长座线虫草在制备保肝药物和保健品中的应用的制作方法

长座线虫草在制备保肝药物和保健品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了长座线虫草及其提取物的制备方法及应用。其长座线虫草提取物从麦角菌科线虫草属长座线虫草中提取，提取物中各组分重量占比如下，甾醇含量在5％～25％，环肽含量在2％～10％，核苷含量在2％～10％，多糖含量在5％～25％，海藻糖含量在0.5％～5％，麦芽糖含量在1％～5％，氨基酸含量在5％～25％，其他成分含量在10％～80％。其采用乙醇水溶液提取，浓缩，干燥，制得。长座线虫草全草及其提取物可用于制备保肝药物或保健品。
【专利说明】长座线虫草在制备保肝药物和保健品中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种虫草属真菌长座线虫草全草及其提取物、制备方法及应用，还涉 及长座线虫草提取物的检测方法。

【背景技术】
[0002] 肝损伤是人类最常见的疾病之一，可由多种因素引起，主要包括化学性肝损伤、药 物性肝损伤、酒精性肝损伤、免疫性肝损伤等。其中，免疫性肝损伤通常由生物性因素等引 起，常见的原因为病毒感染，如临床上乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)等病毒的 感染，其重要的特征是肝组织内大量的炎症细胞浸润，产生免疫/炎症应答，导致免疫反应 为基础的肝损伤，可进一步发展为肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。现代医学认为，免疫性 肝损伤的发病机制与免疫应答和免疫调节紊乱有关。T细胞是机体免疫系统内最重要的一 大细胞亚群，当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，就可导致机体免疫紊乱并发 生一系列的病理变化。目前认为肝炎患者的免疫系统都处于超反应性的状态，对免疫性肝 损伤的治疗措施主要有抗病毒治疗、免疫调节治疗和一般治疗（恢复肝功能、抗肝纤维化 等）。常用的药物主要集中在干扰素、胸腺素、Th细胞因子、疫苗等的应用，但对多数患者副 作用大，容易引起病毒耐药株的产生，停药后易复发，且疗程长、治疗费用高。中医药以其多 种有效成分整体协同作用，在预防和治疗肝脏疾病具有一定优势，能有效降低耐药性。真菌 在与寄主长期协同进化中，形成了独特的免疫调节机制，日渐成为免疫性疾病治疗药物研 究的热点。
[0003] 虫草是寄生于昆虫体上的真菌与其寄主昆虫形成的虫菌复合体，隶属于子囊 菌门（Ascomycota)，核菌纲（Pyrenomycetes)，麦角菌科（Clavicipitaceae)，线虫草属 (Ophiocordyceps)。由于虫生真菌和昆虫的长期协同进化，使得虫生真菌不仅是重要的生 物防治材料，同时还是宝贵的药用资源。研究表明，虫草属真菌含有虫草素、虫草酸、多糖、 腺苷、留醇、多肽等多种有效成分，在降血脂，保护心、脑组织，镇静催眠，增强免疫力，抗炎、 抗癌、抗菌、抗衰老等方面都有良好功效。近年来，随着人们对虫草的滋补保健作用和药用 价值认识的提高，而野生冬虫夏草资源有限，价格高昂，一些虫草的人工子实体及相关无性 型真菌陆续被开发。
[0004] 本发明涉及的虫草为长座线虫草（Ophiocordyceps longissima (Kobayasi) Sung)，长座线虫草是寄生于同翅目蝉若虫上的一种重要的虫生真菌，1963年首次在日本被 发现并命名。李春如等于1999年在国内首次采集到该虫草，并鉴定其无性型为长座被毛孢 (Hirsutella longissima)。目前对长座线虫草保肝活性提取物及活性成分的研究尚未见 报道。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种长座线虫草及其提取物在制备保肝药物及保健品中的 应用，其质量可控，安全性高，药效明确，而且长座线虫草子实体可人工培养，资源丰富、价 廉，可制成多种剂型。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 本发明提供一种长座线虫草提取物，其从麦角菌科线虫草属长座线虫草 (Ophiocordyceps Iongissima(Kobayasi) Sung)中提取，其活性成分为甾醇、环肽、核苷、多 糖等。按重量比计，提取物中留醇含量在5 %?15 %，环肽含量在2 %?10 %，核苷含量在 2%?10%，多糖含量在5%?15%，海藻糖含量在0.5%?5%，麦芽糖含量在1%?5%， 氨基酸含量在5%?25%，其他成分含量在10%?80%。
[0008] 本发明还提供了长座线虫草提取物的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 将长座线虫草子实体或菌丝体用乙醇水溶液提取，浓缩提取液得浓缩液。将浓缩 液进行干燥得提取物，对提取物中留醇、环肽、核苷及多糖进行检测，提取物中留醇含量在 5%?25%，环肽含量在2%?10%，核苷含量在2%?10%，多糖含量在5%?25%，海藻 糖含量在〇. 5 %?5 %，麦芽糖含量在1 %?5 %，氨基酸含量在5 %?25 %。其他成分含量 在 10%?80%。
[0010] 乙醇水溶液可以是纯水溶液，即含乙醇〇%，也可以是高浓度的乙醇水溶液，如含 乙醇95%。
[0011] 提取次数可以是1?4次，为了节约药材或者根据乙醇水溶液的量，也可以提取更 多次。
[0012] 乙醇水溶液的用量可以每次为药材量的5?10倍，根据提取次数和实际情况，也 可以用量更少或者更多。
[0013] 提取方式可以是煎煮法、浸渍法、回流法，也可以附加其他工艺，如超声、微波辅助 提取。
[0014] 提取温度可以是室温?100°C，根据提取方式和实际情况选择。
[0015] 提取时间可以每次为1?6h，根据提取方式及提取温度，也可以增加提取时间。
[0016] 将一次或多次提取得到的提取液进行浓缩得浓缩液，浓缩方式优选减压浓缩成浸 骨，温度可以是40?60°C。
[0017] 干燥方式可以是冷冻干燥、减压干燥或者喷雾干燥。减压干燥或者喷雾干燥温度 可以是40?60°C。
[0018] 长座线虫草全草及其提取物可以通过抑制自身免疫性损伤来发挥保肝作用。上述 提取物加入相应辅料可制成各种制剂，包括：胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液、丸剂、散剂、混 悬剂、滴丸、冻干粉、缓释剂、控释剂、靶向制剂等。
[0019] 本发明具有如下优点：
[0020] (1)首次证实长座线虫草及其提取物具有保肝效果及免疫抑制活性，并鉴定其提 取物主要活性成分为留醇、环肽、核苷和多糖。
[0021] (2)长座线虫草与冬虫夏草均属于线虫草属真菌，由于野生冬虫夏草资源有限且 价格高昂，该虫草具有成为一种野生冬虫夏草替代品的潜力。
[0022] (3)长座线虫草全草及提取物能明显降低ConA诱导免疫性肝损伤小鼠的血清中 转氨酶ALT、AST含量，降低血清总胆红素，升高血清白蛋白含量。病理形态学检查发现用药 组肝脏颜色暗红，质地较光滑。镜下观察肝小叶结构趋于正常，炎性细胞浸润减轻，细胞病 变程度减轻。同时，长座线虫草提取物可以抑制ConA刺激活化的小鼠脾淋巴细胞增殖，且 随着剂量的增加效果越明显。
[0023] (4)本发明还提供了长座线虫草提取物的检测方法。

【专利附图】

【附图说明】
[0024] 图1是ConA诱导的肝损伤小鼠肝组织形态学改变图（HEX200)。

【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0026] 实施例1 :长座线虫草提取物的制备
[0027] 将长座线虫草（安徽农业大学李春如教授提供并鉴定）子实体于粉碎机上粉碎， 称取I. 3kg粉末，用5倍药材质量的95%乙醇浸泡过夜，60°C热提取4次，每次4小时，趁 热过滤。合并滤液，减压回收乙醇得提取物浸膏，45°C真空干燥得长座线虫草提取物189g。 按重量比计，各组分如下，留醇含量在12. 3%，环肽含量在3. 6%，核苷含量在2. 5%，多糖 含量在5. 6%，甘露醇（占12.9% )、海藻糖（占0.5% )、葡萄糖（占3.6% )、麦芽糖（占 1% )、氨基酸（占10% )，其他成分含量在48%。
[0028] 实施例2 :长座线虫草提取物的制备
[0029] 将长座线虫草（安徽农业大学李春如教授提供并鉴定）子实体于粉碎机上粉碎， 称取I. 3kg粉末，用10倍药材质量的水浸泡过夜，60°C热提取4次，每次4小时，趁热过滤。 合并滤液，减压浓缩得提取物浸膏，45°C真空干燥得长座线虫草提取物260g。按重量比计， 各组分如下，留醇含量在5 %，环肽含量在2 %，核苷含量在4%，多糖含量在15 %，甘露醇 (占25% )、海藻糖（占2% )、葡萄糖（占12% )、麦芽糖（占4% )、氨基酸（占21% )，其 他成分含量在10%。
[0030] 实施例3 :长座线虫草提取物的制备
[0031] 将长座线虫草（安徽农业大学李春如教授提供并鉴定）子实体于粉碎机上粉碎， 称取I. 3kg粉末，用8倍药材质量的60%乙醇浸泡过夜，回流提取3次，每次3小时，趁热过 滤，合并滤液，减压回收乙醇得提取物浸膏，45°C真空干燥得长座线虫草提取物310g。按重 量比计，各组分如下，留醇含量在17%，环肽含量在6%，核苷含量在7%，多糖含量在12%, 甘露醇（占15% )、海藻糖（占1% )、葡萄糖（占8% )、麦芽糖（占3% )、氨基酸（占 14% )，其他成分含量在17%。
[0032] 实施例4 :长座线虫草提取物各组分的测定方法
[0033] 4. 1甾醇含量测定（比色法）
[0034] 精密称定干燥的麦角甾醇对照品约10mg，加无水乙醇溶解并定容至10ml，即得对 照品溶液；称取长座线虫草提取物35mg，无水乙醇溶解并定容至50ml，即得长座线虫草提 取物供试品溶液。
[0035] 另外，分别精密移取0. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. Oml对照品溶液，置IOml具塞刻度 试管中，分别加入无水乙醇使体积为5ml，再沿管壁缓慢地向各试管中加入5ml磷硫铁显 色剂，摇匀，室温下冷却30ml即得对照品或供试品的显色溶液，以无水乙醇同法作空白。 530nm测定吸光度，绘制标准曲线。精密吸取供试品溶液5ml，加入5ml显色剂，同法测定吸 光度，通过标准曲线计算含量。以对照品浓度为横坐标，相应的吸光度值为纵坐标，绘制出 的标准曲线。
[0036] 含量测定结果表明实施例1提取物中甾醇含量为12. 3%，实施例2提取物中甾醇 含量约为5.0%，实施例3提取物中甾醇含量约为21.0%。
[0037] 4. 2环肽含量测定（比色法）
[0038] 准确称取0. 2g酪氨酸，用蒸馈水溶解并定容至1000ml，配成0. 2mg/ml的对照品溶 液，于〇°C下保存备用；
[0039] 称取2. Og讳三酮，0. 02g抗坏血酸，用无水乙醇溶解并定容至IOOml棕色试剂瓶， 低温保存。称取I. Og碘酸钾溶于蒸馏水中并稀释至300ml，再加入200mL 95%乙醇溶液， 混匀备用。
[0040] 精密称取lOOmg，置于烧瓶中，加入95%的乙醇50ml，90°C水浴回流3次，每次3h 合并提取液减压浓缩。用等体积的醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液减压浓缩。向浓缩液中 加入I. 2mol/L的盐酸6ml，90°C水浴加热2h，然后转移到IOml量瓶中，用蒸馏水定容至刻 度。醇提取物乙酸乙酯相加入茚三酮显色剂后反应呈阴性，说明用该法处理的供试品不会 受到样品中所含氨基酸、蛋白质的影响。
[0041] 配制系列对照品溶液，以不加对照品为空白对照，与茚三酮显色后，于576nm处测 吸光度，绘制标准曲线。
[0042] 含量测定结果表明实施例1提取物中环肽含量为3. 6% (用酪氨酸表示），实施例 2提取物中环肽含量约为2. 0% (用酪氨酸表示），实施例3提取物中环肽含量约为7. 0% (用酪氨酸表示）。
[0043] 4. 3多糖含量测定（比色法）
[0044] 精密称取IOmg长座线虫草提取物干燥品，蒸馏水溶解并定容至10ml，此为长座线 虫草提取物供试品溶液。
[0045] 另外，精确称取干燥的标准品葡萄糖5. 18mg，置于50ml容量瓶中，蒸馏水定容至 刻度，此为葡萄糖标准溶液；分别取0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 40ml葡萄糖标准溶液于 具塞试管中，加蒸馏水使体积为2ml再加苯酚试液Iml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5ml摇匀后放 置5min沸水浴加热15min，取出冷却至室温，以蒸馈水2ml加苯酚和硫酸做对照，于490nm 测吸光度，绘制标曲。取供试品溶液lml，加蒸馏水使体积为2ml，同法测定吸光度，通过标 准曲线计算含量。
[0046] 测定结果显示，实施例1提取物中多糖含量约为5. 6%，实施例2提取物中多糖含 量约为9.0%，实施例3提取物中多糖含量约为22.0%。
[0047] 4. 4核苷含量测定（HPLC法）
[0048] TSKgel 0DS-100V 色谱柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m);流动相 A 为 0· Olmol/L 的 KH2PO4 水溶液，B为甲醇，检测波长260nm，柱温20°C，流速lml/min进样量20 μ 1，梯度洗脱，0? 12min，B 0%?2% ;12 ?23min，B 2%?5% ;23 ?35min，B 5%?20% ;35 ?45min，B 20% ;45 ?55min，B 20%?0% ;55 ?60min，B 0%。
[0049] 分别精密称取腺嘌呤I. 95mg，鸟嘌呤I. 99mg，次黄嘌呤2. 19mg，尿嘧啶2. Olmg，胞 嘧啶I. 97mg，胸腺嘧啶I. 96mg，腺苷2. 02mg，鸟苷2. 06mg，胞苷2. 00mg，尿苷2. 06mg，β -胸 苷2. 04mg，肌苷2. 15mg，和虫草素2. 09mg，置IOml容量瓶中，分别用0· 01mol/L的KH2PO4定 容至刻度（鸟嘌呤除外），鸟嘌呤用〇. lmol/L的HCl定容至刻度，制得浓度为0. 2mg/ml的 对照品溶液。分别精密吸取13种对照品溶液lml，充分混匀，即得混合对照品溶液。
[0050] 精密称取IOOmg长座线虫草提取物干燥品，蒸馏水溶解并定容至50ml，吸取Iml稀 释至IOml，0. 45 μ m微孔滤膜过滤，取续滤液即得供长座线虫草提取物试品溶液。
[0051] 将混合对照品溶液用流动相逐级稀释成1，2, 4,8,16, 20,40,100倍浓度的混合对 照品溶液，分别进样20 μ 1，以对照品浓度（μ g/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲 线；供试品溶液以相同色谱条件下进样20 μ 1，以13种核苷和碱基的峰面积计算含量。
[0052] HPLC测定结果显示，13种核苷和碱基出峰顺序为胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌 呤、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、β_胸苷、腺苷和虫草素，通过保留时间来 确定样品中化合物种类，以13种核苷和碱基作为外标，计算结果显示，实施例1提取物中核 苷含量约为2. 5%，实施例2提取物中核苷含量约为4. 0%。
[0053] 4. 5甘露醇含量测定（比色法）
[0054] 精确称取待测样品各IOOmg分别置于IOOmL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。 100°C水浴2h，过滤，用蒸馏水洗涤残渣；将滤液和洗液合并，并定容至200ml，备用。
[0055] 精密称取干燥至恒重的甘露醇标准品50mg，加蒸馈水50ml，配制成lmg/L的甘露 醇溶液。然后分别稀释配制成质量浓度为1〇、20、30、40、5〇 μ8/πι1的甘露醇标准品溶液。
[0056] 精密量取待测样品溶液100 μ 1，加入IOml刻度试管中，加 Iml高碘酸钾溶液，混 匀，室温放置lOmin，加入2ml 0. 1% L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸钾，混合后加4ml 新配制的Nash试剂，于53°C水浴加热15min使其显色；每个样品三个重复。之后迅速冷却 至室温，用全波长酶标仪在412nm处，测定吸光度。以蒸馏水代替样品溶液，用同样的方法 操作作为对照，测定其吸光度。
[0057] 测定结果显示，实施例1提取物中甘露醇含量约为12. 9%，实施例2提取物中甘露 醇含量为25.0%。
[0058] 4. 6葡萄糖、麦芽糖、海藻糖的含量测定（HPLC法）
[0059] 色谱条件为：Inertsil NH2柱（4. 6mmX250mm)，流动相为：乙腈：水=3:1，流速 lml/min，柱温40°C,示差折光检测器检测,进样量10μ 1。
[0060] 分别精确称取烘干至恒重的葡萄糖、麦芽糖、海藻糖标准品各50mg，置于IOmL容 量瓶中，加超纯水定容作储备液。将储备液稀释至不同浓度，进样分析，根据峰面积和三种 糖含量绘制标准曲线。
[0061] 分别精密称取样品lOOmg，加入蒸馏水100ml，沸水浴提取2h后定容到100ml，分 别取Iml溶液于12000r/min条件下离心lOmin，取上清液，再以0. 22μπι滤膜过滤，进样检 测。
[0062] 计算结果显示，实施例1提取物中葡萄糖、麦芽糖、海藻糖含量分别为3. 6%、1%、 0. 5%，实施例2提取物中葡萄糖、麦芽糖、海藻糖含量分别为12. 0%、4%、2%。
[0063] 4. 7氨基酸含量的测定
[0064] 精密称取2mg待测样品置安瓿瓶中，各加2ml 6mol/L盐酸，熔封，IKTC水解24h， 真空干燥。加2mL 0. 02mol/L盐酸，用0. 22 μ m微孔滤膜过滤，备用。利用L-8900型氨基 酸分析仪分析，进样量20 μ 1。
[0065] 测定结果显示，实施例1提取物中氨基酸含量约为10%，实施例2提取物中氨基酸 含量约为21%。
[0066] 4· 8其他组分
[0067] 未鉴定的组分统称为其他组分。
[0068] 实施例5 :长座线虫草抗ConA诱导的免疫性肝损伤活性测试 [0069] ICR小鼠，SPF级，体重18?22g，安徽医科大学实验动物中心提供。
[0070] 将80只小鼠随机分为8组，每组10只，分别为正常组、模型组、阳性对照组（地 塞米松20mg/kg)，给药组为长座线虫草提取物组（实施例1制得，按给药剂量分为100、 50、25mg/kg的高、中、低三组）、长座线虫草提取物组（实施例2制得，100mg/kg)及全草组 (400mg/kg)，所用药物均以0. 3%羧甲基纤维素钠生理盐水溶解或混悬。各组老鼠每天按 0. ImVlOg分别灌胃给予相应药物，空白组和模型组分别给予等体积的0.3%羧甲基纤维 素钠生理盐水,连续给小鼠灌胃l〇d。
[0071] 末次给药后8h，正常组小鼠尾静脉注射PBS溶液0. 3ml，其他各组注射0. 3ml刀豆 蛋白A ConA(20mg/kg)，尾静脉注射造模。造模后禁食不禁饮12h，称重，自小鼠后眼眶静脉 丛采血，3000r/min离心IOmin制备血清，做血清相关生化指标检测。颈椎脱曰处死小鼠，解 剖摘取肝脏，用预冷的生理盐水制成10%肝匀浆，离心取上清液置于4°C保存备用。另切取 每组肝相同部位组织块5 X 5 X 2mm，置于10 %福尔马林中固定24h后做病理学检测。
[0072] 表1长座线虫草对肝损伤小鼠肝脾指数、血清中ALT、AST的影响％，[ ±s，η = 8)
[0073]

【权利要求】
1. 长座线虫草在制备保肝药物和保健品中的应用。
2. 长座线虫草提取物在制备保肝药物和保健品中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述长座线虫草提取物从麦角菌科线虫 草属长座线虫草中提取，提取物含有按重量比计的如下组分，留醇5%?25%，环肽2%? 10%，核苷2%?10%，多糖5%?25%。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述长座线虫草提取物还含有按重量比计 的甘露醇5%?25%，海藻糖0? 5%?5%，麦芽糖1 %?5%，氨基酸5%?25%。
5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述长座线虫草提取物按如下方法制备， 将长座线虫草子实体或菌丝体用乙醇水溶液提取，浓缩，干燥，制得提取物。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述长座线虫草提取物按如下方法制备， 用长座线虫草子实体或菌丝体质量5-10倍量的0-95%乙醇，室温-100°C提取1-4次，每次 1-6小时，趁热过滤，合并滤液，减压回收乙醇得提取物浸膏，干燥，制得提取物；其中提取 方式选自煎煮法、浸渍法、回流法、超声提取、微波提取；干燥方式选自冷冻干燥、减压干燥 或者喷雾干燥。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述长座线虫草提取物按如下方法制备， 将长座线虫草子实体粉碎，用5倍药材质量的95%乙醇，60°C热提取4次，每次4小时，趁热 过滤，合并滤液，减压回收乙醇得提取物浸膏。
8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述长座线虫草提取物按如下方法制备， 将长座线虫草子实体粉碎，用10倍药材质量的水提取，60°C热提取4次，每次4小时，趁热 过滤，合并滤液，减压浓缩得提取物浸膏，45°C真空干燥得长座线虫草提取物。
9. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述药物和保健品的剂型选自胶囊剂、 片剂、颗粒剂、口服液、丸剂、散剂、混悬剂、滴丸、冻干粉、缓释剂、控释剂、靶向制剂。
10. 长座线虫草提取物的检测方法：包括①留醇含量测定；②环肽含量测定；③多糖含 量测定；④核苷含量测定；⑤甘露醇含量测定；⑥麦芽糖、海藻糖的含量测定；⑦氨基酸含 量的测定。
11. 根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于包括①比色法测定甾醇含量；②比 色法测定环肽含量；③比色法测定多糖含量；④HPLC法核苷含量测定；⑤甘露醇含量测定； ⑥麦芽糖、海藻糖的含量测定；⑦氨基酸含量的测定。
12. 根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于包括 ①甾醇含量测定 精密称定干燥的麦角甾醇对照品约l〇mg，加无水乙醇溶解并定容至10ml，即得对照品 溶液；称取长座线虫草提取物35mg，无水乙醇溶解并定容至50ml，即得长座线虫草提取物 供试品溶液； 另外，分别精密移取〇. l、〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0ml对照品溶液，置10ml具塞刻度试管 中，分别加入无水乙醇使体积为5ml，再沿管壁缓慢地向各试管中加入5ml磷硫铁显色剂， 摇匀，室温下冷却30ml即得对照品或供试品的显色溶液，以无水乙醇同法作空白；530nm测 定吸光度，绘制标准曲线；精密吸取供试品溶液5ml，加入5ml显色剂，同法测定吸光度，通 过标准曲线计算含量；以对照品浓度为横坐标，相应的吸光度值为纵坐标，绘制出的标准曲 线. ② 环肽含量测定 准确称取0. 2g酪氨酸，用蒸馈水溶解并定容至1000ml，配成0. 2mg/ml的对照品溶液， 于0°C下保存备用；称取2. 0g茚三酮，0. 02g抗坏血酸，用无水乙醇溶解并定容至100ml棕 色试剂瓶，低温保存；称取1. 〇g碘酸钾溶于蒸馏水中并稀释至300ml，再加入200mL 95% 乙醇溶液，混匀备用；精密称取l〇〇mg，置于烧瓶中，加入95%的乙醇50ml，90°C水浴回流3 次，每次3h合并提取液减压浓缩；用等体积的醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液减压浓缩；向 浓缩液中加入1. 2mol/L的盐酸6ml，90°C水浴加热2h，然后转移到10ml量瓶中，用蒸馏水 定容至刻度； 配制系列对照品溶液，以不加对照品为空白对照，与茚三酮显色后，于576nm处测吸光 度，绘制标准曲线； ③ 多糖含量测定 精密称取l〇mg长座线虫草提取物干燥品，蒸馏水溶解并定容至10ml，此为长座线虫草 提取物供试品溶液； 另外，精确称取干燥的标准品葡萄糖5. 18mg，置于50ml容量瓶中，蒸馏水定容至刻度， 此为葡萄糖标准溶液；分别取〇. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 40ml葡萄糖标准溶液于具塞 试管中，加蒸馈水使体积为2ml再加苯酚试液lml，摇勻，迅速滴加浓硫酸5ml摇勻后放置 5min沸水浴加热15min，取出冷却至室温，以蒸馈水2ml加苯酚和硫酸做对照，于490nm测 吸光度，绘制标曲；取供试品溶液lml，加蒸馏水使体积为2ml，同法测定吸光度，通过标准 曲线计算含量； ④ 核苷含量测定 TSKgel 0DS-100V 色谱柱（4.6_X250mm，5iim);流动相 A 为 0.01mol/L 的腿#04水溶 液，B为甲醇，检测波长260nm，柱温20°C，流速lml/min进样量20 ill，梯度洗脱，0?12min， B 0%?2% ;12 ?23min，B 2%?5% ;23 ?35min，B 5%?20% ;35 ?45min，B 20% ; 45 ?55min，B 20%?0% ;55 ?60min，B 0% ; 分别精密称取腺嘌呤1. 95mg，鸟嘌呤1. 99mg，次黄嘌呤2. 19mg，尿嘧啶2. Olmg，胞嘧啶 1. 97mg，胸腺嘧啶 1. 96mg，腺苷 2. 02mg，鸟苷 2. 06mg，胞苷 2. 00mg，尿苷 2. 06mg，0 -胸苷 2. 04mg，肌苷2. 15mg，和虫草素2. 09mg，置10ml容量瓶中，分别用0? 01mol/L的KH2P04定容 至刻度（鸟嘌呤除外），鸟嘌呤用〇. lmol/L的HC1定容至刻度，制得浓度为0. 2mg/ml的对 照品溶液；分别精密吸取13种对照品溶液lml，充分混匀，即得混合对照品溶液；精密称取 100mg长座线虫草提取物干燥品，蒸馈水溶解并定容至50ml，吸取lml稀释至10ml，0. 45 y m 微孔滤膜过滤，取续滤液即得供长座线虫草提取物试品溶液； 将混合对照品溶液用流动相逐级稀释成1，2,4,8,16, 20,40,100倍浓度的混合对照品 溶液，分别进样20 yl，以对照品浓度g/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线； 供试品溶液以相同色谱条件下进样20 yl，以13种核苷和碱基的峰面积计算含量； ⑤ 甘露醇含量测定 精确称取待测样品各l〇〇mg分别置于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度；100°C水 浴2h，过滤，用蒸馏水洗涤残渣；将滤液和洗液合并，并定容至200ml，备用； 精密称取干燥至恒重的甘露醇标准品50mg，加蒸馈水50ml，配制成lmg/L的甘露醇溶 液；然后分别稀释配制成质量浓度为l〇、20、30、40、50ii g/ml的甘露醇标准品溶液； 精密量取待测样品溶液100 y 1，加入l〇ml刻度试管中，加 lml高碘酸钾溶液，混匀，室 温放置lOmin，加入2ml 0. 1% L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸钾，混合后加4ml新配制 的Nash试剂，于53°C水浴加热15min使其显色；每个样品三个重复；之后迅速冷却至室温， 用全波长酶标仪在412nm处，测定吸光度；以蒸馏水代替样品溶液，用同样的方法操作作为 对照，测定其吸光度； ⑥ 麦芽糖、海藻糖的含量测定 色谱条件为：Inertsil NH2柱（4. 6_X 250mm)，流动相为：乙腈：水=3:1，流速lml/ min，柱温40°C，示差折光检测器检测，进样量10 yl ;分别精确称取烘干至恒重的麦芽糖、 海藻糖标准品各50mg，置于10mL容量瓶中，加超纯水定容作储备液；将储备液稀释至不同 浓度，进样分析，根据峰面积和三种糖含量绘制标准曲线； 分别精密称取样品l〇〇mg，加入蒸馏水100ml，沸水浴提取2h后定容到100ml，分别取 lml溶液于12000r/min条件下离心lOmin，取上清液，再以0. 22iim滤膜过滤，进样检测； ⑦ 氨基酸含量的测定 精密称取2mg待测样品置安瓿瓶中，各加2ml 6mol/L盐酸，熔封，110°C水解24h，真空 干燥；加2mL 0. 02mol/L盐酸，用0. 22 ii m微孔滤膜过滤,备用；利用L-8900型氨基酸分析 仪分析，进样量20 yl。
【文档编号】G01N21/31GK104352531SQ201410527605
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】程文明, 李春如, 李俊, 王佳佳, 张勋, 吴昆
申请人:安徽医科大学