发明的有益效果是:本发明方法具有成本低廉且能够长时间、直观化地观察药物对心肌细胞的作用变化从而评估药物心脏毒性等优点。本发明较现有的药物心脏安全性分析方法上，具有操作步骤简单，成本低和长时直观化地观察药物心脏毒性作用变化等优点，除了配制标准品溶液和接种细胞等简单步骤外无需其他步骤。根据以上优点，本发明方法可成为药物筛选领域的新工具，并广泛应用于该领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1是本发明方法所使用的检测系统整体结构图；
图2是本发明方法流程图；
图3是本发明心肌细胞传感器检测阿霉素心脏毒性的搏动曲线结果图；
图4是本发明阿霉素心脏毒性分析的搏动速率结果图；
图5是本发明阿霉素心脏毒性分析的搏动幅度结果图；
图6是本发明阿霉素心脏毒性分析的搏动间隙结果图；
图中:心肌细胞传感器培养板1、…8连接线2、正立显微镜3、摄像头4、计算机5。
【具体实施方式】
[0007]以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细描述，但并不是限制本发明。
[0008]本发明基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法，该方法在药物心脏毒性检测分析系统上实现，如图1所示，所述药物心脏毒性检测分析系统包括:心肌细胞传感器培养板1、正立显微镜摄像头4和计算机5 ；其中，心肌细胞贴附在心肌细胞传感器培养板1的表面；心肌细胞传感器培养板1固定在正立显微镜3的载物台上《⑶摄像头4固定在正立显微镜3上方《⑶摄像头4通过…8连接线2与计算机5连接，从而将采集信号传输给计算机5进行后处理；该方法包括以下步骤:
(1)心肌细胞培养:将大鼠心脏心尖部置于预冷的高糖培养基(0121)中；然后将漂洗后的心尖组织在预冷的0121中去除心房和血管组织；之后在501玻璃瓶中加入201预冷的平衡盐溶液￠833)，将心尖转移到耶33中，剪成1臟3的小块，加入胶原酶溶液，该胶原酶溶液由质量分数为0.07%胰蛋白酶和质量分数为0.05%小鼠胶原酶II在耶33中混合而成；在玻璃瓶中，经胶原酶溶液消化后的残余组织块中加入5“含有体积百分比10%胎牛血清(^88)的0腿1培养基，收集上清液置于含有体积百分比10%？83的0腿1培养基中；将混合后的上清液800印111离心5111111，在沉淀中加入501高糖培养基轻轻吹打以重悬细胞；将重悬的心肌细胞过200目细胞筛，并将细胞收集到51111高糖培养基，组成新的细胞悬液放入501111离心管中；将细胞悬液收集到培养瓶中，进行差速贴壁2次，每次4501！！，以去除纤维细胞和其它细胞；之后将差速贴壁后的心肌细胞悬液转移到50“离心管中进行细胞计数；而后吸取100耵细胞悬液，混合加入100耵台盼蓝染液并置于室温下，加化后进行活细胞计数；经过计数后，将培养瓶中的细胞悬液配制成170，000个加1的细胞悬液；最后在心肌细胞传感器培养板1中任意选择一个孔中加入100沿细胞悬液，使孔中细胞数量为17000个丨孔，将心肌细胞传感器培养板1置于培养箱培养96小时，使得心肌细胞良好贴附于心肌细胞传感器培养板1，构建出心肌细胞传感器。
[0009](2)配制待测药物标准样品溶液:用二甲基亚砜(0130)配制成1.6禮的标准样品溶液储存液；用高糖培养基依次稀释储存液，得到不同浓度梯度的工作液。
[0010](3)对照组心肌细胞传感器机械搏动状态检测:首先将心肌细胞传感器培养板1放置在正立显微镜3的在载物台上，使用40倍物镜和10倍目镜，调整正立显微镜3载物台的位置和调焦旋钮，在视野中能清晰看到心肌细胞^将^⑶摄像头4的帧率设置为24^8 ；其次如图2所示，通过计算机5控制冗0摄像头4进行心肌细胞搏动图像采集，然后计算心肌细胞的机械搏动曲线；最后通过心肌细胞的机械搏动曲线计算对照组搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数，处理过程包括以下子步骤:
(3.1)将采集的心肌细胞搏动图像的第一帧作为对照帧图像；
(3.2)将对照帧图像进行灰度化，采用的灰度化公式为:
61-87=^^0.299+6^0.587+8^0.114
其中，以^7指图像像素二值化后的灰度值，I？』和8分别指原始图像像素红、绿和蓝通道的值；
(3.3)采用大律法对步骤3.2灰度化后的图像进行二值化，将I记为图像前景和背景的分割阈值，％记为前景像素点数与图像总像素点数的比例，图像前景平均灰度为％ 为背景像素点数与图像总像素点数的比例，图像背景平均灰度为111 ；将11记为图像的总平均灰度，计算公式为；6记为最大类间方差，从最小灰度到最大灰度值遍历I，依据计算公式(+-11)2,当I使得6最大时，取此时的I为最佳的分割阈值；然后依据I，将图像像素灰度值小于I的取为0，图像像素灰度值大于I的取为1，实现灰度图像的二值化；
(3.4)采集随后的心肌细胞搏动图像的序列帧图像作为实时帧图像，按照步骤(3.2)和(3.3)对实时帧图像进行灰度化和二值化处理；
(3.5)将灰度化后的实时帧图像与灰度化后的对照帧图像做图像减法，获得减法图像；然后将减法图像进行图像像素点的矩阵化，获得图像矩阵，此时矩阵元素值为-1、0和1三者其中之一；
(3.6)对图像矩阵元素进行绝对值化，然后对绝对值化后的图像矩阵进行元素求和，其和即为搏动图像差异值；
(3.7)以时间为横坐标，步骤3.6计算出的实时帧图像的搏动图像差异值为纵坐标绘制曲线，该曲线即为心肌细胞机械搏动曲线；
(3.8)对心肌细胞机械搏动曲线进行小波变换，采用7层多尺度分析方法；
(3.9)将7层多尺度分析结果中的近似分量八7、细节分量01、02和03进行置零，然后采用小波逆变换重构心肌细胞机械搏动曲线，即得到去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线.， (3.10)计算去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的均方差，并将其定为阈值:将去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线中大于阈值的位点记为1，小于阈值的位点记为0，然后再进行差分，曲线结果数值为1、0和-1三者之一；其中曲线值为1的位点为波峰位点的左边缘，曲线值为-1的位点为波峰位点的右边缘；
(3.11)依据步骤(3.10)中得到的左边缘和右边缘位点，求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最大值，最大值位点即为波峰位点；求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最小值，最小值位点即为波谷位点；最大值与最小值的差即为心肌细胞机械搏动幅度；连续的波峰位点之间的时间间隔比值，即为心肌细胞机械搏动间隙；
(3.12)每隔30秒统计波峰位点个数、搏动幅度和搏动间隙，将统计波峰位点个数记为30秒内心肌细胞搏动的平均速率；以时间为X轴，心肌细胞搏动的平均速率为1轴，构建心肌细胞搏动平均速率曲线；以时间为X轴，搏动幅度为7轴，构建心肌细胞搏动幅度曲线；以时间为X轴，心肌细胞搏动间隙为1轴，构建心肌细胞搏动间隙曲线；
(4)分析药物溶液样品的心脏毒性:将步骤(2)稀释后的体积为20沿的不同浓度梯度的工作液分别加入心肌细胞传感器培养板1中，重复步骤(3),检测心肌细胞在不同浓度梯度的工作液作用下的搏动曲线、搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数；将所得的搏动速率、搏动幅度和搏动间隙与步骤(3)对照组所得的相同参数，采用归一化处理，即以对照组的每个时间点的状态参数作为基准，药物作用下的状态参数与同一时刻对照组的基准相比，进行归一化计算，通过计算结果，便可分析药物心脏毒性对心肌细胞搏动速率，搏动幅度和搏动间隙的影响。
[0011]根据上述的基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法，评价1、4和16 三种不同浓度的阿霉素药物样品溶液心脏毒性。如图3所示，为10分钟时，对照组、和16 阿霉素溶液心肌细胞的机械搏动曲线图。如图4、5和6所示，分别为搏动速率、搏动幅度和搏动间隙归一化计算结果。不同浓度的药物阿霉素在作用10分钟后，使心肌细胞搏动速率分别降为对照组的57.35%、51 15%和35.29%，使搏动幅度分别降为对照组的75.38%、64 42%和58.98%，使搏动间隙分别降为对照组的342.509(^297.78%和240.00%。实验结果证明本发明方法能够进行药物心脏毒性检测分析。
【权利要求】
1.一种基于心肌细胞传感器的药物心脏毒性检测分析方法，该方法在药物心脏毒性检测分析系统上实现，所述药物心脏毒性检测分析系统包括:心肌细胞传感器培养板(I)、正立显微镜(3)、CXD摄像头(4)和计算机(5);其中，心肌细胞传感器培养板(I)固定在正立显微镜(3)的载物台上；(XD摄像头(4)固定在正立显微镜(3)上方；(XD摄像头(4)通过USB连接线(2)与计算机(5)连接；其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)心肌细胞培养:获取待测心肌细胞，在高糖培养基中培养，制成心肌细胞的细胞悬液；经过活细胞计数后，将原细胞悬液配制成170，000个/ml的细胞悬液；最后在心肌细胞传感器培养板(I)中任意选择一个孔中加入ΙΟΟμΙ细胞悬液，使孔中细胞数量为17000个/孔，将心肌细胞传感器培养板(I)置于培养箱培养96小时，使得心肌细胞良好贴附于心肌细胞传感器培养板(I)的表面，构建出心肌细胞传感器； (2)配制待测药物标准样品溶液:用二甲基亚砜配制成1.6mM的标准样品溶液储存液；用高糖培养基依次稀释储存液，得到不同浓度梯度的工作液； (3)对照组心肌细胞传感器机械搏动状态检测:首先将心肌细胞传感器培养板(I)放置在正立显微镜(3)的在载物台上，使用40倍物镜和10倍目镜，调整正立显微镜(3)载物台的位置和调焦旋钮，在视野中能清晰看到心肌细胞；其次通过计算机(5)控制CXD摄像头(4)进行心肌细胞搏动图像采集，然后计算心肌细胞的机械搏动曲线；最后通过心肌细胞的机械搏动曲线计算对照组搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数，处理过程包括以下子步骤: (3.1)将采集的心肌细胞搏动图像的第一帧作为对照帧图像； (3.2)将对照帧图像进行灰度化，采用的灰度化公式为:
Gray=RX0.299+GX0.587+BX0.114 其中，Gray指图像像素二值化后的灰度值，R、G和B分别指原始图像像素红、绿和蓝通道的值； (3.3)采用大律法对步骤3.2灰度化后的图像进行二值化，将T记为图像前景和背景的分割阈值，Wtl记为前景像素点数与图像总像素点数的比例，图像前景平均灰度为Utl ；w,为背景像素点数与图像总像素点数的比例，图像背景平均灰度为U1 ;将u记为图像的总平均灰度，计算公式为U=WciXuc^W1Xu1 ；G记为最大类间方差,从最小灰度到最大灰度值遍历T,依据计算公式G=WtlX (Utl-U)^lX (U1-U)2,当T使得G最大时，取此时的T为最佳的分割阈值；然后依据T，将图像像素灰度值小于T的取为0，图像像素灰度值大于T的取为1，实现灰度图像的二值化； (3.4)采集随后的心肌细胞搏动图像的序列帧图像作为实时帧图像，按照步骤(3.2)和(3.3)对实时帧图像进行灰度化和二值化处理； (3.5)将灰度化后的实时帧图像与灰度化后的对照帧图像做图像减法，获得减法图像；然后将减法图像进行图像像素点的矩阵化，获得图像矩阵，此时矩阵元素值为_1、0和I三者其中之一； (3.6)对图像矩阵元素进行绝对值化，然后对绝对值化后的图像矩阵进行元素求和，其和即为搏动图像差异值； (3.7)以时间为横坐标，步骤3.6计算出的实时帧图像的搏动图像差异值为纵坐标绘制曲线，该曲线即为心肌细胞机械搏动曲线； (3.8)对心肌细胞机械搏动曲线进行小波变换，采用7层多尺度分析方法； (3.9)将7层多尺度分析结果中的近似分量A7、细节分量Dl、D2和D3进行置零，然后采用小波逆变换重构心肌细胞机械搏动曲线，即得到去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线.(3.10)计算去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的均方差，并将其定为阈值:将去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线中大于阈值的位点记为1，小于阈值的位点记为0，然后再进行差分，曲线结果数值为1、0和-1三者之一；其中曲线值为I的位点为波峰位点的左边缘，曲线值为-1的位点为波峰位点的右边缘； (3.11)依据步骤(3.10)中得出的左边缘和右边缘位点，求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最大值，最大值位点即为波峰位点；求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最小值，最小值位点即为波谷位点；最大值与最小值的差即为心肌细胞机械搏动幅度；连续的波峰位点之间的时间间隔比值，即为心肌细胞机械搏动间隙； (3.12)每隔30秒统计波峰位点个数、搏动幅度和搏动间隙，将统计波峰位点个数记为30秒内心肌细胞搏动的平均速率；以时间为X轴，心肌细胞搏动的平均速率为I轴，构建心肌细胞搏动平均速率曲线；以时间为X轴，搏动幅度为y轴，构建心肌细胞搏动幅度曲线；以时间为X轴，心肌细胞搏动间隙为y轴，构建心肌细胞搏动间隙曲线； (4)分析药物溶液样品的心脏毒性:将步骤(2)稀释后的体积为20μ1的不同浓度梯度的工作液分别加入心肌细胞传感器培养板(I)中，重复步骤(3)，检测心肌细胞在不同浓度梯度的工作液作用下的搏动曲线、搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数；将所得的搏动速率、搏动幅度和搏动间隙与步骤(3)对照组所得的相同参数，采用归一化处理，即以对照组的每个时间点的状态参数作为基准，药物作用下的状态参数与同一时刻对照组的基准相t匕，进行归一化计算，通过计算结果，便可分析药物心脏毒性对心肌细胞搏动速率，搏动幅度和搏动间隙的影响。
【文档编号】G01N21/84GK104297249SQ201410469093
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】王平, 苏凯麒, 胡宁, 王琴, 邹玲, 黎洪波, 邹瞿超, 曹端喜 申请人:浙江大学