一种检测人血清中总睾酮的方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测人血清中总睾酮的方法，该方法包括如下步骤：向含有人血清样品的试管中加入含睾酮内标物的内标液，混匀后加入甲基叔丁基醚进行蛋白沉淀并萃取待测物；离心后置于-65?-80°C条件下放置l-2h，接着转移上清液至另一试管中进行干燥，然后加入复溶剂，得到待测样品；对待测样品用高通量的液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；以睾酮的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比为定性依据，采用内标标准曲线法定量。本发明采用高通量的液相色谱串联质谱仪对人血清中的睾酮进行检测，检测时间短，通量高，灵敏度好，精密度高。
【专利说明】一种检测人血清中总睾酮的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析检测【技术领域】，特别是涉及一种高通量液相色谱串联质谱法检测 人血清中总睾酮的方法。
【背景技术】
[0002] 睾酮是一种类固醇荷尔蒙，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量； 但绝经后妇女，卵巢分泌睾酮显著减少。在男性中，它对外生殖器和第二性征的发育起着重 要作用，其生物化学过程尚未完全阐明。女性中，其主要作用是作为一种雌激素的前体。同 时，睾酮可能影响许多身体系统和功能，包括：血生成，体内钙平衡，骨矿化作用，脂代谢，糖 代谢和前列腺增长。
[0003] 大多数睾酮与性激素结合球蛋白（SHBG)结合，在男性中也被称为睾丸激素结合 球蛋白；少数与白蛋白结合，一小部分以游离形式存在。游离睾酮被认为是生物活性成分。 然而，睾酮与白蛋白结合较弱，所以所有非SHBG结合的睾酮被认为是生物可利用的。
[0004] 在儿童期，过多睾酮会诱发男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，过量的睾 酮会造成不同程度的男性化，包括多毛，痤疮，月经稀发，或不育。睾酮轻度至中度升高对男 性通常无明显症状，但对女性造成严重的影响。对于睾酮轻度至中度升高的确切原因往往 不清楚。明显升高的常见原因包括遗传疾病（如先天性肾上腺皮质增生症），肾上腺，睾丸 和卵巢的肿瘤和运动员滥用睾丸激素或促性腺激素通。女性的睾酮降低会引起微妙的症 状，这主要包括性欲下降和非特异性的情绪变化。在男性，它会导致性腺功能减退，这个特 点将改变男性的第二性征和生育功能。
[0005] 传统的睾酮检测方法有酶联免疫吸附法（ELISA)、放射性免疫分析法（RIA)、化学 发光免疫检测（CLISA)、自动化免疫分析系统、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法等，现 有的睾酮检测方法，主要存在如下问题：第一、由于睾酮在人体内主要与性激素结合球蛋白 (SHBG)结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存在严重的基质干扰。而传 统的免疫法，不能有效祛除基质干扰；第二，免疫学检测方法是建立在抗体对抗原分子识别 的基础上，由于人体内存在大量的与睾酮结构相似的化合物，所以该检测技术的特异性差， 易导致假阳性的出现，尤其是在睾酮浓度水平较低的情况下，传统的免疫方法无法准确测 定；第三，高效液相色谱法和气相色谱-质谱法，前处理复杂，分析时间长，灵敏度低；第四， 现有的高效液相色谱-串联质谱法和气相色谱-质谱法整个检测过程时间长、检测通量低。
[0006] 因此，需要本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何能够提供一种适 用于人血清中总睾酮的检测方法，前处理简单，能有效祛除基质干扰，可以准确定量极低浓 度（〈100ng/dL)的睾酮，并且整个检测过程时间短、通量高。
【发明内容】
[0007] 本发明实施例所要解决的技术问题是提供一种适用于人血清总睾酮的高通量的 检测方法，该方法灵敏度低，能够准确定量极低浓度（〈l〇〇ng/dL)的睾酮，能够有效去除基 质干扰，快速检测，通量高。
[0008] 为了解决上述问题，本发明公开了一种高通量液相色谱串联质谱法检测人血清中 总睾酮的方法，具体的技术方案如下：
[0009] -种高通量液相色谱串联质谱法检测人血清中总睾酮的方法，包括如下步骤： [0010] ⑴前处理
[0011] 向人血清样品的试管中加入含睾酮内标物的内标液，混匀后加入甲基叔丁基醚进 行蛋白沉淀并萃取睾酮，然后离心后置于-65?-75°c条件下放置l-2h，接着转移上清液并 进行干燥，然后加入复溶剂，得到待测样品；
[0012] 其中，所述睾酮内标物为睾酮的碳代标记物或氘代标记物；所述内标液与人血 清样品的体积比为1:10?1:4;所述人血清样品、甲基叔丁基醚及复溶剂的体积比为 2:8:1 ?2:15:1 ;
[0013] ⑵检测
[0014] 对所述待测样品采用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；
[0015] 其中色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；柱温为48-52°C;流动相为甲醇和水，流速 为0. 5-lml/min，采用梯度洗脱：起始流动相甲醇：水的体积比为35:65,待测物出峰时流动 相甲醇：水的体积比为60:40,而后再回到起始流动相甲醇：水的体积比为35:65,并保持 1?2min，整个梯度的时间为3?8min ;
[0016] 质谱条件为：采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM;
[0017]目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的条件为：睾酮母离子的质/荷比为 289. 2?290. 2,对应的子离子的质/荷比为97. 1?98. 1。
[0018] 在其中一个实施例中，内标的定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的条件为： 内标母离子的质/荷比为290. 2?296. 2,对应的子离子的质/荷比为110. 1?116. 1。
[0019] 在其中一个实施例中，所述质谱条件还包括：睾酮定量离子对的去簇电压为 110v，入口电压为10v，碰撞电压为32v，出口电压为20v ;睾酮内标的定量离子对的去簇电 压为100v，入口电压为10v，碰撞电压为34v，出口电压为12v。
[0020] 在其中一个实施例中，所述质谱条件的离子源参数包括：电离源为电喷雾电离 ESI源；气帘气压力为15psi ;加热气压力为50psi ;辅助加热气压力为50psi ;加热气温度 为400°C ;碰撞气为高纯氮气，压力为8psi ;电喷雾针电压为4000V。
[0021] 在其中一个实施例中，所述高通量液相色谱串联质谱仪包括两套高通量液相 色谱系统，所述两套高通量液相色谱系统的液相色谱条件一样；第一套液相采集窗口为 2. Omin-3. Omin ;第二套液相采集窗口为2. Omin-3. Omin。较佳地在此系统上，5min可以检 测两个样品。
[0022] 在其中一个实施例中，步骤（1)中所述离心的条件包括：以8000-10000r/min的速 度离心 4. 5-5. 5min。
[0023] 在其中一个实施例中，步骤（1)中所述干燥的条件为通50°C的氮气直至干燥。
[0024] 在其中一个实施例中，步骤（1)中所述复溶剂为体积比为50:50-10:90的甲醇和 水的混合物。
[0025] 在其中一个实施例中，步骤（1)中所述内标液为含睾酮内标物的乙腈-水溶液，其 中乙腈与水的体积比为50:50-10:90。
[0026] 在其中一个实施例中，该检测方法还包括如下步骤：定性判断和定量计算，
[0027] 依据睾酮、睾酮内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断睾酮的 存在；
[0028] 依据睾酮与对应睾酮内标物在内标标准曲线上的峰面积比值，计算人血清样品中 的睾酮的含量。
[0029] 与【背景技术】相比，本发明具有以下优点：
[0030] 本发明采用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测，与现有技术相比，本发 明实施例可以实现5min检测2个样品，单个样品的检测时间平均为2. 5min，与现有的液相 色谱法、液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱法等相比，检测时间短、检测通量高；
[0031] 本发明检测方法的定量限为0. 94ng/dL，精密度RSD小于10%，可以准确的定性或 定量检测出人血清中极低浓度（〈lOOng/dL)的睾酮含量，与传统的免疫法检测相比，检测 灵敏度高、精密度高。
[0032] 本发明通过液液萃取，吹干、复溶后便可以用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪 进行检测，与其他方法相比，前处理简单，检测通量高，并且可以有效去除基质干扰，方法特 异性、抗干扰能力强。
[0033] 由以上可知采用本发明的检测方法进行检测，检测时间短，通量高，灵敏度高，精 密度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为本发明检测流程图；
[0035] 图2为实际样本中睾酮及其内标物的TIC图；
[0036] 图3为内标标准曲线图。
【具体实施方式】
[0037] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合【具体实施方式】 对本发明作进一步详细的说明。
[0038] 参见图1，示出了本发明实施例的一种睾酮的高通量检测方法实施例的步骤流程 图，具体可以包括如下步骤：
[0039] 步骤101，前处理；
[0040] 向人血清样品加入含有睾酮内标物的乙腈-水溶液，混匀后加入甲基叔丁基醚进 行蛋白沉淀并萃取待测物；离心后置于-70°C条件下放置lh，接着转移上清液并进行干燥， 然后加入复溶剂，得到待测样品；
[0041] 其中，所述人血清样品、甲基叔丁基醚及复溶剂的体积比为2:8:1?2:15:1 (优选 为2 :10 :1);所述乙腈-水溶液与人血清样品的体积比为1:10?1:4(优选为1:4);所述 睾酮内标物为13C3_睾酮。
[0042] 可以理解，步骤101是对人血清样品的前处理，以富集人血清样品中的睾酮。血清中 的睾酮存在形式有：游离的，与性激素结合球蛋白（SHBG)结合，少数与白蛋白结合。本发明实 施例的前处理步骤中，样品经过蛋白质沉淀释放出睾酮同时萃取睾酮，通过加入甲基叔丁基 醚可以从人血清样品中去除蛋白质，并萃取出睾酮，留在上清液中为睾酮和其它可溶物。
[0043] 乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比可为50:50-10:90,优选为30:70。
[0044] 对加入甲基叔丁基醚后的溶液的离心的条件可以包括：在室温下，以10000r/min 的速度离心4. 5-5. 5min。
[0045] 上清液的干燥条件可以包括：通50°C的氮气直至干燥。
[0046] 复溶剂可以为甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和水的体积比可以为 50:50-10:90,优选为 35:65。
[0047] 步骤102,检测；
[0048] 对所述待测样品用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；
[0049] 所述检测采用正离子模式，扫描方式采用多反应检测离子扫描MRM ;
[0050] MRM :Multi Reaction Monitor，指多反应监测离子扫描。
[0051] 其中，目标定量离子对包括睾酮定量离子对，目标定量离子的多反应监测离子扫 描MRM的条件可以包括：睾酮母离子的质/荷比为289. 2?290. 2,对应的子离子的质/荷 比为97. 1?98. 1。
[0052] 内标定量离子对包括13C3_睾酮定量离子对，内标定量离子对的多反应监测离子扫 描MRM的条件为： 13C3_睾酮母离子的质/荷比为292. 2?293. 2,对应的子离子的质/荷比 为 112. 1 ?113. 1 ;
[0053] 其中，所述液相色谱采用梯度模式洗脱，液相色谱条件包括：
[0054] 色谱柱：3. 5um2. lmmX50C18
[0055] 色谱柱柱温：50°C ;
[0056] 进样量：50ul ;
[0057] 流速：0· 5ml/min ;
[0058] 流动相：甲醇以及水；
[0059] 梯度洗脱的条件如下：
[0060]
【权利要求】
1. 一种检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 前处理 向人血清样品的试管中加入含辜丽内标物的内标液，混勻后加入甲基叔丁基酿进行蛋 白沉淀并萃取睾酮，然后离心后置于-65?-75°c条件下放置l-2h，接着转移上清液并进行 干燥，然后加入复溶剂，得到待测样品； 其中，所述睾酮内标物为睾酮的碳代标记物或氘代标记物；所述内标液与人血清样品 的体积比为1:10?1:4 ;所述人血清样品、甲基叔丁基醚及复溶剂的体积比为2:8:1? 2:15:1 ； (2) 检测 对所述待测样品采用高通量液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测； 其中色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱；柱温为48-52°C ;流动相为甲醇和水,流速为 0. 5-lml/min，采用梯度洗脱：起始流动相甲醇：水的体积比为35:65,待测物出峰时流动相 甲醇：水的体积比为60:40,而后再回到起始流动相甲醇：水的体积比为35:65,并保持1? 2min，整个梯度的时间为3?8min ; 质谱条件为：采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM ; 目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的条件为：睾酮母离子的质/荷比为 289. 2?290. 2,对应的子离子的质/荷比为97. 1?98. 1。
2. 根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，内标的定量离子 对的多反应监测离子扫描MRM的条件为：内标母离子的质/荷比为290. 2?296. 2,对应的 子离子的质/荷比为110. 1?116. 1。
3. 根据权利要求2所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，所述质谱条件还 包括：睾酮定量离子对的去簇电压为ll〇v，入口电压为l〇v，碰撞电压为32v，出口电压为 20v ;睾酮内标的定量离子对的去簇电压为100v，入口电压为10v，碰撞电压为34v，出口电 压为12v。
4. 根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，所述质谱条件的 离子源参数包括：电离源为电喷雾电离ESI源；气帘气压力为15psi ;加热气压力为50psi ; 辅助加热气压力为50psi ;加热气温度为400°C;碰撞气为高纯氮气，压力为8psi ;电喷雾针 电压为4000V。
5. 根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，所述高通量 液相色谱串联质谱仪包括两套高通量液相色谱系统，所述两套高通量液相色谱系统的 液相色谱条件一样；第一套液相采集窗口为2.0min-3.0min ;第二套液相采集窗口为 2. Omin-3· 0min〇
6. 根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，步骤（1)中所述离 心的条件包括：以8000-10000r/min的速度离心4. 5-5. 5min。
7. 根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，步骤⑴中所述干 燥的条件为通50°C的氮气直至干燥。
8. 根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，步骤（1)中所述复 溶剂为体积比为50:50-10:90的甲醇和水的混合物。
9. 根据权利要求1所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，步骤（1)中所述内 标液为含睾酮内标物的乙腈-水溶液，其中乙腈与水的体积比为50:50-10:90。
10.根据权利要求1-9任一项所述的检测人血清中总睾酮的方法，其特征在于，该检测 方法还包括如下步骤：定性判断和定量计算， 依据睾酮、睾酮内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断睾酮的存 在； 依据睾酮与对应睾酮内标物在内标标准曲线上的峰面积比值，计算人血清样品中的睾 酮的含量。
【文档编号】G01N30/02GK104215716SQ201410484568
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】何翠红, 赵蓓蓓, 程雅婷, 李卓阳, 佘旭辉, 董衡, 李维, 刘伟霞, 梁晓翠 申请人:沈阳金域医学检验所有限公司