一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法
【专利摘要】一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法，涉及一种初步筛选转基因母羊的方法。本发明是要解决现有的转基因羊质量检测方法中存在的取材困难，实验周期长的技术问题。方法：一、采集TLR4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行分离培养；二、用多聚甲醛固定，然后依次用Triton-100、HCl、BSA封闭液处理；三、经PBS吹洗，加入一抗，孵育过夜，然后于二抗中孵育，染色，制片，显微镜观察并拍照；四、采用图像分析软件将耳成纤维细胞进行荧光强度定量分析比较，选择与非转基因母羊相比无显著性差异的TLR4转基因母羊耳成纤维细胞，即完成。本发明应用于初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊。
【专利说明】-种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种初步筛选转基因母羊的方法。
【背景技术】
[0002] 自1982年转基因鼠问世W来，转基因动物在疾病模型、医药、品种培育、环境保护 及资源保藏等领域取得了突破性的进展。随着转基因动物应用的不断扩大和人们对生物安 全的担忧和关注，转基因动物生物安全研究应运而生。转基因动物生物安全研究立足于转 基因动物及其产品的潜在风险，它与目的基因及其操作方式密切相关。转基因动物的目的 基因和表达产物，W及在长期使用与积累过程中，都有可能带来新的风险。为防范转基因生 物对环境及人类健康的风险，并促进转基因产业的健康发展，转基因动物研究的每一环节 都要经过严密的检测和评价，尽可能地防范一切有害于人类健康、动物健康和环境安全的 因素。
[0003] 在当前动物转基因研究中，转基因动物在不同程度上表现出生理异常和缺陷，一 直是研究者们面对的最棘手的问题之一，而该些问题与全基因组DNA甲基化异常导致的症 状非常相似，而且在转基因动物中也检测到一些甲基化水平异常的现象，DNA甲基化修饰成 为体细胞重新编程领域的主要内容之一，因此分析全基因组DNA甲基化水平变化应该是探 讨转基因动物缺陷的主要任务之一，进而评估转基因动物的生物安全性。DNA甲基化是最基 本的表观遗传修饰方式之一，对哺乳动物的发育至关重要。DNA甲基化是指在DNA甲基化转 移酶值nmts)的作用下，由S-腺巧甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，在基因组内CpG二核巧 酸中胞嚼巧的5位碳原子加上一个甲基基团巧mC)。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构 象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化分为 维持甲基化和从头甲基两种模式，参与很多重要的发育事件，例如，基因表达调控、基因组 印迹、X染色体失活及异染色质的形成。在细胞分化的过程中，基因的甲基化状态将遗传给 后代细胞。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致 抑癌基因转录失活问题，为此DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究 内容。
[0004] 通过显微注射方法生产的转基因羊，外源基因的随机插入，W及目的基因过表达， 是否影响繁殖性能尚不清楚。另外，显微操作也是影响全基因组DNA甲基化水平的重要因 素。由于转基因动物稀缺，尤其是大家畜动物，因此评估转基因动物繁殖性能困难重重，女口 取材困难，实验周期长等。本发明将通过培养耳组织成纤维细胞，采用免疫英光染色的方 法，利用confocal采集图片，检测转基因羊和非转基因羊耳成纤维细胞全基因组甲基化水 平差异，来评估转基因母羊繁殖能力，W创建新的评估方法。
【发明内容】
[0005] 本发明是要解决现有的转基因羊质量检测方法中存在的取材困难，实验周期长的 技术问题，从而提供一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法。
[0006] 本发明的一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法是按W下步骤进行：
[0007] -、采集化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行分离培养，然后得 到纤维细胞制片；
[0008] 二、用体积百分浓度为4%的多聚甲酵固定耳成纤维细胞至少30分钟，然后依次 用体积百分浓度为1 %的Triton-100处理30分钟、体积百分浓度为1 %的肥1处理30分 钟、2mg/mL的BSA封闭液封闭30分钟；
[0009] H、将耳成纤维细胞经PBS吹洗3次，然后加入一抗，4C赔育过夜，然后于FITC标 记的抗小鼠二抗中37C赔育1.化，接着于楓化丙旋中室温染色lOmin，制片，Con化cal显微 镜观察并拍照；
[0010] 四、采用图像分析软件将化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行 英光强度定量分析比较，选择与非转基因母羊相比无显著性差异的化R4转基因母羊耳成 纤维细胞，即完成可用于繁殖后代转基因母羊的初步筛选。
[0011] 本发明包括W下有益效果：
[0012] 受到目前转基因技术水平的限制，外源基因的整合效率非常低，转基因家畜的数 量非常稀少，所W转基因家畜的繁殖性能显的尤为重要，直接关系到转基因家畜自身健康 状况和后代扩群效率。该方法的建立从分子水平直接检测体细胞的全基因组甲基化水平， 进而筛选为繁殖能力正常的转基因羊提供科学依据。经繁殖生产验证，本方法具有一定的 准确性和实用性，是一种高效便捷的初步筛选具有正常繁殖性能转基因动物新方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为试验一中化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞免疫英光染色 图片；
[0014] 图2为试验一中化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞的英光强度图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0015] 一；本实施方式的一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法 是按W下步骤进行：
[0016] 一、采集化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行分离培养，然后得 到纤维细胞制片；
[0017] 二、用体积百分浓度为4%的多聚甲酵固定耳成纤维细胞至少30分钟，然后依次 用体积百分浓度为1 %的Triton-100处理30分钟、体积百分浓度为1 %的肥1处理30分 钟、2mg/mL的BSA封闭液封闭30分钟；
[0018] H、将耳成纤维细胞经PBS吹洗3次，然后加入一抗，4C赔育过夜，然后于FITC标 记的抗小鼠二抗中37C赔育1.化，接着于楓化丙旋中室温染色lOmin，制片，Con化cal显微 镜观察并拍照；
[0019] 四、采用图像分析软件将化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行 英光强度定量分析比较，选择与非转基因母羊相比无显著性差异的化R4转基因母羊耳成 纤维细胞，即完成可用于繁殖后代转基因母羊的初步筛选。
[0020] 本实施方式包括W下有益效果：
[0021] 受到目前转基因技术水平的限制，外源基因的整合效率非常低，转基因家畜的数 量非常稀少，所W转基因家畜的繁殖性能显的尤为重要，直接关系到转基因家畜自身健康 状况和后代扩群效率。该方法的建立从分子水平直接检测体细胞的全基因组甲基化水平， 进而筛选为繁殖能力正常的转基因羊提供科学依据。经繁殖生产验证，本方法具有一定的 准确性和实用性，是一种高效便捷的初步筛选具有正常繁殖性能转基因动物新方法。
【具体实施方式】 [0022] 二；本实施方式与一不同的是；步骤H中一抗为5-甲 基胞嚼巧。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0023] H ;本实施方式与一或二不同的是：步骤四所述图像 分析软件为EZ-Cl化eeViewer。其它与一或二相同。
[0024] 通过W下试验验证本发明的有益效果：
[00巧]试验一；本试验的一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法是按W下步骤 进行：
[0026] 一、采集化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行分离培养，然后得 到纤维细胞制片；
[0027] 二、用体积百分浓度为4%的多聚甲酵固定耳成纤维细胞至少30分钟，然后依次 用体积百分浓度为1 %的Triton-100处理30分钟、体积百分浓度为1 %的肥1处理30分 钟、2mg/mL的BSA封闭液封闭30分钟；
[0028] H、将耳成纤维细胞经PBS吹洗3次，然后加入一抗，4C赔育过夜，然后于FITC标 记的抗小鼠二抗中37°C赔育1.化，接着于楓化丙旋中室温染色IOmin,制片，Con化cal显微 镜观察并拍照；
[0029] 四、采用图像分析软件将化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行 英光强度定量分析比较，选择与非转基因母羊相比无显著性差异的化R4转基因母羊耳成 纤维细胞，即完成可用于繁殖后代转基因母羊的初步筛选。
[0030] 本试验中化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞免疫英光染色图片如 图1所示，图中TG表示转化R4基因羊，WT表示非转基因羊，5-Mec为5甲基胞嚼巧，在图片 显示绿色英光，DNA就是细胞核，显示红色英光，Merge是绿色英光和红色英光叠加的效果， 其目的是为了表示DNA甲基化免疫英光染色位点的正确性，即绿色英光和红色英光是完全 重合的。
[0031] 本试验中化R4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞的英光强度图如图2 所示，图中TG表示转化R4基因羊，WT表示非转基因羊，结果表明，转化R4基因羊母耳成纤 维细胞的耳成纤维细胞与非转基因母羊的耳成纤维细胞的英光强度无显著差异（P〉〇. 05)。
[0032] 本试验初步筛选的可用于繁殖后代转基因母羊与非转基因母羊的基本繁殖生理 指标比较，如表1所示；
[0033] 表 1
[0034]
【权利要求】
1. 一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法，其特征在于初步筛选可用于繁殖 后代转基因母羊的方法是按以下步骤进行： 一、 采集TLR4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行分离培养，然后得到纤 维细胞制片； 二、 用体积百分浓度为4%的多聚甲醛固定耳成纤维细胞至少30分钟，然后依次用体 积百分浓度为1 %的Triton-100处理30分钟、体积百分浓度为1 %的HC1处理30分钟、 2mg/mL的BSA封闭液封闭30分钟； 三、 将耳成纤维细胞经PBS吹洗3次，然后加入一抗，4°C孵育过夜，然后于FITC标记的 抗小鼠二抗中37°C孵育1. 5h，接着于碘化丙碇中室温染色lOmin，制片，Confocal显微镜观 察并拍照； 四、 采用图像分析软件将TLR4转基因母羊和非转基因母羊的耳成纤维细胞进行荧光 强度定量分析比较，选择与非转基因母羊相比无显著性差异的TLR4转基因母羊耳成纤维 细胞，即完成可用于繁殖后代转基因母羊的初步筛选。
2. 根据权利要求1所述的一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法，其特征在 于步骤三中一抗为5-甲基胞嘧啶。
3. 根据权利要求1所述的一种初步筛选可用于繁殖后代转基因母羊的方法，其特征在 于步骤四所述图像分析软件为EZ-CIFreeViewer。
【文档编号】G01N33/68GK104237533SQ201410489940
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】房义, 钟荣珍, 周道玮 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所