毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法
【专利摘要】本发明涉及一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，属于生物分离分析【技术领域】。所述方法如下：对反应物进行毛细管区带电泳，进样顺序先后依次为：毛细管中迁移速率慢的反应物，电泳缓冲溶液，毛细管中迁移速率快的反应物，使迁移速率不同的反应物在所述电泳过程的毛细管中实现在线反应混和后完成电泳，分离收集电泳产物，对所述产物进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测；所述反应物为蛋白质和ssDNA。所述方法中两种反应物在毛细管电泳过程中完成在线混合及反应，不需孵育；复合物通过在线分离，快速简便；所述方法高效，快速，且样品用量少，利用率高，尤其适用于来源困难，价格昂贵的蛋白质。
【专利说明】毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，属于生 物分离分析【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 单链寡核苷酸（Single-stranded DNA，ssDNA)或RNA具有特定二级结构，可以与 蛋白质分子形成高亲和性和特异性的复合物。寡核苷酸文库是一类含有10 13?1〇15种不同 碱基的单链DNA分子（ssDNA)混合物，其中可能含有一种或数种能与靶分子具有高特异性， 高亲和性结合的ssDNA，即核酸适配体（Aptamer)。核酸适配体是通过指数富集配体系统进 化（SELEX)技术，从随机寡核苷酸文库中筛选得到的,具有与靶分子高亲和性和高特异性 的寡核苷酸序列配体，其特性是亲和力高、特异性强、易制备及修饰，并且靶分子分布广。由 于在生物，医药以及分子识别和检测方面有重要的应用价值，目前已经发展出多种核酸适 配体的筛选方法，如亲和色谱，膜过滤，磁珠分离及毛细管电泳等。
[0003] 毛细管电泳（CE)具有高效、快速以及实验成本低等优点，是新型的微量分离分析 技术，在蛋白质的核酸适配体筛选中有广泛的应用。
[0004] CE用于SELEX筛选核酸适配体即为CE-SELEX。CE-SELE)(可使核酸适配体筛选周 期缩短至传统SELEX技术的三分之一，大大加快了筛选效率。由于传统的CE-SELEX技术中， 需将初始的ssDNA文库与靶分子混合孵育，并需要对孵育的温度、时间以及ssDNA文库与靶 分子的比例做一系列优化，使操作复杂、耗时且样品耗费大。
【发明内容】
[0005] 针对传统的CE-SELEX技术筛选适配体时，靶分子用量大、反应条件优化过程繁琐 以及耗时费力的缺陷，本发明的目的在于提供一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核 酸复合物的方法，所述方法基于毛细管电泳的在线反应及分离方法，用于靶分子核酸适配 体的高效筛选。
[0006] 为实现本发明的目的，采用的技术方案如下。
[0007] 一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，所述在线反应为本 领域常用术语，是指在毛细管区带电泳时毛细管中的反应，所述方法步骤如下：
[0008] 对反应物进行毛细管区带电泳，进样顺序先后依次为：毛细管中迁移速率慢的反 应物，电泳缓冲溶液，毛细管中迁移速率快的反应物，使迁移速率不同的反应物在所述电泳 过程的毛细管中实现在线反应混和后完成电泳，分离收集电泳产物，对所述产物进行毛细 管电泳-激光诱导荧光（CE-LIF)检测；所述反应物为蛋白质和ssDNA,根据本领域毛细管 区带电泳的要求制成样品溶液后进样。
[0009] 优选在电泳缓冲液中加入反应物之一，可抑制复合物在所述电泳过程中解离，进 而促进较弱复合物的形成。
[0010] 其中，所述毛细管中的迁移速率可通过分别对反应物，即蛋白质和ssDNA进行毛 细管区带电泳，根据所述反应物的出峰时间确定，先出峰的反应物迁移速率快。
[0011] 通过改变所述反应物的进样时间，即进样量，可获得不同反应物的最佳进样量比 例。
[0012] 所述反应物可通过以下方法制成样品溶液进样：将蛋白质溶于纯水中制成原始蛋 白质储备液，将ssDNA溶于纯水中制备成原始ssDNA储备液；将原始蛋白质储备液稀释后得 到蛋白质样品溶液，将原始ssDNA储备液稀释后得到ssDNA样品溶液。
[0013] 优选确定反应物在毛细管中的迁移速率时的毛细管区带电泳使用涂层毛细管，可 抑制蛋白质在管壁的吸附，可采用总长度48· 5cm,有效长度40cm，内径75 μ m的毛细管；可 使用Agilent 7100毛细管电泳仪进行所述电泳；电泳缓冲液可为硼酸硼砂溶液，可通过将 50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8. 7 ; 进样条件可为：50mbar下，进样3s?25s,分析条件可为：分析温度25°C，分析电压_15kV ; 可使用UV 195nm进行检测。
[0014] 优选反应物在毛细管区带电泳在线反应时所使用的毛细管为涂层毛细管，可抑制 蛋白质在管壁的吸附，可采用总长度为50. 2cm，有效长度为40cm，内径为75 μ m的涂层毛细 管；可采用Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪进行所述电泳；电泳缓冲液与确定反应物在 毛细管中的迁移速率时的毛细管区带电泳使用的电泳缓冲液相同，可采用硼酸硼砂溶液， 可通过50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值 为8. 7 ;进样条件可为：蛋白质进样：0. 5psi,20s ;电泳缓冲液进样：0. 5psi，10s ;ssDNA进 样：0. 5psi，10s ;分析条件可为：分析温度为25°C，分析电压为-15kV ;可采用的毛细管电 泳-激光诱导焚光（CE-LIF)检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm。
[0015] 有益效果
[0016] 1.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，首 先进样迁移速率慢的反应物，中间进样电泳缓冲液隔离，然后进样迁移速率快的反应物，可 避免两种反应物提前混合，确保两种反应物在电泳分离开始后进行在线反应，在毛细管电 泳过程中，迁移速率快的反应物会"穿越"迁移速率慢的反应物区域，并在"穿越"过程中伴 随复合物的形成和解离过程；由于所述方法是将反应物在毛细管内进行在线反应，因此对 反应物需求量很少，且所有反应物都在线参与反应，该方法尤其适用于来源困难，价格昂贵 的靶标反应物；
[0017] 2.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，在 所述电泳过程中，由于两种反应物是在毛细管中在线反应,省去孵育步骤，避免繁琐操作；
[0018] 3.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，在 所述电泳过程中，在电泳缓冲液中分别加入两种反应物之一形成背景缓冲液，可抑制复合 物在毛细管中在线反应时解离，进而促进较弱复合物的形成；通过增加反应物的进样量可 使复合物量增大，有益于收集得到较多的复合物；
[0019] 4.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，在 所述电泳分离过程中，迁移速率快、慢的反应物以及反应形成的复合物根据其荷质比大小， 依次通过毛细管末端的检测窗口，根据复合物的迁移时间，计算出复合物迁移至毛细管出 口端的时间，进而可在毛细管出口端收集复合物；
[0020] 5.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，由 于所述反应物在线进行反应，分离速度快，操作简便，有益于两种反应物的反应条件优化。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为实施例1中毛细管区带电泳DAD检测器检测结果图。
[0022] 图2为实施例2中毛细管区带电泳LIF检测器检测结果图。
[0023] 图3为实施例3中毛细管区带电泳LIF检测器检测结果图。
[0024] 图4为实施例4中毛细管区带电泳LIF检测器检测结果图。
[0025] 图5为实施例5中电泳缓冲液为Aptl5-FAM背景缓冲液时，毛细管区带电泳LIF 检测器检测结果图。
[0026] 图6为实施例5中电泳缓冲液为H-Thr背景缓冲液时，毛细管区带电泳LIF检测 器检测结果图。
[0027] 图7为实施例6中毛细管区带电泳LIF检测器检测结果图。
【具体实施方式】
[0028]为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出实施例。
[0029] 以下实施例1中，15碱基H-Thr适配体（Aptl5)序列：5' -GGT TGG TGT GGT TGG-3'，29 碱基 H-Thr 适配体（Apt29)序列：5'-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT_3'，以上适配体均购自生工生物工程（上海）有限公司；实施例2?7中，荧光标记15 碱基 H-Thr 适配体（Aptl5-FAM)序列：5'-FAM-GGT TGG TGT GGT TGG-3'，荧光标记 29 碱基 H-Thr 适配体（Apt29-FAM)序列：5'-FAM-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'， 所述适配体均购自生工生物工程（上海）有限公司；人凝血酶（H-Thr)购自Enzo Life Science 公司；80 荧光库：5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-(40N)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'， 购自生工生物工程（上海）有限公司。
[0030] 反应物在毛细管区带电泳在线反应所使用的毛细管为涂层毛细管，涂层毛细管购 自河北邯郸开发区奥泰克生物科技有限公司；毛细管在线反应采用Beckman P/ACE MDQ毛 细管电泳仪，在毛细管出口端配备LIF检测器，检测器检测条件为：激发波长488nm，发射波 长520nm ;所用涂层毛细管外包硅胶层，总长度为50. 2cm，有效长度为40cm，内径为75 μ m ; 电泳缓冲液是pH值为8· 7的硼酸硼砂溶液，通过将50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按 体积比为3:2混合得到。
[0031] 实施例1
[0032] 原始Aptl5储备液制备：将购买的Aptl5晶体状，经3000转/分钟离心5min，力口 入纯水配制成1. OX l(T4mol/L的原始Aptl5储各液。
[0033] 原始Apt29储备液制备：将购买的Apt29晶体状，经3000转/分钟离心5min，力口 入纯水配制成1. OX l(T4mol/L的原始Apt29储备液。
[0034] 原始H-Thr储备液制备：将购买的H-Thr晶体状，经3000转/分离心5min，加入 纯水配制成1. OX l〇_4mol/L的原始H-Thr储备液。
[0035] ⑴将原始Aptl5储备液用纯水稀释得到浓度为1· 〇X l〇_5m〇l/L的Aptl5样品溶 液，采用Agilent 7100毛细管电泳仪，经50mbar压力进样l〇s，以pH值为8. 7的硼酸硼砂 溶液为电泳缓冲液，在总长度48· 5cm，有效长度40cm，内径75 μ m的毛细管中进行毛细管区 带电泳，电泳分析时间为2〇min，分析电压为-15KV,分析温度为25°C ;将原始H-Thr储备液 用纯水稀释得到H-Thr样品溶液，将10 μ L浓度为1· Ο X l(T5m〇l/L的H-Thr样品溶液，采用 Agilent 7100毛细管电泳仪，经50mbar压力进样10s，以pH值为8. 7的硼酸硼砂溶液为电 泳缓冲液，在总长度48. 5cm，有效长度40cm，内径75 μ m的毛细管中进行毛细管区带电泳， 电泳分析时间为20min，分析电压为-15KV，分析温度为25°C，毛细管的出口端为正极，入口 端为负极，Aptl 5和H-Thr的DAD检测器检测结果如图1左图所示。
[0036] 图1左图下方谱线为Aptl5谱线，在4. 5min处产生信号峰；图1左图上方谱线为 H-Thr谱线，由于H-Thr对毛细管壁吸附性较强，所以在lOmin以后出现很宽的峰。由此可 见，在毛细管中迁移速率：Aptl 5>H-Thr。由于Aptl5-FAM和Aptl5在毛细管中迁移速率基 本一致，所以在毛细管中迁移速率：Aptl5-FAM>H-Thr。
[0037] (2)将步骤（1)中的Aptl5换成Apt29,其余同步骤⑴，Apt29和H-Thr的DAD检 测器检测结果如图1右图所示。
[0038] 图1右图下方谱线为Apt29谱线，在6min处产生信号峰；图1右图上方谱线为 H-Thr谱线，由于H-Thr对毛细管壁吸附性较强，所以在lOmin以后出现很宽的峰。由此可 见，在毛细管中迁移速率：Apt29>H-Thr。由于Apt29-FAM和Apt29在毛细管中迁移速率基 本一致，所以在毛细管中迁移速率：Apt29-FAM>H-Thr。
[0039] 实施例2
[0040] 原始Apt29-FAM储备液制备：将购买的Apt29-FAM晶体状，经3000转/分钟离心 5min,加入纯水配制成1. OX l(T4mol/L的原始Apt29-FAM储备液；将原始Apt29-FAM储备液 用纯水稀释得到1. 〇X l(T6mol/L的Apt29-FAM样品溶液；将实施例1制得的原始H-Thr储 备液用纯水稀释得到1. 〇X l(T6mol/L的H-Thr样品溶液。
[0041] (1)在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行毛细管区带电泳，分别取H-Thr 样品溶液、电泳缓冲液和Apt29-FAM样品溶液，运行时首先进样迁移速率慢的H-Thr样品 溶液，然后进样电泳缓冲液，最后进样迁移速率快的Apt29-FAM样品溶液，进样条件如下： H-Thr 进样：0. 5psi，20s，电泳缓冲液进样：0. 5psi，10s，Apt29_FAM进样：0· 5psi，10s，电泳 分析时间为20min，分析电压为-15KV，分析温度为25°C，在毛细管区带电泳过程中所述两 种样品溶液在毛细管中进行混合形成复合物完成电泳，毛细管的出口端为正极，入口端为 负极，进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图2上方谱线所示。
[0042] (2)进样时只进样Apt29-FAM，其余步骤同步骤（1)，LIF检测器检测结果如图2下 方谱线所示。
[0043] 由图2下方谱线可知，在6min处产生信号峰，所述信号峰为Apt29-FAM信号峰。 由图2上方谱线可知，在6. 5min处产生信号峰，比下方谱线Apt29-FAM信号峰出峰时间慢 0. 5min，是由于电泳过程中Apt29-FAM要穿过一段H-Thr,因此其迁移速率减慢，所以确定 6. 5min信号峰为Apt29-FAM信号峰；与下方谱线对比，上方谱线中Apt29_FAM信号峰峰高 降低，并在11. 5min产生了新的信号峰，是由于部分Apt29-FAM与H-Thr反应生成H-Thr和 Apt29-FAM复合物，所以初步确定11. 5min信号峰为H-Thr和Apt29_FAM复合物峰。
【权利要求】
1. 一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，其特征在于：所述方 法步骤如下： 对反应物进行毛细管区带电泳，进样顺序先后依次为：毛细管中迁移速率慢的反应物， 电泳缓冲溶液，毛细管中迁移速率快的反应物，使迁移速率不同的反应物在所述电泳过程 的毛细管中实现在线反应混和后完成电泳，分离收集电泳产物，对所述产物进行毛细管电 泳-激光诱导荧光检测；所述反应物为蛋白质和ssDNA。
2. 根据权利要求1所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，其特征在于：在电泳缓冲液中加入反应物之一。
3. 根据权利要求1所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，其特征在于：所述反应物在毛细管中的迁移速率通过分别对反应物进行毛细管区带电 泳，根据所述反应物的出峰时间确定，先出峰的反应物迁移速率快。
4. 根据权利要求1所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，其特征在于：所述反应物通过以下方法制成样品溶液进样：将蛋白质溶于纯水中制成 原始蛋白质储备液，将ssDNA溶于纯水中制备成原始ssDNA储备液；将原始蛋白质储备液稀 释后得到蛋白质样品溶液，将原始ssDNA储备液稀释后得到ssDNA样品溶液。
5. 根据权利要求1所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，其特征在于：所述毛细管为涂层毛细管。
6. 根据权利要求1、2、4或5所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合 物的方法，其特征在于：使用Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪进行所述电泳，毛细管总长 度为50. 2cm,有效长度为40cm,内径为75 μ m,电泳缓冲液为硼酸硼砂溶液，进样条件为：蛋 白质进样：〇· 5psi，20s，电泳缓冲液进样：0· 5psi，10s，ssDNA进样：0· 5psi，10s，分析条件 为：分析温度为25°C，分析电压为_15kV，毛细管电泳-激光诱导荧光检测条件为：激发波 长488nm，发射波长520nm。
7. 根据权利要求3所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，其特征在于：所述毛细管为涂层毛细管。
8. 根据权利要求3或7所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的 方法，其特征在于：使用Agilent 7100毛细管电泳仪进行所述电泳，涂层毛细管总长度为 48. 5cm，有效长度为40cm，内径为75 μ m，电泳缓冲液为硼酸硼砂溶液，进样条件为：50mbar 下，进样3s?25s，分析条件为：分析温度25°C，分析电压-15kV ;使用UV 195nm进行检测。
9. 根据权利要求6所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，其特征在于：所述硼酸硼砂溶液的pH值为8. 7。
10. 根据权利要求8所述的一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，其特征在于：所述硼酸硼砂溶液的pH值为8. 7。
【文档编号】G01N27/447GK104297325SQ201410512777
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】屈锋, 胡猷浩, 吴景刚, 赵新颖 申请人:北京理工大学