-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用，属于生物传感检测【技术领域】。基于TiO2-CdSe复合物作为光电信标物质，CdSe量子点以其量子尺寸效应、介电效应及表面积效应，增强了TiO2的光电性能，可实现对实体组织目标DNA及其管家基因的灵敏、特异及快速检测，本发明制备的传感器具有设备简单、成本低、易于微型化和集成化的优点，易于推广。
【专利说明】—种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用，该传感器用于生物组织DNA的检测，属于生物传感检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]纵观适配体传感器的发展，可以发现大多数课题组对于DNA传感器的研究主要集中在短链DNA(20-60bp)，同时这些DNA大多是根据需要，事先根据一定的规则进行设计，然后由生物公司代工合成，但DNA片段并非实际存在，应用价值不大。若要使DNA生物传感器用于实际检测，则被检测的DNA应该是真实存在的，这就需要从实际问题中找寻需要检测、识别的DNA，然后根据需要，设计传感器，应用于实践。
[0003]鉴于此，本专利将利用T12-CdSe纳米复合材料的信号放大作用及体系中光致电信号的强度变化，对真实生物细胞经培养后抽提的DNA目标片段进行检测。本发明具有成本低、制备简单、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，克服了目前DNA检测方法局限于纯生物领域的弊端。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是基于赖氨酸对DNA的生物特异亲和性及T12-CdSe纳米复合材料，制备了一种特异性强，灵敏度高的光电生物传感器；
本发明的目的之二是将该传感器用于实体组织抽提DNA的检测。
[0005]本发明的技术方案如下:
1.一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法
(1)将1.0 cmX2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min,纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05、.2V/s扫速，在-1.5?2.5 V电位范围，在含有5 X 10_3 mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0?9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
(2)滴涂2?18μ?的T12-固态CdSe复合物或2?18μ?的T12-液态CdSe复合物到
(I)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(3)继续滴涂10?20μ?、5?50 Pg/mL的目标DNA的上游引物或10?20 μ?、1(Γ20 Pg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(4)继续滴涂10?20μ?、5?50 Pg/mL的目标DNA的下游引物或10?20 μ?、1(Γ20 Pg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
[0006]2.上述T12-固态CdSe复合物和T12-液态CdSe复合物制备
(I)T12的制备 0.ΟΓΟ.03 mol的钛酸丁酯溶于30?90 ml乙醇中，逐滴加入至l(T30mL超纯水中，搅拌12 min，将得到的混合物转移至高压釜中，200 °C下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4?8次，80 °C下真空干燥12 h，制得T12;
(2)CdSe的制备
移取0.6?1.0 mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250 mL三口烧瓶中，用I mol/L NaOH调pH至10，加入8?12 mL Na2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe ;将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe ；
所述Na2SeSO3溶液是将I?20 mmol Se和5?15 mmol Na2SO3加入到50mL超纯水中，90°C反应3 h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将1?2 g CdCl2.2.5H20溶于40 mL超纯水制得；
(3)T12-固态CdSe复合物的制备
将0.002?0.006 g T12,0.002?0.006 g固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡8?12 h, 11000转/min、23°C下离心15 min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水，超声，制得T12-固态CdSe复合物；
(4)T12-液态CdSe复合物的制备
0.002?0.006 g T12与2?6mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡8?12 h，11000转/min离心15 min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水,超声,制得T12-液态CdSe复合物。
[0007]3.目标DNA及其管家基因的检测步骤
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在1(T50 mL、pH7?9的PBS，0.Γθ.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔20 S，取样时间20 S，运行时间400 S，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm,记录电流变化,绘制工作曲线；
(3 )将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定。
[0008]本发明的成果:
(I )L-赖氨酸有良好的热稳定性、生物亲和性，本发明中将L-赖氨酸进行电聚合，修饰于ITO电极表面，提供了可保持生物活性的固载DNA等生物大分子的方法，同时该方法不需经过预处理，电极选择性、灵敏度和重现性较好，电极响应快，测得线性范围为3.5 pmol/L?30 nmol/L,检测限为 1.2 pmol/L。
[0009](2)本发明使用T12做为光电信标物质之一，拓展了 T12的使用范畴，同时利用CdSe量子点显著的量子尺寸效应及小的粒子尺寸，增强了传感器的光电性能。
[0010](3)本发明所检测DNA均从实际生物组织中提取，实用价值高。
[0011]【具体实施方式】:
为进一步说明，结合一下实施例具体说明:
实施例1 一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法 (1)将1.0 cmX2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min,纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05、.2乂/8扫速，在-1.5?2.5 V电位范围，在含有5 X 10_3 mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
(2)滴涂2PL的T12-固态CdSe复合物或2PL的T12-液态CdSe复合物到(I)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(3)继续滴涂10μ?、5 Pg/mL的目标DNA的上游引物或10 μ?、10 Pg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(4)继续滴涂10μ?、5 Pg/mL的目标DNA的下游引物或10 μ?ΛΟ Pg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
[0012]实施例2 —种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法
(1)将1.0 cmX2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min,纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05、.2乂/8扫速，在_1.5?2.5 V电位范围，在含有5 X 10_3 mol/L的L-赖氨酸、pH为7.4的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
(2)滴涂10μ?的T12-固态CdSe复合物或ΙΟμ?的T12-液态CdSe复合物到(I)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(3)继续滴涂15μ?、25 Pg/mL的目标DNA的上游引物或15 μ?、15Pg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(4)继续滴涂15μ?、30 Pg/mL的目标DNA的下游引物或15 μ?、16 Pg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
[0013]实施例3 —种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法
(1)将1.0 cmX2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min,纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05、.2乂/8扫速，在_1.5?2.5 V电位范围，在含有5 X 10_3 mol/L的L-赖氨酸、pH为9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
(2)滴涂18μ?的T12-固态CdSe复合物或18μ?的T12-液态CdSe复合物到(I)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(3)继续滴涂20μ?、50 Pg/mL的目标DNA的上游引物或20 μ?、20 Pg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干；
(4)继续滴涂20μ?、50 Pg/mL的目标DNA的下游引物或20 μ?、20 Pg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
[0014]实施例4 T12-固态CdSe复合物和T12-液态CdSe复合物制备 (1)T12的制备
0.01 mo I的钛酸丁酯溶于30ml乙醇中，逐滴加入至1mL超纯水中，搅拌12 min,将得到的混合物转移至高压釜中，200 °C下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4次，80°C下真空干燥12 h，制得T12;
(2)CdSe的制备
移取0.6 mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口烧瓶中，用I mol/L NaOH调pH至10，加入8 mL Na2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4h，制得液态CdSe ;将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe ；
所述Na2SeSO3溶液是将I mmol Se和10 mmol Na2SO3加入到50 mL超纯水中，90 V反应3 h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将1.5 g CdCl2.2.5H20溶于40 mL超纯水制得；
(3)T12-固态CdSe复合物的制备
将0.004 g T12,0.004 g固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡10h, 11000转/min、23°C下离心15 min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水,超声,制得T12-固态CdSe复合物；
(4)T12-液态CdSe复合物的制备
0.004 g T12与4mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡10 h，11000转/min离心15min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水,超声,制得T12-液态CdSe复合物。
[0015]实施例5 T12-固态CdSe复合物和T12-液态CdSe复合物制备
(1)T12的制备
0.02 mol的钛酸丁酯溶于60 ml乙醇中，逐滴加入至20 mL超纯水中，搅拌12 min，将得到的混合物转移至高压釜中，200 °C下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗6次，80°C下真空干燥12 h，制得T12;
(2)CdSe的制备
移取0.8mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口烧瓶中，用I mol/L NaOH调pH至10，加入10 mL Na2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe ;将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe ；
所述Na2SeSO3溶液是将10 mmol Se和10 mmol Na2SO3加入到50mL超纯水中，90 V反应3 h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将1.5 g CdCl2.2.5H20溶于40 mL超纯水制得；
(3)T12-固态CdSe复合物的制备
将0.003 g T12,0.003 g固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡10h, 11000转/min、23°C下离心15 min,分离得到固体，将固体加入I mL超纯水,超声,制得T12-固态CdSe复合物；
(4)T12-液态CdSe复合物的制备
0.003 g T12与4mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡10 h，11000转/min离心15min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水,超声,制得T12-液态CdSe复合物。
[0016]实施例6 T12-固态CdSe复合物和T12-液态CdSe复合物制备
(1)T12的制备
0.03 mol的钛酸丁酯溶于90 ml乙醇中，逐滴加入至30mL超纯水中，搅拌12 min,将得到的混合物转移至高压釜中，200 °C下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗8次，80°C下真空干燥12 h，制得T12;
(2)CdSe的制备
移取1.0 mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口烧瓶中，用I mol/L NaOH调pH至10，加入12 mL Na2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe ;将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe ；
所述Na2SeSO3溶液是将20 mmol Se和15 mmol Na2SO3加入到50 mL超纯水中，90 °C反应3 h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将2 g CdCl2.2.5H20溶于40mL超纯水制得；
(3)T12-固态CdSe复合物的制备
将0.006 g T12, 0.006 g固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡12h, 11000转/min、23°C下离心15 min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水,超声,制得T12-固态CdSe复合物；
(4)T12-液态CdSe复合物的制备
0.006 g T12与6mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡12 h，11000转/min离心15min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水,超声,制得T12-液态CdSe复合物。
[0017]实施例7目标DNA的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在10 mL、pH 7的PBS，0.lmmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对目标DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔20 S，取样时间 20 s,运行时间 400 s,光源选择 365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm,记录电流变化,绘制工作曲线；
(3)将待测样品代替目标DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定；
(4)线性范围3.5 pmol/L?25 nmol/L，检测限为 1.2 pmol/L。
[0018]实施例8管家基因的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在50 mL、pH 9的PBS，0.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
(2)用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔20 S，取样时间20 S，运行时间400 S，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm,记录电流变化,绘制工作曲线；
(3)将待测样品代替管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测
(4)线性范围为1.5 pmol/L?15 nmol/L,检测限为 0.68 pmol/L。
【权利要求】
1.一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法，其特征包括以下步骤: (1)将1.0 cmX2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min,纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05、.2V/s扫速，在-1.5?2.5 V电位范围，在含有5 X 10_3 mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0?9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存； (2)滴涂2?18μ?的T12-固态CdSe复合物或2?18 μ?的T12-液态CdSe复合物到(I)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱中晾干； (3)继续滴涂10?20μ?、5?50 Pg/mL的目标DNA的上游引物或10?20 μ?、1(Γ20 Pg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干； (4)继续滴涂10?20μ?、5?50 Pg/mL的目标DNA的下游引物或10?20 μ?、1(Γ20 Pg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种T12-CdSe复合纳米材料光电生物体传感器的制备方法，所述T12-固态CdSe复合物和T12-液态CdSe复合物，制备步骤如下: (1)T12的制备 0.0Γ0.03 mol的钛酸丁酯溶于30?90 ml乙醇中，逐滴加入至l(T30mL超纯水中，搅拌.12 min，将得到的混合物转移至高压釜中，200 °C下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4?8次，80 °C下真空干燥12 h，制得T12; (2)CdSe的制备 移取0.6?1.0 mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250 mL三口烧瓶中，用I mol/L NaOH调pH至10，加入8?12 mL Na2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe，将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe ； 所述Na2SeSO3溶液是将I?20 mmol Se和5?15 mmol Na2SO3加入到50 mL超纯水中，90°C反应3 h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液； 所述CdCl2溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将1?2 g CdCl2.2.5H20溶于.40 mL超纯水制得； (3)T12-固态CdSe复合物的制备 将0.002?0.006 g T12,0.002?0.006 g固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡8?12 h, 11000转/min、23°C下离心15 min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水，超声，制得T12-固态CdSe复合物； (4)T12-液态CdSe复合物的制备 . 0.002?0.006 g T12与2?6 mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡8?12 h，11000转/min离心15 min,分离得到固体,将固体加入I mL超纯水,超声,制得T12-液态CdSe复合物。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器，其特征在于，用于目标DNA及其管家基因的检测，检测步骤如下: (I)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为辅助电极，所制备的T12-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在1(T50 mL、pH.7?9的PBS，0.Γθ.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试； (2)用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为.0.1 V，取样间隔20s，取样时间20 S，运行时间400 S，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、.430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm,记录电流变化,绘制工作曲线； (3 )将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定。
【文档编号】G01N27/416GK104316460SQ201410470726
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】庞雪辉, 闫涛, 魏琴, 朱宝存, 范大伟, 马洪敏 申请人:济南大学