一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法及应用的制作方法

文档序号:6241330阅读:365来源:国知局
一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法及应用,属于新型功能材料、生物传感检测【技术领域】。本发明基于四亚甲基五胺功能化石墨烯修饰电极,银-二氧化铈作为糖类抗原二抗标记物,显著提高了免疫传感器的灵敏度和稳定性,实现了CA125、CAl5–3、CA549、CA27–29、CAl9–9、CAl9-5、CA50、CA72–4.CA72–4及CA242的灵敏、特异及快速检测。
【专利说明】一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法及应用

【技术领域】
[0001]本发明一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法及应用。具体是采用四亚甲基五胺功能化石墨烯和银-二氧化铈,制备一种检测肿瘤标志物糖类抗原的电化学免疫传感器,属于新型功能材料与生物传感检测【技术领域】。

【背景技术】
[0002]20世纪80年代,专家利用杂交瘤技术获得了能识别肿瘤特异性大分子糖蛋白抗原'社6 £1111:18611,…),并研制了单克隆抗体识别系统。糖蛋白类抗原大体可分为两类;一类是哺乳动物上皮细胞分泌的大分子量粘蛋白,如…125,0^15-3,^ 549,0^27 - 29等,其中有些如0115 - 3、01549、27 - 29实际为异构体,都是乳腺癌的肿瘤标志物;另一类是唾液酸岩藻糖的衍生物,如。八19 — 9、0119-5、0150、^ 72-4.^ 72 - 4、^242等,常为消化道肿瘤、胰腺癌的标志。
[0003]目前已有的肿瘤标志物的临床检测方法很多,如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。免疫传感器是将免疫学方法与分析化学方法相结合的一种生物传感器,通过抗原与抗体之间的特性性结合,使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。
[0004]电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点,因此本发明制备了一种合金负载分子筛电化学免疫传感器,实现了对肿瘤标志物的检测。
[0005]本发明利用四亚乙烯五胺与石墨烯复合物解决了石墨烯在水中易通过强烈的X - X叠加作用和范德华力形成不可逆的团聚体的问题,确保了石墨烯在电极表面的稳定覆盖。另外由于其表面具有较多的氨基基团使得其与蛋白质的结合更为牢固,用在传感器的制备中使传感器的稳定性得到了很大程度的提升。在不使用酶的情况下,首次将稀土材料二氧化铈的优异的催化性能利用在电化学免疫传感器的构建中,结合优异的导电性和生物相容性,对双氧水11202有良好的催化能力,并在检测过程中产生良好的电化学信号,有效地降低了传感器的检出限,可用于多种肿瘤标志物糖类抗原的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点,而且制备过程较为简单,有效克服了目前肿瘤标志物糖类抗原检测方法的不足。


【发明内容】

[0006]本发明的目的之一是基于四亚甲基五胺功能化石墨烯和银-二氧化铈,构建了一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。
[0007]本发明的目的之二是将该夹心型电化学免疫传感器应用于多种肿瘤标志物糖类抗原的检测。
[0008]本发明的技术方案如下:
1.一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法,步骤如下: (1)玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 Mm的Al2O3粉末磨平并抛光后,超声清洗,在电极表面滴加6yL、f4 mg/mL的四亚甲基五胺功能化石墨烯水溶液,干燥;
(2)加入3μ L、质量分数为1.(Γ3.0%戊二醛溶液,干燥,滴加6 PL、质量分数为5?10U g/mL的糖类抗原一抗Ab1,保持湿润Ih ;
(2)用pH6.Γ8.4 PBS缓冲溶液洗去未连接上的糖类抗原一抗Ab1,并用3 μ L、质量分数为1.(Γ3.0%的BSA封闭非特异性活性位点,加入6 μ L、0.0Of 20 ng/mL的一系列不同浓度的糖类抗原标准溶液,湿润条件下孵育Ih ;
(3)将6μ L银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液滴在电极表面,保持湿润0.5^1.5h,用pH 6.4^8.4 PBS缓冲溶液洗去未连接上的银-二氧化铈-Ab2,免疫传感器制作完成。
[0009]银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制备,步骤如下:
(1)银-二氧化铈的制备
将0.Γ0.5 g聚乙烯吡咯烷酮在1(T40 mL的甲醇中溶解,加入0.5^2.0 g 二氧化铈,0.l(Tl.0g硝酸银和0.3^0.8 mL、质量分数为25°/Γ28%氨水,搅拌,将其转入不锈钢反应釜中,在烘箱中分别于160 1:和200 °C反应2(T30 h,冷却至室温,收集产物,并将产物用乙醇离心洗涤3次,所得产物于70 V°C下干燥,研磨,再于40(T5(KrC煅烧5 h,制得银-二氧化铈样品;
(2)银-二氧化铈-糖类抗原Ab2二抗孵化物溶液的制备
将银-二氧化铈样品40?100 mg分散于I mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,加入I mL、50?150 μ g/mL的糖类抗原二抗Ab2和300?700 μ L、质量分数为0.5?1.5 °/c^^BSA,震荡12 h后离心洗涤,将得到的银-二氧化铈-糖类抗原二抗Ab2重新分散于I mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,制得银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液,储存于4 °C下备用。
[0010]糖类抗原的检测,步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,钼丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL、30?70 mmol.Γ\ρΗ6.5?7.5的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)用计时电流法法对糖类抗原标准溶液进行检测,将输入电压设置为-0.4 V,取样间隔设置为0.1秒,运行时间设置为400秒;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50s向10 mL pH=6.5?7.5的PBS中注入10 μ L、5^10 mo I.Γ1的质量分数为30%双氧水溶液,然后记录电流随时间的变化,绘制工作曲线;
(4)将待测样品溶液代替糖类抗原抗原标准溶液进行检测。
[0011]4.上述所述糖类抗原选自下列之一:CA 125、CA15 - 3、CA 549、CA 27 - 29、CA19-9、CA19-5、CA50、CA 72 - 4.CA 72-4、CA 242。
[0012]本发明的有益成果
1.利用四亚乙烯五胺与石墨烯复合物解决了石墨烯在水中易通过强烈的31 - JI叠加作用和范德华力形成不可逆的团聚体的问题,确保了石墨烯在电极表面的稳定覆盖。另外由于其表面具有较多的氨基基团使得其与蛋白质的结合更为牢固,用在传感器的制备中使传感器的稳定性得到了很大程度的提升。
[0013]2.首次将稀土材料二氧化铈的优异的催化性能利用在电化学免疫传感器的构建中,结合八8优异的导电性和生物相容性,使稀土材料在传感器中得到很好的应用。
[0014]3.结合免疫学方法,提高了传感器的特异性。
[0015]4.本发明制备的电化学免疫传感器用于多种肿瘤标志物糖类抗原的检测,检测限低,线性范围宽,可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测;对糖类抗原检测的检测限可达到0.054呢/此。

【具体实施方式】
[0016]实施例1 一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法,步骤如下:
(1)玻碳电极依次用1.04.3、0』5触的八1203粉末磨平并抛光后,超声清洗,在电极表面滴加6 0 的四亚甲基五胺功能化石墨烯水溶液,干燥;
(2)加入3^ 1、质量分数为1.0%戊二醒溶液,干燥,滴加6叱、质量分数为5的糖类抗原一抗仙工,保持湿润1匕;
(2)用邱6.4 ?88缓冲溶液洗去未连接上的糖类抗原一抗仙工,并用3^1、质量分数为
1.0%的8“封闭非特异性活性位点,加入6^ 1^0.00广20叩/此的一系列不同浓度的糖类抗原标准溶液,湿润条件下孵育111 ;
(3)将69 [银-二氧化铈-糖类抗原仙2 二抗孵化物溶液滴在电极表面,保持湿润
0.5匕用邱6.4 ?88缓冲溶液洗去未连接上的银-二氧化铈-仙2,免疫传感器制作完成。
[0017]实施例2 —种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法,步骤如下:
(1)玻碳电极依次用1.04.3、0』5触的八1203粉末磨平并抛光后,超声清洗,在电极表面滴加6^ 1^2^/1111的四亚甲基五胺功能化石墨烯水溶液,干燥;
(2)加入3^ 1、质量分数为1.01.0%戊二醒溶液,干燥,滴加6叱、质量分数为7 4邑/1111的糖类抗原一抗仙工,保持湿润1匕;
(2)用邱7.4 ?83缓冲溶液洗去未连接上的糖类抗原一抗仙工,并用3^1、质量分数为
2.0%的8“封闭非特异性活性位点,加入6^ 1^0.00广20叩/此的一系列不同浓度的糖类抗原标准溶液,湿润条件下孵育111 ;
(3)将69 [银-二氧化铈-糖类抗原仙2 二抗孵化物溶液滴在电极表面,保持湿润1.0匕,用邱7.4 ?88缓冲溶液洗去未连接上的银-二氧化铈-仙2,免疫传感器制作完成。
[0018]实施例3 —种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法,步骤如下:
(1)玻碳电极依次用1.04.3、0』5触的八1203粉末磨平并抛光后,超声清洗,在电极表面滴加6^ 1?4呢/此的四亚甲基五胺功能化石墨烯水溶液,干燥;
(2)加入311 [、质量分数为3.0%戊二醒溶液,干燥,滴加6叱、质量分数为10 ^
的糖类抗原一抗仙工,保持湿润1匕;
(2)用6.0.4 ?83缓冲溶液洗去未连接上的糖类抗原一抗仙工,并用3^1、质量分数为3.0%的8“封闭非特异性活性位点,加入6 ^ 1,0.00广20叩/此的一系列不同浓度的糖类抗原标准溶液,湿润条件下孵育1匕;
(3)将69 [银-二氧化铈-糖类抗原仙2 二抗孵化物溶液滴在电极表面,保持湿润
1.5匕用邱8.4 ?88缓冲溶液洗去未连接上的银-二氧化铈-仙2,免疫传感器制作完成。
[0019]实施例4银-二氧化铈-糖类抗原仙2二抗孵化物溶液的制备,步骤如下:
(1)银-二氧化铈的制备将0.1g聚乙烯吡咯烷酮在1mL的甲醇中溶解,加入0.5g 二氧化铈,0.1 (Tl.0g硝酸银和0.3mL、质量分数为25%%氨水,搅拌,将其转入不锈钢反应釜中,在烘箱中分别于160°〇和200 °C反应20 h,冷却至室温,收集产物,并将产物用乙醇离心洗涤3次,所得产物于70°C下干燥,研磨,再于40(TC煅烧5 h,制得银-二氧化铈样品;
(2)银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制备
将银-二氧化铈样品40 mg分散于I mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,加入I mL,50y g/mL的糖类抗原二抗Ab2和300 μ L、质量分数为0.5 %的BSA,震荡12 h后离心洗涤,将得到的银-二氧化铈-糖类抗原二抗Ab2重新分散于I mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,制得银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液,储存于4 °C下备用。
[0020]实施例5银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制备,步骤如下:
(1)银-二氧化铈的制备
将1.5 g聚乙烯吡咯烷酮在30 mL的甲醇中溶解,加入1.0 g 二氧化铈,0.5g硝酸银和
0.5 mL、质量分数为26%氨水,搅拌,将其转入不锈钢反应釜中,在烘箱中分别于160 °〇和200 °C反应25 h,冷却至室温,收集产物,并将产物用乙醇离心洗涤3次,所得产物于80°C下干燥,研磨,再于450°C煅烧5 h,制得银-二氧化铈样品;
(2)银-二氧化铈-糖类抗原Ab2二抗孵化物溶液的制备
将银-二氧化铈样品70 mg分散于I mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,加入I mLUOO μ g/mL的糖类抗原二抗AbJP 500 μ L、质量分数为1.0 °/c^^BSA,震荡12 h后离心洗涤,将得到的银-二氧化铈-糖类抗原二抗Ab2重新分散于I mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,制得银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液,储存于4 °C下备用。
[0021]实施例6银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制备,步骤如下:
(1)银-二氧化铈的制备
将0.5 g聚乙烯吡咯烷酮在40 mL的甲醇中溶解,加入2.0 g 二氧化铈,1.0g硝酸银和0.8 mL、质量分数为28%氨水,搅拌,将其转入不锈钢反应釜中,在烘箱中分别于160 V和200 °C反应30 h,冷却至室温,收集产物,并将产物用乙醇离心洗涤3次,所得产物于90°C下干燥,研磨,再于50(TC煅烧5 h,制得银-二氧化铈样品;
(2)银-二氧化铈-糖类抗原Ab2二抗孵化物溶液的制备
将银-二氧化铈样品100 mg分散于I mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,加入I mL、150 μ g/mL的糖类抗原二抗AbJP 700 μ L、质量分数为1.5 °/c^^BSA,震荡12 h后离心洗涤,将得到的银-二氧化铈-糖类抗原二抗Ab2重新分散于I mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,制得银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液,储存于4 °C下备用。
[0022]实施例7卵巢癌相关抗原CA 125的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,钼丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL、30mmol.L—1、pH6.5的PBS缓冲溶液中进行测试;
(2)用计时电流法法对糖类抗原CA125标准溶液进行检测,将输入电压设置为-0.4V,取样间隔设置为0.1秒,运行时间设置为400秒;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50s向10 mL pH=6.5的PBS中注入10 μ L、5 mo I *L_1的质量分数为30%双氧水溶液,然后记录电流随时间的变化,绘制工作曲线; (4)将待测样品溶液代替糖类抗原抗原⑶125标准溶液进行检测。测得线性范围为0.42呢/此?20叩/爪[,检测限为0.0921^/1111。
[0023]实施例8胰腺、胆道癌相关抗原0119-9的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,钼丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 1111,70 11111101吨—\邱7.5的?83缓冲溶液中进行测试;
(2)用计时电流法法对糖类抗原0119-9的标准溶液进行检测,将输入电压设置为-0.4V,取样间隔设置为0.1秒,运行时间设置为400秒;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔508向10 邱=7.5的?83中注入10 ^1,1011101 - 171的质量分数为30%双氧水溶液,然后记录电流随时间的变化,绘制工作曲线;
(4)将待测样品溶液代替糖类抗原0119-9的标准溶液进行检测。测得线性范围为0.25呢/此?20叩/此,检测限为0.054呢/爪乙。
[0024]实施例9乳腺癌相关抗原…15-3的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,钼丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 1111,50 11111101吨—\邱7.0的?83缓冲溶液中进行测试;
(2)用计时电流法法对糖类抗原…15-3的标准溶液进行检测,将输入电压设置为-0.4 V,取样间隔设置为0.1秒,运行时间设置为400秒;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔508向10 1111邱=7.0的?83中注入10 111,8 11101.171的质量分数为30%双氧水溶液,然后记录电流随时间的变化,绘制工作曲线;
(4)将待测样品溶液代替糖类抗原抗原…15-3的标准溶液进行检测。测得线性范围为0.30呢/此?20叩/爪[,检测限为0.064时/爪匕
[0025]实施例10胃癌相关抗原0172-4,01242的检测
按照实施例7、的方法对胃癌相关抗原0172-4,01242的进行检测,测得线性范围为
0.52呢/此?20叩/爪[,检测限为0.14^^/11110
【权利要求】
1.一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 Mm的A1203粉末磨平并抛光后,超声清洗,在电极表面滴加6yL、f4 mg/mL的四亚甲基五胺功能化石墨烯水溶液,干燥; (2)加入3μ L、质量分数为1.(Γ3.0%戊二醛溶液,干燥,滴加6 PL、质量分数为5?10U g/mL的糖类抗原一抗Abi,保持湿润lh ; (2)用pH6.Γ8.4 PBS缓冲溶液洗去未连接上的糖类抗原一抗Ah,并用3 μ L、质量分数为1.(Γ3.0%的BSA封闭非特异性活性位点,加入6μ L、0.00Γ20 ng/mL的一系列不同浓度的糖类抗原标准溶液,湿润条件下孵育lh ; (3)将6μ L银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液滴在电极表面,保持湿润0.5^1.5h,用pH 6.4^8.4 PBS缓冲溶液洗去未连接上的银-二氧化铈_Ab2,免疫传感器制作完成。
2.如权利要求1所述的一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法,所述银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液的制备,其特征在于,包括以下步骤: (1)银-二氧化铈的制备 将0.Γ0.5 g聚乙烯吡咯烷酮在1(T40 mL的甲醇中溶解,加入0.5^2.0 g 二氧化铈,0.l(Tl.0g硝酸银和0.3^0.8 mL、质量分数为25°/Γ28%氨水,搅拌,将其转入不锈钢反应釜中,在烘箱中分别于160 1:和200 °C反应2(T30 h,冷却至室温,收集产物,并将产物用乙醇离心洗涤3次,所得产物于70 V°C下干燥,研磨,再于40(T5(KrC煅烧5 h,制得银-二氧化铈样品; (2)银-二氧化铈-糖类抗原Ab2二抗孵化物溶液的制备 将银-二氧化铈样品40?100 mg分散于1 mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,加入1 mL、50?150 μ g/mL的糖类抗原二抗Ab2和300?700 μ L、质量分数为0.5?1.5 °/c^^BSA,震荡12 h后离心洗涤,将得到的银-二氧化铈-糖类抗原二抗Ab2重新分散于1 mL pH 7.4 PBS缓冲溶液中,制得银-二氧化铈-糖类抗原Ab2 二抗孵化物溶液,储存于4 °C下备用。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器,其特征在于,用于肿瘤标志物糖类抗原的检测,检测步骤如下: (1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,钼丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL、3(T70 mmol.Γ\ρΗ6.5?7.5的PBS缓冲溶液中进行测试; (2)用计时电流法法对糖类抗原标准溶液进行检测,将输入电压设置为-0.4 V,取样间隔设置为0.1秒,运行时间设置为400秒; (3)当背景电流趋于稳定后,每隔50s向10 mL pH=6.5?7.5的PBS中注入10 μ L、5^10 mol.Γ1的质量分数为30%双氧水溶液,然后记录电流随时间的变化,绘制工作曲线; (4)将待测样品溶液代替糖类抗原抗原标准溶液进行检测。
4.如权利要求Γ3所述的一种基于银-二氧化铈的糖类抗原传感器制备方法,其特征在于,所述糖类抗原选自下列之一:CA 125、CA15 - 3、CA 549,CA 27 - 29、CA19 - 9、CA19_5、CA50、CA 72-4.CA 72_4、CA 242。
【文档编号】G01N27/327GK104297315SQ201410481241
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月20日 优先权日:2014年9月20日
【发明者】魏琴, 张潇月, 闫涛, 杜斌, 马洪敏, 魏东, 吴丹, 张勇 申请人:济南大学
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