钙羧酸及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及磷酸化蛋白质荧光检测技术，具体地说是钙羧酸及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用。本发明还提供了应用钙羧酸进行磷酸化蛋白质荧光检测的方法，包括步骤：将蛋白质样品电泳后的染色；经2步脱色；检测。本发明具有专属性好、检测限低、操作简易、重现性稳定、染色效果好、线性关系好、可逆性好、兼容性好、使用安全环保、成本低等优点。
【专利说明】钙羧酸及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及磷酸化蛋白质荧光检测技术，具体地说涉及磷酸化蛋白质的一种新的 荧光染料。
【背景技术】
[0002] 在生命科学研究领域，离不开对生命的基本物质蛋白质和DNA的研究，也就离不 开对蛋白质的检测技术。尤其是最近几年，随着基因组学和蛋白质组学的飞速发展，使我们 对蛋白质的分离检测技术有了更高的要求。
[0003] 蛋白质的检测方法有很多，包括池度法、凯氏定氮法、吸光光度法、突光光度法，以 及新发展起来的共振瑞利散射法、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法等。荧光光度法是目 前研究最多、应用最广、操作较为简便、灵敏度较高的检测方法。
[0004] 蛋白质磷酸化修饰是最常见也是最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一，也是目前 蛋白质组学研究的热点之一，对于目前的研究尚且存在专属性检测方法的不足，磷酸化过 程基本上发生在酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸等氨基酸残基上。蛋白质的这一修饰与细胞的增 殖、分化、发育、凋亡等许多生命活动息息相关，据多年的研究证明，蛋白磷酸化与许多的临 床疾病有着复杂的关系。因此开发一种专属性强的检测方法成为了研究的突破点。
[0005] 现存的凝胶上磷酸化蛋白质检测方法包括Pro-QDiamond检测技术、westernblot 检测技术，以及经典的Stains-All检测技术等。其中Pro-QDiamond是目前特异性最强、 应用最广、操作较为简便、灵敏度较高的检测方法。
[0006] 本发明首次将钙羧酸及其衍生物应用于磷酸化蛋白质荧光检测，相比于其他检测 技术，具有检测限低，专属性强等众多优点，在蛋白质组学研究中将具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于建立一种钙羧酸及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应 用。
[0008] 本发明所述的钙羧酸相关化合物是指以钙羧酸为母核的钠盐、钾盐、盐酸盐、硫酸 盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐等。
[0009] 钙羧酸母核为：
[0010]
【权利要求】
1. 钙羧酸及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的钙羧酸衍生物包括该羧酸的钠盐、钾 盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐等。
3. -种磷酸化蛋白质荧光检测方法，其包括步骤： 1) 将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于荧光染色液染色10?40min，其中所 述染色液为含按摩尔浓度比10?50 yM的钙羧酸，按溶液体积比10?50 %的1，2-丙二 醇，以及按溶液体积比〇. 1?5%乙酸； 2) 将染色完毕的凝胶置于脱色液1中脱色10?30min，其中所述脱色液为含按溶液体 积比10?30%的甲醇，按摩尔浓度比50?200mM乙酸钠，Al3+的浓度按摩尔浓度比为30? 70uM ； 3) 将脱色完毕的凝胶置于脱色液2中脱色0. 5?5min，其中所述脱色液为含按溶液体 积比10?50%的乙醇，按溶液体积比5?20%的1，2-丙二醇； 4) 检测。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中染色的时间为25min。
5. 如权利要求2?4任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)染色液中钙羧酸的浓度 按摩尔浓度比为30 iiM，l，2-丙二醇的浓度按溶液体积比为20%，乙酸的浓度按溶液体积 比为0. 5%。
6. 如权利要求2?4任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)脱色液1中乙醇的浓度 按溶液体积比为30%，乙酸钠的浓度按摩尔浓度比为lOOmM，Al3+的浓度按摩尔浓度比为 40 u M〇
7. 如权利要求2?4任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)脱色时间为20min。
8. 如权利要求2?4任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)脱色液2中乙醇的浓度 按溶液体积比为30%，1，2-丙二醇的浓度按溶液体积比为10%。
9. 如权利要求2?4任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)脱色时间为lmin。
【文档编号】G01N21/64GK104483294SQ201410607921
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】朱忠欣, 刘志国, 朱鑫良, 沈珈谊, 周阿益, 丛维涛, 洪国赢, 金利泰 申请人:温州医科大学