流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用。该应用是将流式细胞术方法应用于疫苗生产过程中，实时监测疫苗生产过程中的活菌数。本发明通过荧光染料对菌细胞进行着染，用流式细胞仪检测细菌荧光信号的变化，通过测定细菌荧光信息的变化，得到具有如下参数中的至少两种的FCM图谱：活菌数、死菌数和总菌数；依据FCM图谱得到活菌数的比例；通过绝对计数法得到目标菌菌液的浓度；依据活菌数的比例和目标菌菌液的浓度，得到目标菌的活菌量和死菌量。本发明为疫苗生产过程提供一种简便、快速、可靠的细菌活性监测方法，其简便易行，操作时间仅需30min，且能精确控制疫苗生产过程的质量。
【专利说明】流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及流式细胞术的技术应用，特别涉及流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用。
【背景技术】
[0002]疫苗生产过程中菌液发酵过程的控制是疫苗生产的关键环节。温度、pH值、培养液的营养状态等多种因素均影响菌液的发酵过程。因此建立简便、快速、可靠的细菌活性检测方法对疫苗生产的监控具有实际意义。传统的监控疫苗生产的方法主要有培养计数法和比浊计数法，目前疫苗生产厂商对疫苗质量的控制仍然依赖于这两种方法。培养法灵敏度高但耗时长，通常需要24h以上才能获得结果，不能达到即时控制菌液发酵过程的目的斗匕浊法操作简单但采用肉眼观察，检测灵敏度差，且不能区分活菌和死菌。
[0003]因此，急需一种能实时监控疫苗生产过程中活菌数目的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，是将流式细胞术方法应用于疫苗生产过程中，检测疫苗生产过程中的活菌数；
[0006]所述的疫苗包括大肠杆菌疫苗、葡萄球菌疫苗、猪丹毒疫苗、链球菌疫苗、沙门氏菌疫苗、魏氏梭菌疫苗、鸡毒支原体疫苗、多杀性巴氏杆菌疫苗和副猪嗜血杆菌疫苗等等。
[0007]所述的流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，优选包含如下步骤:
[0008](I)选择如下所述的荧光染料中的至少两种着染目标菌；荧光染料为对活菌细胞能进行染色的染料、对总菌数能进行染色的染料和对死菌细胞能进行染色的染料；
[0009](2)然后用流式细胞仪检测细菌荧光信号的变化，通过测定细菌荧光信息的变化，得到FCM图谱；FCM图谱具有如下参数中的至少两种:活菌数、死菌数和总菌数；依据FCM图谱得到活菌数的比例；
[0010](3)通过绝对计数法得到目标菌菌液的浓度；
[0011](4)依据步骤(2)得到的活菌数的比例和步骤(3)得到的目标菌菌液的浓度，得到目标菌的活菌量和死菌量。
[0012]步骤(I)优选为:选择如下所述的荧光染料着染目标菌；荧光染料为对活菌细胞能进行染色的染料和对总菌数能进行染色的染料中的一种与对死菌细胞能进行染色的染料形成的组合；
[0013]步骤(I)中所述的对活菌细胞能进行染色的染料优选为CFDA-SE ;荧光染料CFDA-SE可以进入细胞膜，被菌体细胞内的酯酶酶解后发出荧光，为膜渗透性染料；酶解后产物不能穿过细胞膜，染色为不可逆性，因此CFDA-SE只能染色活菌细胞；
[0014]步骤(I)中所述的对总菌数能进行染色的染料优选为SYBR Green I ；SYBR GreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，能与所有的双链DNA相结合，与双链DNA结合后，发出绿色荧光，且荧光大大增强；其最大吸收波长约为497nm，发射波长最大为520nm，SYBR Green I可染色所有活菌和死菌；
[0015]步骤(I)中所述的对死菌细胞能进行染色的染料优选为PI ;PI(碘化丙啶，Propidium 1dide)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,PI为膜非渗透性染料,不能通过活细胞膜，但能穿过破损的细胞膜而对核染色，在嵌入双链DNA后释放红色荧光；
[0016]步骤(3)中所述通过绝对计数法得到目标菌菌液的浓度可通过血球计数板计数或通过流式细胞仪计数；
[0017]所述的通过流式细胞仪计数优选为通过如下步骤实现:将已知浓度的磁珠和所述的目标菌菌液混合，通过流式细胞仪检测，通过如下公式计算得到目标菌菌液的浓度；
[0018]公式为:
[0019](菌细胞数/磁珠数)X(每管内总磁珠数/样品总体积)X稀释倍数=菌液浓度；
[0020]菌细胞数指一定时间内流式细胞仪检测到的菌细胞数；磁珠数指一定时间内流式细胞仪检测到的磁珠数；每管内总磁珠数指样品检测管内的磁珠总数；稀释倍数指菌液的稀释倍数。
[0021 ] 所述的磁珠的粒径优选为5.5 μ m ;
[0022]所述的流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，更优选包含如下步骤:
[0023]1、建立菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照，确定流式细胞仪的操作参数:
[0024]①将目标菌活化，培养至对数生长期；将其中的一部分菌液灭活，灭活的菌液作为死菌对照；未经处理的菌液，为活菌对照；
[0025]②用PBS将步骤①得到的两种细胞分别洗涤，然后用PBS重悬至0D_为0.002?
0.006，得到死菌对照菌液和活菌对照菌液；
[0026]③得到菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照:
[0027]A、将活菌对照菌液与死菌对照菌液混合得到的混合菌液上流式细胞仪，通过调整流式细胞仪的光电二级管电压，以调节前向散射光FSC和侧向散射光SSC的强度，以SSC/FSC设门，确定待检菌细胞在流式细胞仪成像图中的位置，用以消除待检菌的自发荧光；
[0028]B、在活菌对照菌液中加入SYBR Green I或CFDA-SE单色荧光染料，振荡混匀，避光反应；然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC门，调整SYBR Green I或CFDA-SE的PMT电压进行荧光补偿，用于从被检测的荧光信号中去除由于荧光素发射光谱重叠而引起的干扰荧光信号，同时可用于排除由于染料的质量、浓度以及染色方法等因素对检测结果的影响，得到SYBR Green I或CFDA-SE的补偿对照图，确定SYBR Green I或CFDA-SE荧光强度的电压；在死菌对照菌液中加入PI单色荧光染料，振荡混匀，避光反应；然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC门，调整PI的PMT电压进行荧光补偿，得到PI补偿对照图，确定PI荧光强度的电压；在活菌对照菌液与死菌对照菌液混合得到的混合菌液中加入SYBR Green I和CFDA-SE中的一种与PI组成的复合荧光染料，振荡混匀，避光反应；然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC门，调整复合荧光染料的PMT电压进行双色荧光补偿，得到复合荧光染料补偿对照图，确定复合荧光染料荧光强度的电压；
[0029]11、菌液发酵过程的监测
[0030]①在疫苗生产的不同阶段，取发酵菌液样品；
[0031]②PBS洗涤发酵菌液样品，然后用PBS重悬发酵菌至OD6tltlS 0.002?0.006 ;将得到的菌液标记上两种荧光染料，所使用的荧光染料和步骤I相同，使用的电压为步骤I③B最终确定的电压；流式细胞仪检测，画门分群后，得到各群比例；
[0032]③将已知浓度的磁珠和发酵菌液样品混合，通过流式细胞仪检测，通过如下公式计算得到发酵菌液的浓度；
[0033]公式为:
[0034](菌细胞数/磁珠数)X(每管内总磁珠数/样品总体积)X稀释倍数=菌液浓度；
[0035]④依据各群比例和发酵菌液的浓度，对发酵菌中的活菌和死菌进行定量。
[0036]本发明中对菌的洗涤均为先将菌液离心，取沉淀，然后加入PBS重悬，离心，弃上清，即完成一次洗涤；
[0037]步骤I①中所述的灭活的步骤优选为:将菌液离心，取沉淀；使用浓度为质量体积比70%的乙醇溶液分散沉淀静置至少I小时或加入PBS分散均匀后煮沸5?1min即可；
[0038]步骤I ②中所述的 PBS 为 ρΗ6.2 ?7.4,0.01 ?0.lmol/L 的 PBS ；
[0039]步骤I②中所述的洗涤的次数优选为2次；
[0040]步骤I③中所述的SYBR Green I的用量优选按在菌液中的终浓度为0.1?20 μ M计算;
[0041]步骤I③中所述的CFDA-SE的用量优选按在菌液中的终浓度为0.1?20 μ M计算；
[0042]步骤I③中所述的PI的用量优选按在菌液中的终浓度为0.1?10 μ g.ml/1计算；
[0043]步骤I③中所述的避光反应的时间为至少5min ;优选如下:当所使用的染料为SYBR Green I或CFDA-SE时，避光反应的时间为1min ;当所使用的染料为PI时，避光反应的时间为5min ；
[0044]所述的避光反应的温度优选为20?30°C ；
[0045]步骤I③中所述的补偿对照图在制作时，优选先单染菌细胞，再双染菌细胞；
[0046]步骤II①中所述的发酵菌液样品的体积优选为0.2mL?ImL ；
[0047]步骤II③中所述的磁珠的粒径优选为5.5 μ m。
[0048]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0049](I)本发明为疫苗生产过程提供一种简便、快速、可靠的细菌活性监测方法。
[0050](2)本发明简便易行，操作时间仅需30min，远少于传统的培养法。可对细菌进行逐个检测，无需大量繁殖，即可在短时间内精确检测大量细菌，故对生长周期长的细菌，该方法具有更为显著地优越性。
[0051](3)本发明能精确控制疫苗生产过程的质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]图1是鸡毒支原体的SYBR Green I和PI染色的散点图，其中:图A、B和E为活菌细胞；图C、D和F为死菌细胞；图G为活菌和死菌混合菌液；图H为菌液未染色空白对照；当双重染色时，Q2区为死菌细胞区，Q3为活菌细胞区；当单染PI时，Ql区为死菌细胞区；当单染SYBR Green I时，死菌细胞和活菌细胞均显示为阳性，为Q3区。
[0053]图2是流式细胞术方法监测鸡毒支原体疫苗生产菌液发酵过程的散点图。
[0054]图3是鸡毒支原体菌细胞绝对计数散点图，其中:P1区为菌细胞区，P2区为磁珠区。
[0055]图4是魏氏梭菌活菌细胞和死菌细胞CFDA-SE和PI染色对照的散点图，其中:图A、B和E为活菌细胞；图C、D和F为死菌细胞；图G为活菌和死菌混合菌液；图H为菌液未染色空白对照；Q3区为活菌细胞区，Ql为死菌细胞区。
[0056]图5是流式细胞术方法监测魏氏梭菌疫苗生产菌液发酵过程的散点图。
[0057]图6是魏氏梭菌菌细胞绝对计数散点图，其中:P1区为菌细胞区，P2区为磁珠区。
【具体实施方式】
[0058]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0059]实施例1
[0060](I)建立鸡毒支原体菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照
[0061]①将鸡毒支原体F-36株(中国兽医药品监察所)经改良Frey氏培养基活化，37°C培养80h以上，接种摇瓶发酵培养基(改良Frey氏培养基)，37°C培养至细菌生长对数期，取2管发酵液，各ImL ;将发酵液离心(9000rpm离心1min)，弃上清，得到菌细胞。在其中一管菌细胞中加入ImL质量体积比70%的乙醇溶液，混匀后放置I小时，或加入ImL PBS,煮沸lOmin，目的是为了灭活，得到死菌对照；同时将另一管未经处理的菌细胞作为活菌对照。
[0062]②用PBS (pH7.4,0.0lmol/L)将步骤①的两种细胞分别洗涤2次，然后用PBS分别重悬至OD600为0.002。
[0063]A、用活菌对照和死菌对照按体积比1:1混合得到混合菌液，作为空白对照。通过调整流式细胞仪的光电二级管电压，以调节前向散射光FSC和侧向散射光SSC的强度，以SSC/FSC设门，确定待检菌细胞在流式细胞仪成像图中的位置，用以消除待检菌的自发荧光，得到FSC和SSC的工作电压是412伏和363伏，结果如图1中H所示；
[0064]B,SYBR Green I单染，作为补偿对照。步骤为:在菌液(即OD6tltl为0.002的菌液)中加入SYBR Green I染色液，SYBR Green I染色液的终浓度为0.1 μ Μ，振荡混匀，室温避光反应lOmin，然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC设门，调整SYBR Green I的PMT电压进行荧光补偿，用于从被检测的荧光信号中去除由于荧光素发射光谱重叠而引起的干扰荧光信号，同时可用于排除由于染料的质量，浓度以及染色方法等因素对检测结果的影响，得到SYBR Green I补偿对照图，确定SYBR Green I荧光强度的电压是414伏，结果如图1中的A(活菌对照)和C(死菌对照)所示；
[0065]C、PI单染，作为补偿对照。步骤为:在菌液中加入PI染色液，PI染色液的终浓度为0.1 μ g.mL—1，振荡混匀，室温避光反应5min ;然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC设门，调整PI的PMT电压进行荧光补偿，得到PI补偿对照图，确定PI荧光强度的电压是533伏，结果如图1中的B(活菌对照)和D(死菌对照)所示；
[0066]D、SYBR Green I和PI双染，作为补偿对照。步骤为:在菌液中加入PI染色液和SYBR Green I染色液，SYBR Green I染色液的终浓度为0.1 μ M，PI染色液的终浓度为
0.1 μ g.mL—1，振荡混匀，室温避光反应1min ;然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的FSC/SSC设门，调整SYBR Green I和PI的PMT电压进行双色荧光补偿，得到SYBR Green I和PI补偿对照图，确定SYBR Green I和PI荧光强度的电压是414和533伏，结果如图1中的E (活菌对照)、F (死菌对照)和G (活菌对照和死菌对照按体积比1:1混合得到的混合菌液)所示。
[0067]设定鸡毒支原体菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照，以此作为排除自发荧光的影响，同时用于设置和调整电压，及去除由于荧光素发射光谱重叠而引起的干扰荧光信号等。流式细胞仪检测时，每个菌细胞由四种参数定义:两个非荧光信号和两个荧光信号。其中两个非荧光信号分别是侧向散射光信号(用于测量细胞颗粒度)和前向散射光信号(用于测量细胞大小)，二者的结合可用于从混合细胞群中分辨出不同的细胞群。两个荧光信号分别是SYBR Green I和PI红色荧光染料接收激光的能量被激发而发射的光信号；SYBR Green I的激发波长为488nm，发射波长为525nm，作为绿色荧光而被检测。PI的激发波长为488nm,发射波长为625nm,作为红色突光而被检测。
[0068](2)取鸡毒支原体F-36株疫苗生产过程中不同阶段的发酵液各2管、每管lmL(9000rpm离心1min)，一管用于流式细胞仪检测，一管使用传统培养法进行培养。
[0069](3)流式细胞仪检测:
[0070]①PBS洗涤2次后，重悬细胞浓度为OD6tltl = 0.002，用SYBR Green I和PI双重染色(操作过程同步骤(I)②D)，操作参数:FSC的电压值是412伏，SSC的电压值是363伏，SYBR Green I和PI的电压值是414伏和533伏，流式细胞仪检测(如图2所示)，画门分群后，得到各群比例。
[0071]②将已知浓度的磁珠(粒径为5.5 μ m)与菌液混合后，通过流式细胞仪检测(如图3所示)，通过如下公式计算得到发酵液的浓度；
[0072](菌细胞数/磁珠数)X(每管内总磁珠数/样品总体积)X稀释倍数=菌液浓度；
[0073]菌细胞数指一定时间内流式细胞仪检测到的菌细胞数；磁珠数指一定时间内流式细胞仪检测到的磁珠数；每管内总磁珠数指样品检测管内的磁珠总数；稀释倍数指菌液的稀释倍数。例磁珠总数为54829，用20 μ L PBS充分溶解，加入480 μ L菌液，混匀后，上流式细胞仪检测，磁珠数为1000，菌细胞数2261，则菌液浓度为(2261/1000) *(54829/(500*0.001)) *(500/480) = = 2.5*105ccu (颜色变化单位).mL'
[0074]③SYBR Green I染色得到总菌量，PI染色得到死菌量。通过步骤①得到的各群比例和步骤②得到的发酵液浓度，可得到死菌数，从而计算得到活菌数，得到定量结果。计算公式是:死菌比例X浓度=死菌数；活菌比例X浓度=活菌数。
[0075](4)传统平板计数方法:将步骤(2)中取出的I管发酵液做10倍梯度稀释至10_6，分别将10_4、10_5、10_6三个梯度的菌液涂改良Frey氏培养基平板，每个梯度涂3个平板，置37°C培养箱中培养3-7天后，计数平板，求平均值，得到活菌浓度为3 X 15ccu -πιΓ1,与流式细胞术方法结果一致，但耗时长3-7天左右，不能用于疫苗生产的实时监控。传统比浊法:将步骤(2)中菌液作10倍梯度稀释后，与麦氏比浊管比较，通过肉眼观察得到菌液浓度的数量级为15?16CCU 操作较快，但不能区分活菌和死菌，而且通过肉眼观察，不能得到客观、准确的实验结果，因而导致疫苗质量的不稳定性。
[0076]本发明提供的流式细胞术方法，操作时间在30分钟以内，而且数据准确客观，操作性强，可有效克服目前疫苗生产过程中的弊端。
[0077]实施例2
[0078](I)建立魏氏梭菌菌细胞的荧光强度空白对照和补偿对照
[0079]①将魏氏梭菌(ATCC13124,购自American type culture collect1n 菌种库)，接种种子培养基液体硫乙醇酸盐(FT)培养基，37°C培养24h活化，接种摇瓶发酵培养基(FT培养基)，37°C培养24h至细菌生长对数期，取2管发酵液，各ImL ;将发酵液离心(5000rpm离心lOmin)，弃上清，得到菌细胞。在其中一管菌细胞中加入ImL PBS (pH6.2、0.01mol/L)，煮沸5min，目的是为了灭活，得到死菌对照；同时将另一管未经处理的菌细胞作为活菌对照。
[0080]②用PBS将步骤①的两种细胞分别洗涤2次，然后用PBS重悬至0D_为0.004。
[0081]A、用活菌对照和死菌对照按体积比1:1混合得到混合菌液，作为空白对照。通过调整流式细胞仪的光电二级管电压，以调节前向散射光FSC和侧向散射光SSC的强度，以SSC/FSC设门，确定待检菌细胞在流式细胞仪成像图中的位置，用以消除待检菌的自发荧光，得到FSC和SSC的工作电压是476伏和500伏，结果如图4中H所示；
[0082]B,CFDA-SE单染，作为补偿对照。步骤为:在菌液中加入CFDA-SE染色液，CFDA-SE染色液的终浓度为0.1 μ M，振荡混匀，室温避光反应lOmin，然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC设门，调整CFDA-SE的PMT电压进行荧光补偿，用于从被检测的荧光信号中去除由于荧光素发射光谱重叠而引起的干扰荧光信号，同时可用于排除由于染料的质量，浓度以及染色方法等因素对检测结果的影响，得到CFDA-SE补偿对照图，确定CFDA荧光强度的电压是450伏，结果如图4中的A(活菌对照)和C(死菌对照)所示；
[0083]C、PI单染，作为补偿对照。步骤为:在菌液中加入PI染色液，PI染色液的终浓度为0.1 μ g.mL—1，振荡混匀，室温避光反应5min ;然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC设门，调整PI的PMT电压进行荧光补偿，得到PI补偿对照图，确定PI荧光强度的电压是545伏，结果如图4中的B(活菌对照)和D(死菌对照)所示；
[0084]D、CFDA-SE和PI双染，作为补偿对照。步骤为:在菌液中加入PI染色液和CFDA染色液，CFDA染色液的终浓度为0.1 μ M，PI染色液的终浓度为0.1 μ g.πι?Λ振荡混匀，室温避光反应1min ;然后上流式细胞仪检测，以A步骤中设定的FSC/SSC设门，调整CFDA-SE和PI的PMT电压进行双色荧光补偿，得到CFDA-SE和PI补偿对照图，确定CFDA-SE和PI荧光强度的电压是450和545伏，结果如图4中的E(活菌对照)、F(死菌对照)和G(活菌对照和死菌对照按体积比1:1混合得到的混合菌液)所示。
[0085]设定魏氏梭菌菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照，以此作为排除自发荧光的影响，同时用于设置和调整电压，及去除由于荧光素发射光谱重叠而引起的干扰荧光信号等。流式细胞仪检测时，每个菌细胞由四种参数定义:两个非荧光信号和两个荧光信号。其中两个非荧光信号分别是侧向散射光信号(用于测量细胞颗粒度)和前向散射光信号(用于测量细胞大小)，二者的结合可用于从混合细胞群中分辨出不同的细胞群。两个荧光信号分别是CFDA-SE和PI红色荧光染料接收激光的能量被激发而发射的光信号；CFDA-SE的激发波长为488nm,发射波长为525nm,作为绿色突光而被检测。PI的激发波长为488nm,发射波长为625nm,作为红色荧光而被检测。
[0086](2)取魏氏梭菌疫苗生产过程中不同阶段的发酵液各2管、每管lmL，一管用于流式细胞仪检测，一管使用传统培养法进行培养。
[0087](3)流式细胞仪检测:
[0088]①PBS洗涤2次后，重悬细胞浓度为OD6tltl = 0.004，用CFDA-SE和PI双重染色(操作过程同步骤(I)②D)，操作参数是FSC的电压值是476伏，SSC的电压值是500伏，CFDA-SE和PI的电压值是450伏和545伏，流式细胞仪检测，画门分群后，得到各群比例(如图5所示)。
[0089]②将已知浓度的磁珠(粒径为5.5μπι)与菌液混合后，通过流式细胞仪检测，通过实施例1提供的公式计算得到发酵液的浓度(如图6所示)；
[0090]③CFDA-SE染色得到活菌量，PI染色得到死菌量。通过步骤①得到的各群比例和步骤②得到的菌液浓度，可得到活菌数和死菌数，得到定量结果。技术公式是:活菌比例*浓度=活菌数。
[0091](4)传统平板计数方法:将步骤(2)中取出的I管发酵液做10倍梯度稀释至10_6，分别将10_4、10_5、10_6三个梯度的菌液涂FT营养琼脂平板，每个梯度涂3板，(36 + 1) V厌氧培养24小时，计数平板，求平均值得到活菌浓度为3 X 15CCU -mL-1,与流式细胞术方法结果一致，操作繁琐，耗时长。传统比浊法:将步骤(2)中的发酵液作10倍梯度稀释后，与麦氏比浊管比较，通过肉眼观察得到菌液浓度的数量级为15?16ccu 操作较快，但不能区分活菌和死菌，而且通过肉眼观察，不能得到客观、准确的实验结果，因而导致疫苗质量的不稳定性。
[0092]本发明提供的流式细胞术方法，操作时间在30分钟以内，而且数据准确客观，操作性强，可有效克服目前疫苗生产过程中的弊端。
[0093]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于:是将流式细胞术方法应用于疫苗生产过程中，检测疫苗生产过程中的活菌数； 所述的疫苗包括大肠杆菌疫苗、葡萄球菌疫苗、猪丹毒疫苗、链球菌疫苗、沙门氏菌疫苗、魏氏梭菌疫苗、鸡毒支原体疫苗、多杀性巴氏杆菌疫苗和副猪嗜血杆菌疫苗。
2.根据权利要求1所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于包含如下步骤: (1)选择如下所述的荧光染料中的至少两种着染目标菌；荧光染料为对活菌细胞能进行染色的染料、对总菌数能进行染色的染料和对死菌细胞能进行染色的染料； (2)然后用流式细胞仪检测细菌荧光信号的变化，通过测定细菌荧光信息的变化，得到FCM图谱；FCM图谱具有如下参数中的至少两种:活菌数、死菌数和总菌数；依据FCM图谱得到活菌数的比例； (3)通过绝对计数法得到目标菌菌液的浓度； (4)依据步骤(2)得到的活菌数的比例和步骤(3)得到的目标菌菌液的浓度，得到目标菌的活菌量和死菌量。
3.根据权利要求2所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于:步骤(I)为:选择如下所述的荧光染料着染目标菌；荧光染料为对活菌细胞能进行染色的染料和对总菌数能进行染色的染料中的一种与对死菌细胞能进行染色的染料形成的组合。
4.根据权利要求2或3所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于: 步骤(I)中所述的对活菌细胞能进行染色的染料为CFDA-SE ；； 步骤(I)中所述的对总菌数能进行染色的染料为SYBR Green I ； 步骤(I)中所述的对死菌细胞能进行染色的染料为PI。
5.根据权利要求2所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于:步骤(3)中所述通过绝对计数法得到目标菌菌液的浓度通过血球计数板计数或通过流式细胞仪计数。
6.根据权利要求5所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于:所述的通过流式细胞仪计数为通过如下步骤实现:将已知浓度的磁珠和所述的目标菌菌液混合，通过流式细胞仪检测，通过如下公式计算得到目标菌菌液的浓度； 公式为: (菌细胞数/磁珠数)*(每管内总磁珠数/样品总体积)*稀释倍数=菌液浓度； 菌细胞数指一定时间内流式细胞仪检测到的菌细胞数；磁珠数指一定时间内流式细胞仪检测到的磁珠数；每管内总磁珠数指样品检测管内的磁珠总数；稀释倍数指菌液的稀释倍数。
7.根据权利要求2、3、5和6中任一项所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于包含如下步骤: 1、建立菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照，确定流式细胞仪的操作参数: ①将目标菌活化，培养至对数生长期；将其中的一部分菌液灭活，灭活的菌液作为死菌对照；未经处理的菌液，为活菌对照； ②用PBS将步骤①得到的两种细胞分别洗涤，然后用PBS重悬至0D_为0.002?0.006，得到死菌对照菌液和活菌对照菌液； ③得到菌细胞的空白对照和荧光强度补偿对照: A、将活菌对照菌液与死菌对照菌液混合得到的混合菌液上流式细胞仪，通过调整流式细胞仪的光电二级管电压，以调节前向散射光FSC和侧向散射光SSC的强度，以SSC/FSC设门，确定待检菌细胞在流式细胞仪成像图中的位置，用以消除待检菌的自发荧光； B、在活菌对照菌液中加入SYBRGreen I或CFDA-SE单色荧光染料，振荡混匀，避光反应；然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC门，调整SYBR Green I或CFDA-SE的PMT电压进行荧光补偿，用于从被检测的荧光信号中去除由于荧光素发射光谱重叠而引起的干扰荧光信号，同时用于排除染料的质量、浓度以及染色方法对检测结果的影响，得到SYBR Green I或CFDA-SE的补偿对照图，确定SYBR Green I或CFDA-SE荧光强度的电压；在死菌对照菌液中加入PI单色荧光染料，振荡混匀，避光反应；然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC门，调整PI的PMT电压进行荧光补偿，得到PI补偿对照图，确定PI荧光强度的电压；在活菌对照菌液与死菌对照菌液混合得到的混合菌液中加入SYBR GreenI和CFDA-SE中的一种与PI组成的复合荧光染料，振荡混匀，避光反应；然后上流式细胞仪检测，以步骤A中设定的SSC/FSC门，调整复合荧光染料的PMT电压进行双色荧光补偿，得到复合荧光染料补偿对照图，确定复合荧光染料荧光强度的电压； I1、菌液发酵过程的监测 ①在疫苗生产的不同阶段，取发酵菌液样品； ②PBS洗涤发酵菌液样品，然后用PBS重悬发酵菌至OD_为0.002?0.006 ;将得到的菌液标记上两种荧光染料，所使用的荧光染料和步骤I相同，使用的电压为步骤I③B最终确定的电压；流式细胞仪检测，画门分群后，得到各群比例； ③将已知浓度的磁珠和发酵菌液样品混合，通过流式细胞仪检测，通过如下公式计算得到发酵菌液的浓度； 公式为: (菌细胞数/磁珠数)*(每管内总磁珠数/样品总体积)*稀释倍数=菌液浓度； ④依据各群比例和发酵菌液的浓度，对发酵菌中的活菌和死菌进行定量。
8.根据权利要求7所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于: 步骤I①中所述的灭活的步骤为:将菌液离心，取沉淀；使用浓度为质量体积比70%的乙醇溶液分散沉淀静置至少I小时或加入PBS分散均匀后煮沸5?1min ； 步骤I②中所述的PBS为ρΗ6.2?7.4,0.01?0.lmol/L的PBS ； 步骤I③中所述的避光反应的时间为至少5min ； 步骤II③中所述的磁珠的粒径为5.5 μ m。
9.根据权利要求7所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于: 步骤I③中所述的SYBR Green I的用量按在菌液中的终浓度为0.1?20 μ M计算； 步骤I③中所述的CFDA-SE的用量按在菌液中的终浓度为0.1?20 μ M计算； 步骤I③中所述的PI的用量按在菌液中的终浓度为0.1?10 μ g.πιΓ1计算。
10.根据权利要求9所述流式细胞术方法在疫苗生产实时监测中的应用，其特征在于: 所述的SYBR Green I的避光反应时间为1min ； 所述的CFDA-SE的避光反应时间为1min ；
所述的PI的避光反应的时间为5min。
【文档编号】G01N15/14GK104198357SQ201410493364
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】孙俊颖, 刘志成, 郭鹏举 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所