粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法，包括建立标准曲线、样品前处理、检测蛋白质含量等步骤。本发明准确、简便。通过实际样品测定、与凯氏定氮法结果比较、添加干扰试验、重复性试验等，本方法法具有灵敏度高、结果比较准确、不受大多数干扰物影响，操作简便、适合大量样品测定等优点。该法测定结果与凯氏定氮法比较数据基本相近，符合度从95.2%(大豆)至110%(玉米)不等，其他大多数种类样品接近100%。实际样品测定结果的变异系数小于5%，大多在3%以内，重复性好。
【专利说明】粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 2007年3月中旬起的几个月内，美国发生多起猫、狗宠物中毒死亡事件。美国食品 药品管理局（FDA)调查发现从山东、江苏等地进口的部分小麦蛋白粉和大米蛋白粉中检出 三聚氰胺，并初步认为宠物食品中含有的三聚氰胺是导致猫、狗中毒死亡的原因。
[0003] 三聚氰胺（melamine)是一种氮杂环化合物，分子式C3N6H6,分子量126. 12,含氮 量66. 624%，其来源自石油或煤炭的有机化工原料。主要作为浴缸、粘合剂，餐具等塑料制 品的生产原料，还会添加到化肥中。对三聚氰胺加热，就会产生毒性物质--氨成分。
[0004] 其实，很长时间以来，饲料中就有添加尿素、硫酸铵等非蛋白氮化合物，以提高饲 料中蛋白质的检出量，从而使饲料价格得到提高。反刍动物瘤胃内微生物将饲料中的大部 分蛋白质和含氮化合物分解为氨，再利用氨合成菌体蛋白，菌体蛋白质进入后段消化道被 吸收利用，因此反刍动物饲料中补充一定量的非蛋白含氮化合物可以部分节省饲料中的蛋 白质。然而，氨化物并不能被单胃动物（如猪、禽等）利用，给非反刍动物添加非蛋白含氮 化合物或给反刍动物添加过量，一方面会发生氨中毒，另一方面这种冒充蛋白饲料使动物 得不到足够的蛋白质供给，出现营养障碍，最为令人担忧的是污染动物性食品，危害人类健 康。
[0005] 目前，测定粮食、饲料以及食品等蛋白质含量的方法，国标和相关行业标准一般均 采用凯氏定氮法。如GB/T5009. 5 - 2003食品中蛋白质的测定，GB2905 - 1982谷类、豆 类作物种子粗蛋白测定法，GB6432 - 1986和GB/T6432 - 1994饲料蛋白质测定法，SN/ T0800. 3 - 1999进出口粮食、饲料粗蛋白质检验方法，等等，与美国FDA规定的用于营养标 签的法定蛋白质分析方法基本相同。凯氏定氮法最大的问题是如果样品中存在非蛋白含氮 物时，一同被蒸馏而测出并折算成了蛋白质，严重影响蛋白质测定结果。目前还没有"适用 于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物质的食品测定"的方法。
[0006] 因此，需要建立一种准确测定粮食、饲料中真蛋白质含量的方法，以杜绝添加非蛋 白含氣物质冒充1?蛋白广品。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种准确、简便的粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法。
[0008] 本发明的技术解决方案是：
[0009] -种粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法，其特征是：包括下列步骤：
[0010] (一）建立标准曲线：
[0011] (1)试剂配制
[0012] 标准蛋白溶液0. lmg/mL :以1. Omg/mL标准蛋白溶液稀释10倍，使用前配制；
[0013] 福林一酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：
[0014] A液：4%碳酸钠溶液与0. 2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合；
[0015] B液：1 % CuS04 · 5H20溶液与2 %酒石酸钾钠溶液等体积混合；
[0016] 使用前将A与B按50:1的体积比混合即成，此试剂只能在使用当天配制；
[0017] 福林一酚试剂乙液：称取钨酸钠 Na2W04 · H20100g，钥酸钠 Na2Mo04 · 2H2025g，加蒸 馏水700mL溶解，置于1500mL的圆底烧瓶中；加入85% H3P0450mL，浓HCllOOmL，按上回流 装置，加热使其沸腾、回流蒸馏l〇h ;冷却后加入硫酸锂Li2S04. H20150g，蒸馏水50mL，溴水 2?3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色，并稀释至lOOOmL，过滤 入棕色瓶中保存；使用时加水使最终浓度相当于lmol/L酸度，使用前应进行标定；
[0018] (2)制作曲线
[0019] 取7支试管，加入不同量的标准蛋白和蒸馏水混匀后，每管加入4mL酚试剂甲液， 混匀，于37°C下放置10min ;再向试管中加入0. 4mL酚试剂乙液，立即振荡混匀，在37°C下 准确保温30min，用lcm光径比色皿在750nm下测定吸光度；以蛋白质浓度为横坐标，以吸 光度为纵坐标绘制标准曲线；
[0020] (二）样品前处理：
[0021] (1)样品：
[0022] 面粉、大米、大豆、玉米、苜蓿干草、玉米秸杆、鲜猪肉、火腿；大米、大豆、玉米、苜蓿 干草、玉米秸杆，用小型台式粉碎机进行粉碎，取粉末装瓶，置于干燥器内保存备用；鲜猪 肉、火腿用刀片式绞碎机绞成肉泥状，装瓶备用；
[0023] (2)样品的处理
[0024] 消化条件的选择：
[0025] 面粉样品，称取0. 3g，NaOH终浓度0. 25mol/L16mL，50°C水浴消化0. 5h ;其他样 品，粉碎或绞成泥状后取〇. 3g，NaOH终浓度1. 0mol/L16mL，置50°C水浴中消化，大米粉、玉 米粉、鲜肉、火腿消化lh，大豆粉消化2h，苜蓿干草、玉米秸杆消化4h ;消化结束后，摇匀，除 大豆消化液以蒸馏水作60倍稀释外，其它消化液以蒸馏水作30倍稀释；4000r/min离心 5min ；
[0026] (三）检测蛋白质含量：
[0027] 取上清液放入试管，并在试管中加入4mL酚试剂甲液，混勻，于37°C下放置10min ; 再向试管中加入〇. 4mL酚试剂乙液，立即振荡混匀，在37°C下准确保温30min，用lcm光径 比色皿在750nm下测定吸光度，并根据测定结果与标准曲线对比得到样品蛋白质含量。
[0028] 步骤（1)试剂配制中所述的使用前应进行标定，其标定方法：取5mL福林-酚试 剂乙液放入锥形瓶内，用lmol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然变红 再转灰绿时，即为滴定终点；计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于lmol/ L的酸度。
[0029] 本发明准确、简便。通过实际样品测定、与凯氏定氮法结果比较、添加干扰试验、重 复性试验等，本方法法具有灵敏度高、结果比较准确、不受大多数干扰物影响，操作简便、适 合大量样品测定等优点。该法测定结果与凯氏定氮法比较数据基本相近，符合度从95. 2% (大豆）至110% (玉米）不等，其他大多数种类样品接近100%。实际样品测定结果的变 异系数小于5%，大多在3%以内，重复性好。
[0030] 样品添加干扰试验表明，非蛋白含氮物中三聚氰胺、硫酸铵、尿素、生物蛋白精较 大剂量时对本方法基本无干扰作用。添加缩二脲66. 7g/kg时无干扰，添加333. 3g/kg时结 果增加14.91%。在饲料、粮食成分或可能添加成分中，氯化钠、蔗糖在高剂量时基本无干 扰；柠檬酸钠、维生素 C、维生素 B1、肌醇、除酪氨酸外的多种氨基酸等在常规用量至高于其 数倍或数十倍添加时不产生明显干扰。
[0031] 对本方法干扰比较明显的有酪氨酸、葡萄糖、麦芽糖和维生素 B1。因为维生素 B1 常规推荐最大剂量仅为6mg/kg，而添加2g/kg以内时没有明显干扰。
[0032] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
【具体实施方式】
[0033] -种粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法，包括下列步骤：
[0034] (一）建立标准曲线：
[0035] ⑴试剂配制
[0036] 标准蛋白溶液0. lmg/mL :以1. Omg/mL标准蛋白溶液稀释10倍，使用前配制；
[0037] 福林一酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：
[0038] A液：4%碳酸钠溶液与0. 2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合；
[0039] B液：1 % CuS04 · 5H20溶液与2 %酒石酸钾钠溶液等体积混合；
[0040] 使用前将A与B按50:1的体积比混合即成，此试剂只能在使用当天配制；
[0041] 福林一酚试剂乙液：称取钨酸钠 Na2W04 · H20100g，钥酸钠 Na2Mo04 · 2H2025g，加蒸 馏水700mL溶解，置于1500mL的圆底烧瓶中；加入85% H3P0450mL，浓HCllOOmL，按上回流 装置，加热使其沸腾、回流蒸馏l〇h ;冷却后加入硫酸锂Li2S04. H20150g，蒸馏水50mL，溴水 2?3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色，并稀释至lOOOmL，过滤 入棕色瓶中保存；使用时加水使最终浓度相当于lmol/L酸度，使用前应进行标定；其标定 方法：取5mL福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用lmol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指 示剂，当溶液突然变红再转灰绿时，即为滴定终点；计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠 溶液调至相当于lmol/L的酸度。
[0042] (2)制作曲线
[0043] 取7支试管，加入不同量的标准蛋白和蒸馏水混匀后，每管加入4mL酚试剂甲液， 混匀，于37°C下放置10min ;再向试管中加入0. 4mL酚试剂乙液，立即振荡混匀，在37°C下 准确保温30min，用lcm光径比色皿在750nm下测定吸光度；以蛋白质浓度为横坐标，以吸 光度为纵坐标绘制标准曲线；
[0044] 表1标准曲线操作步骤和结果
[0045]
【权利要求】
1. 一种粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法，其特征是：包括下列步骤： (一） 建立标准曲线： (1) 试剂配制 标准蛋白溶液0. lmg/mL :以1. 0 mg/mL标准蛋白溶液稀释10倍，使用前配制； 福林一酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成： A液：4%碳酸钠溶液与0. 2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合； B液：1% CuS04 · 5H20溶液与2%酒石酸钾钠溶液等体积混合； 使用前将A与B按50:1的体积比混合即成，此试剂只能在使用当天配制； 福林一酚试剂乙液：称取钨酸钠 Na2W04 · H20100g，钥酸钠 Na2Mo04 · 2H2025g，加蒸馏水 700mL溶解，置于1500mL的圆底烧瓶中；加入85% H3P0450mL，浓HC1 100 mL，按上回流装 置，加热使其沸腾、回流蒸馏l〇h ;冷却后加入硫酸锂Li2S04. H20150g，蒸馏水50mL，溴水2~3 滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色，并稀释至lOOOmL，过滤入棕 色瓶中保存；使用时加水使最终浓度相当于lmol/L酸度，使用前应进行标定； (2) 制作曲线 取7支试管，加入不同量的标准蛋白和蒸馏水混匀后，每管加入4mL酚试剂甲液，混匀， 于37°C下放置10min ;再向试管中加入0. 4mL酚试剂乙液，立即振荡混匀，在37°C下准确保 温30min，用lcm光径比色皿在750nm下测定吸光度；以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为 纵坐标绘制标准曲线； (二） 样品前处理： (1) 样品： 面粉、大米、大豆、玉米、苜蓿干草、玉米秸杆、鲜猪肉、火腿；大米、大豆、玉米、苜蓿干 草、玉米秸杆，用小型台式粉碎机进行粉碎，取粉末装瓶，置于干燥器内保存备用；鲜猪肉、 火腿用刀片式绞碎机绞成肉泥状，装瓶备用； (2) 样品的处理 消化条件的选择： 面粉样品，称取〇. 3g，NaOH终浓度0. 25mol/L 16mL，50°C水浴消化0. 5h ;其他样品， 粉碎或绞成泥状后取〇. 3g，NaOH终浓度1.0 mol/L 16mL，置50°C水浴中消化，大米粉、玉 米粉、鲜肉、火腿消化lh，大豆粉消化2h，苜蓿干草、玉米秸杆消化4h ;消化结束后，摇匀，除 大豆消化液以蒸馏水作60倍稀释外，其它消化液以蒸馏水作30倍稀释；4000r/min离心 5min ； (三） 检测蛋白质含量： 取上清液放入试管，并在试管中加入4mL酚试剂甲液，混勻，于37°C下放置10min ;再向 试管中加入〇. 4mL酚试剂乙液，立即振荡混匀，在37°C下准确保温30min，用lcm光径比色 皿在750nm下测定吸光度，并根据测定结果与标准曲线对比得到样品蛋白质含量。
2. 根据权利要求1所述的粮食、饲料中蛋白质含量的测定方法，其特征是： 步骤（1)试剂配制中所述的使用前应进行标定，其标定方法：取5mL福林-酚试剂乙液 放入锥形瓶内，用lmol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然变红再转灰 绿时，即为滴定终点；计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于lmol/L的酸 度。
【文档编号】G01N21/79GK104215604SQ201410473499
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】赵炜, 王捍东, 殷烈, 洪华, 王红卫 申请人:中华人民共和国南通出入境检验检疫局