一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途
一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于PdCuMWCNTs纳米粒子构建的电化学适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。本发明的电化学适配体传感器表现出优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选上的实际应用具有重要的意义。
【专利说明】一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明 涉及一种基于PdCuOMWCNTs纳米粒子构建的电化学适配体传感器、其制备方法，以及由该 方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
【背景技术】
[0002] 腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸， 参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许 多其它系统及组织均有生理作用。因此，建立一种简便快捷的腺苷的测定方法是十分必要 的。目前测定腺苷的方法主要有高效液相色谱法，电渗毛细管电泳法和流动注射法等，但是 这些方法在灵敏度、选择性、稳定性和可操作性方面存在一些局限性。
[0003] 核酸适配体具有易合成、稳定性好等优点，可方便地在其特定位置用氧化还原试 齐U、纳米粒子、荧光、酶或生物素分子等功能团加以标记，并可长期贮存和在常温下运输，所 以在分析领域中的应用受到了研究者特别的厚爱，作为一种新型的分子识别元件，它的出 现使抗原抗体的反应发生了革命性的变化，大大弥补了现有抗体的不足，也为传统免疫传 感器发展开辟了一条新的道路。因此近年来基于核酸适配体构建的电化学传感器的研究受 到了极大关注。
[0004] 石墨烯具有极好的结晶性和非凡的电子学、热力学和力学性能，因此是人们广泛 关注的焦点。在石墨烯的研究和应用中，为了充分发挥其优良性质，必须对石墨烯进行功能 化。也就是在保持石墨烯材料优势的基础上，进一步对材料进行性能改性和优化，合成了生 物相容性优异的金掺杂的石墨烯，从而达到更好固定修饰材料的目的。
[0005] 本发明将金掺杂的石墨烯和硫堇溶液滴涂到玻碳电极表面用于固定捕获探针， PdCuOMWCNTs用于固载腺苷适配体，利用腺苷和其适配体链的特异性识别制备了检测腺苷 的电化学适配体传感器。以硫堇（TH)作为电子媒介体，通过葡萄糖氧化酶（GO x)和辣根过 氧化物酶（HRP)双酶实现双重信号的放大。测试结果显示，上述方法制备的电化学适配体 传感器的灵敏度、选择性和稳定性高，基于上述发现，发明人完成了本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种电化学适配体传感器，所述电化学适配体传感器包 括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰 金掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCu@MWCNTs/HRP/GO x/腺苷适配体溶液、不同浓度的腺 苷。
[0007] 本发明的再一个目的在于提供一种电化学适配体传感器的制备方法，所述方法制 备的传感器灵敏度高、重现性好、操作简便。
[0008] 本发明的另一目的是提供所述电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。
[0010] 本发明的电化学适配体传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极 的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCuOMWCNTs/ HRP/G0x/腺苷适配体溶液、不同浓度的腺苷。所述工作电极与参比电极、对电极组成电化学 适配体传感器来检测腺苷。所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为钼丝电极。所述的捕 获探针为 5 ' -CCCAGGTTCTCT- (CH2) 6-NH2-3 '（SSDNAl)，腺苷适配体为 3 ' -SH-TGGAAGGAGGCG TTATGAGGGGGTCCAAGAGA-5' （SSDNA2)。
[0011] 本发明的电化学适配体传感器的制备方法包括以下步骤： a、 制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液； b、 制备电化学适配体传感器工作电极； c、 制作电化学适配体传感器工作曲线。
[0012] 其中，步骤a的制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液，具体包括以下步骤： ① 将PdCl2, CuSO4AH2O和L-谷氨酸混合于烧瓶中（质量之比为1:1. 6:4)，加入40 mL 乙二醇（EG)，然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% K0H/EG调整溶液pH大约为11，此过程溶 液由绿色变为深蓝色； ② 将纯净的多壁碳纳米管（与CuSO4 · 5H20的质量之比为3:2)加入到上述混合液中， 超声2 h，得到均匀的悬浮液； ③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL高压釜中，在160 °C下加热6 h，然后冷却至室 温，离心洗涤数次后，将固体于40 °C真空干燥8 h，即可得到PdCuOMWCNTs黑色固体粉末； ④ 分别配制I mg/mL的上述PdCu@MWCNTs、HRP和GOx溶液；用Tris-HCl配制5 mmol/ L SSDNA2;然后取等体积的SSDNA2 (5 mmol/L)，PdCu@MWCNTs (I mg/mL)，HRP(l mg/mL)和 G0X(1 mg/mL)混合后放在4 °C下震荡24 h，得到PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液。
[0013] 步骤b的制备电化学适配体传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤： ① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁； ② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后将金掺杂的石墨烯溶液滴到电极 上，室温晾干； ③ 将0. 5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面,室温瞭干； ④ 用Tris-HCl配制5 mmol/L SSDNAl，然后将其滴到电极表面，将电极在4 °C放置2 h ； ⑤ 将孵化好的PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液修饰到电极上，在4 °C放置4 h ； ⑥ 再滴上一系列不同浓度的腺苷溶液，在4 °C保存晾干，即得到电化学适配体传感器 的工作电极。 步骤c的制作电化学适配体传感器工作曲线，步骤如下： ① 将参比电极一饱和甘汞电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极正确连接 在电化学工作站上； ② 含有浓度为I mmol/L葡萄糖的pH 8.0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法 (SWV)检测工作电极的电流；根据电流响应的差值（不加腺苷溶液和加入腺苷溶液）与腺 苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
[0014] 本发明的另一方面提供上述方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用 途。
[0015] 本发明的有益成果： (1)本发明的发明人首次将PdCuOMWCNTs引入到腺苷的电化学适配体传感器的制备当 中。利用其优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器有更高的灵敏度和更宽 的检测范围。
[0016] (2)在本发明的制备方法中，以硫堇作为电子媒介体，通过加入双酶GO5^P HRP实 现双重信号的放大，进一步提高了传感器的灵敏度。
[0017] (3)该传感器集成了适配体和电化学传感器两方面的优势，既具有电化学传感器 的高灵敏度、快响应、简单操作、低成本，又具有适配体的高选择性和特异性。因此本发明的 电化学适配体传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体 传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选上的实际应用具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 下面结合【专利附图】
【附图说明】和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
[0019] 图1为本发明的电极层层修饰在5 mmol/L铁氰化钾溶液中的循环伏安图。
[0020] 图中标记：a_裸玻碳电极的循环伏安图；b_修饰金掺杂的石墨烯和硫堇溶液之后 的循环伏安图；C-修饰捕获探针SSDNAl之后的循环伏安图；d-修饰PdCu@MWCNTs/HRP/GO x/ 腺苷适配体溶液之后的循环伏安图；e-修饰腺苷后的电化学适配体传感器的循环伏安图。
[0021] 从图1中可以看出，与裸玻碳电极的循环伏安图（图la)相比，当电极表面修饰上 金掺杂的石墨烯和硫堇溶液后，氧化峰电流值明显增加（图Ib)，说明金掺杂的石墨烯和硫 堇具有很好的电子传输能力；当电极表面继续修饰上SSDNAl之后（图Ic)，峰电流明显降 低，说明SSDNAl阻碍了电子的传递；当PdCu@MWCNTs/HRP/GO x/腺苷适配体溶液修饰到电极 的表面时，峰电流继续减小（图Id)，这是因为腺苷适配体SSDNA2的存在阻碍了电子的传 递。当200 nmol/L的腺苷修饰到电极上时，峰电流增大（图le)，这是由于腺苷与其适配体 链的特异性结合使腺苷适配体从电极上脱落，从而导致电子传递能力增强。由此说明电极 的层层修饰是成功的。
【具体实施方式】
[0022] 本发明使用的SSDNAl和SSDNA2均购自上海生工生物工程有限公司，氯化钯、L-谷 氨酸均购自百灵威公司，硫酸铜购自阿拉丁试剂有限公司，乙二醇购自天津市福宁精细化 工有限公司，氢氧化钾购于国药集团化学试剂有限公司，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购于天 津市广成化学试剂有限公司，除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次 水。
[0023] CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。
[0024] 实施例1制备电化学适配体传感器 (1)制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液 ①将 3.8 mL PdCl2 (3.3 mg/mL)溶液，20 mg CuSO4 ·5Η20, 50 mg L-谷氨酸混合于烧 瓶中，加入40 mL乙二醇（EG)，然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% K0H/EG调整溶液pH大约 为11，此过程溶液由绿色变为深蓝色； ② 将30 mg纯净的多壁碳纳米管加入到上述混合液中，超声2 h，得到均匀悬浮液； ③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL高压釜中，在160 °C下加热6 h，然后冷却至室 温，离心洗涤数次后，将固体于40 °C真空干燥8 h，即可得到PdCuOMWCNTs黑色固体粉末； ④ 分别配制I mg/mL的上述PdCu@MWCNTs、HRP和GOx溶液；用Tris-HCl配制5 mmol/ L SSDNA2;然后分别取 100 mL 的 SSDNA2 (5 mmol/L)，PdCu@MWCNTs (I mg/mL)，HRP(l mg/ mL)和G0X(1 mg/mL)混合后放在4 °C下震荡24 h，得到PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配 体溶液。
[0025] (2)制备电化学适配体传感器工作电极 ① 将直径为4 mm的玻碳电极用1·0、0·3、0·05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处 理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0. 05 mol/L铁氰化钾溶液中， 在-0. 2~0. 6 V扫描，使峰电位差小于110 mV，用超纯水清洗电极表面，吹干； ② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后取6 PL的金掺杂的石墨烯溶液 滴到电极上，室温晾干； ③ 将6 mL 0. 5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面，室温瞭干； ④ 用Tris-HCl配制5 mmol/L SSDNA1，然后取6 PL修饰到电极表面，将电极在4 °C 放置2 h ; ⑤ 将6 PL孵化好的PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液修饰到电极上，在4 °C放 置4 h ; ⑥ 再滴上一系列6 PL不同浓度的腺苷溶液，在4 °C保存晾干，即得到电化学适配体 传感器的工作电极。
[0026] (3)制作电化学适配体传感器工作曲线 打开电化学工作站，将参比电极一饱和甘汞电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工 作电极正确连接在电化学工作站上； 含有浓度为I mmol/L葡萄糖的pH 8. 0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法 (SWV)检测工作电极的电流；根据电流响应的差值（不加腺苷溶液和加入腺苷溶液）与腺 苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
[0027] 实施例2腺苷的检测 按照实施例1所述的步骤制备电化学适配体传感器，采用该电化学适配体传感器检测 表1所示的腺苷，其检测技术指标见表1。
[0028] 表1腺苷的检测技术指标
【权利要求】
1. 一种电化学适配体传感器的制备方法，所述电化学适配体传感器包括：工作 电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金 掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液和不同浓度 的腺苷，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为钼丝电极，所述的捕获探针为 5 ' -CCCAGGTTCTCT- (CH2) 6-NH2-3 '（SSDNA1)，腺苷适配体为 3 ' -SH-TGGAAGGAGGCGTTATGAGGG GGTCCAAGAGA-5' （SSDNA2); 其特征在于，所述制备方法包括以下步骤： a、 制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液； b、 制备电化学适配体传感器工作电极； c、 制作电化学适配体传感器工作曲线； 其中，步骤a制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液的具体步骤如下： ① 将质量比为1:1. 6:4的PdCl2, CuS04 ? 5H20和L-谷氨酸混合于烧瓶中，加入40 mL 乙二醇（EG)，然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% KOH/EG调整溶液pH大约为11，此过程溶 液由绿色变为深蓝色； ② 将纯净的多壁碳纳米管加入到上述混合液中，其中，所述多壁碳纳米管与 &^04*51120的质量之比为3:2，超声2 11，得到均匀的悬浮液； ③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL高压釜中，在160 °C下加热6 h，然后冷却至室 温，离心洗涤数次后，将固体于40 °C真空干燥8 h，即可得到PdCuOMWCNTs黑色固体粉末； ④ 分别配制1 mg/mL的上述PdCu@MWCNTs、HRP和G0X溶液；用Tris-HCl配制5Mmol/L 腺苷适配体（SSDNA2)，然后取等体积的 SSDNA2 (5Mmol/L)，PdCuOMWCNTs (1 mg/mL)，HRP (1 mg/mL)和 G0X(1 mg/mL)混合后放在 4 °C下震荡 24 h，得到 PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适 配体溶液； 步骤b制备电化学适配体传感器工作电极的具体步骤如下： ① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁； ② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后将所述金掺杂的石墨烯溶液滴到 电极上，室温晾干； ③ 将0. 5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面，室温瞭干； ④ 用Tris-HCl配制5Mmol/L捕获探针（SSDNA1)，然后将其滴到电极表面，将电极在4 °C放置2 h ; ⑤ 将孵化好的PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液修饰到电极上，在4 °C放置4 h ； ⑥ 再滴上一系列不同浓度的腺苷溶液，在4 °C保存晾干，即得到电化学适配体传感器 的工作电极； 步骤c制作电化学适配体传感器工作曲线的具体步骤如下： ① 将作为参比电极的饱和甘汞电极、作为对电极的钼丝电极和上述制备的工作电极 正确连接在电化学工作站上； ② 含有浓度为1 mmol/L葡萄糖的pH 8.0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法 (SWV)检测工作电极的电流；根据电流响应的差值（不加腺苷溶液和加入腺苷溶液）与腺 苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
2.如权利要求1所述的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
【文档编号】G01N27/26GK104391020SQ201410611415
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】吴丹, 魏琴, 庞雪辉, 胡丽华, 范大伟 申请人:济南大学
【专利摘要】本发明涉及一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于PdCuMWCNTs纳米粒子构建的电化学适配体传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。本发明的电化学适配体传感器表现出优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选上的实际应用具有重要的意义。
【专利说明】一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明 涉及一种基于PdCuOMWCNTs纳米粒子构建的电化学适配体传感器、其制备方法，以及由该 方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
【背景技术】
[0002] 腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸， 参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许 多其它系统及组织均有生理作用。因此，建立一种简便快捷的腺苷的测定方法是十分必要 的。目前测定腺苷的方法主要有高效液相色谱法，电渗毛细管电泳法和流动注射法等，但是 这些方法在灵敏度、选择性、稳定性和可操作性方面存在一些局限性。
[0003] 核酸适配体具有易合成、稳定性好等优点，可方便地在其特定位置用氧化还原试 齐U、纳米粒子、荧光、酶或生物素分子等功能团加以标记，并可长期贮存和在常温下运输，所 以在分析领域中的应用受到了研究者特别的厚爱，作为一种新型的分子识别元件，它的出 现使抗原抗体的反应发生了革命性的变化，大大弥补了现有抗体的不足，也为传统免疫传 感器发展开辟了一条新的道路。因此近年来基于核酸适配体构建的电化学传感器的研究受 到了极大关注。
[0004] 石墨烯具有极好的结晶性和非凡的电子学、热力学和力学性能，因此是人们广泛 关注的焦点。在石墨烯的研究和应用中，为了充分发挥其优良性质，必须对石墨烯进行功能 化。也就是在保持石墨烯材料优势的基础上，进一步对材料进行性能改性和优化，合成了生 物相容性优异的金掺杂的石墨烯，从而达到更好固定修饰材料的目的。
[0005] 本发明将金掺杂的石墨烯和硫堇溶液滴涂到玻碳电极表面用于固定捕获探针， PdCuOMWCNTs用于固载腺苷适配体，利用腺苷和其适配体链的特异性识别制备了检测腺苷 的电化学适配体传感器。以硫堇（TH)作为电子媒介体，通过葡萄糖氧化酶（GO x)和辣根过 氧化物酶（HRP)双酶实现双重信号的放大。测试结果显示，上述方法制备的电化学适配体 传感器的灵敏度、选择性和稳定性高，基于上述发现，发明人完成了本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种电化学适配体传感器，所述电化学适配体传感器包 括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰 金掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCu@MWCNTs/HRP/GO x/腺苷适配体溶液、不同浓度的腺 苷。
[0007] 本发明的再一个目的在于提供一种电化学适配体传感器的制备方法，所述方法制 备的传感器灵敏度高、重现性好、操作简便。
[0008] 本发明的另一目的是提供所述电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。
[0010] 本发明的电化学适配体传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极 的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCuOMWCNTs/ HRP/G0x/腺苷适配体溶液、不同浓度的腺苷。所述工作电极与参比电极、对电极组成电化学 适配体传感器来检测腺苷。所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为钼丝电极。所述的捕 获探针为 5 ' -CCCAGGTTCTCT- (CH2) 6-NH2-3 '（SSDNAl)，腺苷适配体为 3 ' -SH-TGGAAGGAGGCG TTATGAGGGGGTCCAAGAGA-5' （SSDNA2)。
[0011] 本发明的电化学适配体传感器的制备方法包括以下步骤： a、 制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液； b、 制备电化学适配体传感器工作电极； c、 制作电化学适配体传感器工作曲线。
[0012] 其中，步骤a的制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液，具体包括以下步骤： ① 将PdCl2, CuSO4AH2O和L-谷氨酸混合于烧瓶中（质量之比为1:1. 6:4)，加入40 mL 乙二醇（EG)，然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% K0H/EG调整溶液pH大约为11，此过程溶 液由绿色变为深蓝色； ② 将纯净的多壁碳纳米管（与CuSO4 · 5H20的质量之比为3:2)加入到上述混合液中， 超声2 h，得到均匀的悬浮液； ③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL高压釜中，在160 °C下加热6 h，然后冷却至室 温，离心洗涤数次后，将固体于40 °C真空干燥8 h，即可得到PdCuOMWCNTs黑色固体粉末； ④ 分别配制I mg/mL的上述PdCu@MWCNTs、HRP和GOx溶液；用Tris-HCl配制5 mmol/ L SSDNA2;然后取等体积的SSDNA2 (5 mmol/L)，PdCu@MWCNTs (I mg/mL)，HRP(l mg/mL)和 G0X(1 mg/mL)混合后放在4 °C下震荡24 h，得到PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液。
[0013] 步骤b的制备电化学适配体传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤： ① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁； ② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后将金掺杂的石墨烯溶液滴到电极 上，室温晾干； ③ 将0. 5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面,室温瞭干； ④ 用Tris-HCl配制5 mmol/L SSDNAl，然后将其滴到电极表面，将电极在4 °C放置2 h ； ⑤ 将孵化好的PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液修饰到电极上，在4 °C放置4 h ； ⑥ 再滴上一系列不同浓度的腺苷溶液，在4 °C保存晾干，即得到电化学适配体传感器 的工作电极。 步骤c的制作电化学适配体传感器工作曲线，步骤如下： ① 将参比电极一饱和甘汞电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工作电极正确连接 在电化学工作站上； ② 含有浓度为I mmol/L葡萄糖的pH 8.0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法 (SWV)检测工作电极的电流；根据电流响应的差值（不加腺苷溶液和加入腺苷溶液）与腺 苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
[0014] 本发明的另一方面提供上述方法制备的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用 途。
[0015] 本发明的有益成果： (1)本发明的发明人首次将PdCuOMWCNTs引入到腺苷的电化学适配体传感器的制备当 中。利用其优异的生物相容性和高的催化性能，使所制作的传感器有更高的灵敏度和更宽 的检测范围。
[0016] (2)在本发明的制备方法中，以硫堇作为电子媒介体，通过加入双酶GO5^P HRP实 现双重信号的放大，进一步提高了传感器的灵敏度。
[0017] (3)该传感器集成了适配体和电化学传感器两方面的优势，既具有电化学传感器 的高灵敏度、快响应、简单操作、低成本，又具有适配体的高选择性和特异性。因此本发明的 电化学适配体传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，对推广适配体 传感器在疾病预防、疾病诊断和药物筛选上的实际应用具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 下面结合【专利附图】
【附图说明】和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
[0019] 图1为本发明的电极层层修饰在5 mmol/L铁氰化钾溶液中的循环伏安图。
[0020] 图中标记：a_裸玻碳电极的循环伏安图；b_修饰金掺杂的石墨烯和硫堇溶液之后 的循环伏安图；C-修饰捕获探针SSDNAl之后的循环伏安图；d-修饰PdCu@MWCNTs/HRP/GO x/ 腺苷适配体溶液之后的循环伏安图；e-修饰腺苷后的电化学适配体传感器的循环伏安图。
[0021] 从图1中可以看出，与裸玻碳电极的循环伏安图（图la)相比，当电极表面修饰上 金掺杂的石墨烯和硫堇溶液后，氧化峰电流值明显增加（图Ib)，说明金掺杂的石墨烯和硫 堇具有很好的电子传输能力；当电极表面继续修饰上SSDNAl之后（图Ic)，峰电流明显降 低，说明SSDNAl阻碍了电子的传递；当PdCu@MWCNTs/HRP/GO x/腺苷适配体溶液修饰到电极 的表面时，峰电流继续减小（图Id)，这是因为腺苷适配体SSDNA2的存在阻碍了电子的传 递。当200 nmol/L的腺苷修饰到电极上时，峰电流增大（图le)，这是由于腺苷与其适配体 链的特异性结合使腺苷适配体从电极上脱落，从而导致电子传递能力增强。由此说明电极 的层层修饰是成功的。
【具体实施方式】
[0022] 本发明使用的SSDNAl和SSDNA2均购自上海生工生物工程有限公司，氯化钯、L-谷 氨酸均购自百灵威公司，硫酸铜购自阿拉丁试剂有限公司，乙二醇购自天津市福宁精细化 工有限公司，氢氧化钾购于国药集团化学试剂有限公司，磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购于天 津市广成化学试剂有限公司，除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次 水。
[0023] CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。
[0024] 实施例1制备电化学适配体传感器 (1)制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液 ①将 3.8 mL PdCl2 (3.3 mg/mL)溶液，20 mg CuSO4 ·5Η20, 50 mg L-谷氨酸混合于烧 瓶中，加入40 mL乙二醇（EG)，然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% K0H/EG调整溶液pH大约 为11，此过程溶液由绿色变为深蓝色； ② 将30 mg纯净的多壁碳纳米管加入到上述混合液中，超声2 h，得到均匀悬浮液； ③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL高压釜中，在160 °C下加热6 h，然后冷却至室 温，离心洗涤数次后，将固体于40 °C真空干燥8 h，即可得到PdCuOMWCNTs黑色固体粉末； ④ 分别配制I mg/mL的上述PdCu@MWCNTs、HRP和GOx溶液；用Tris-HCl配制5 mmol/ L SSDNA2;然后分别取 100 mL 的 SSDNA2 (5 mmol/L)，PdCu@MWCNTs (I mg/mL)，HRP(l mg/ mL)和G0X(1 mg/mL)混合后放在4 °C下震荡24 h，得到PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配 体溶液。
[0025] (2)制备电化学适配体传感器工作电极 ① 将直径为4 mm的玻碳电极用1·0、0·3、0·05 mm的三氧化二铝抛光粉抛光处 理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0. 05 mol/L铁氰化钾溶液中， 在-0. 2~0. 6 V扫描，使峰电位差小于110 mV，用超纯水清洗电极表面，吹干； ② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后取6 PL的金掺杂的石墨烯溶液 滴到电极上，室温晾干； ③ 将6 mL 0. 5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面，室温瞭干； ④ 用Tris-HCl配制5 mmol/L SSDNA1，然后取6 PL修饰到电极表面，将电极在4 °C 放置2 h ; ⑤ 将6 PL孵化好的PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液修饰到电极上，在4 °C放 置4 h ; ⑥ 再滴上一系列6 PL不同浓度的腺苷溶液，在4 °C保存晾干，即得到电化学适配体 传感器的工作电极。
[0026] (3)制作电化学适配体传感器工作曲线 打开电化学工作站，将参比电极一饱和甘汞电极、对电极一钼丝电极和上述制备的工 作电极正确连接在电化学工作站上； 含有浓度为I mmol/L葡萄糖的pH 8. 0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法 (SWV)检测工作电极的电流；根据电流响应的差值（不加腺苷溶液和加入腺苷溶液）与腺 苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
[0027] 实施例2腺苷的检测 按照实施例1所述的步骤制备电化学适配体传感器，采用该电化学适配体传感器检测 表1所示的腺苷，其检测技术指标见表1。
[0028] 表1腺苷的检测技术指标
【权利要求】
1. 一种电化学适配体传感器的制备方法，所述电化学适配体传感器包括：工作 电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰金 掺杂的石墨烯、硫堇、捕获探针、PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液和不同浓度 的腺苷，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为钼丝电极，所述的捕获探针为 5 ' -CCCAGGTTCTCT- (CH2) 6-NH2-3 '（SSDNA1)，腺苷适配体为 3 ' -SH-TGGAAGGAGGCGTTATGAGGG GGTCCAAGAGA-5' （SSDNA2); 其特征在于，所述制备方法包括以下步骤： a、 制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液； b、 制备电化学适配体传感器工作电极； c、 制作电化学适配体传感器工作曲线； 其中，步骤a制备PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液的具体步骤如下： ① 将质量比为1:1. 6:4的PdCl2, CuS04 ? 5H20和L-谷氨酸混合于烧瓶中，加入40 mL 乙二醇（EG)，然后在不断搅拌下逐滴加入8 wt% KOH/EG调整溶液pH大约为11，此过程溶 液由绿色变为深蓝色； ② 将纯净的多壁碳纳米管加入到上述混合液中，其中，所述多壁碳纳米管与 &^04*51120的质量之比为3:2，超声2 11，得到均匀的悬浮液； ③ 将所得到的混合溶液转移到50 mL高压釜中，在160 °C下加热6 h，然后冷却至室 温，离心洗涤数次后，将固体于40 °C真空干燥8 h，即可得到PdCuOMWCNTs黑色固体粉末； ④ 分别配制1 mg/mL的上述PdCu@MWCNTs、HRP和G0X溶液；用Tris-HCl配制5Mmol/L 腺苷适配体（SSDNA2)，然后取等体积的 SSDNA2 (5Mmol/L)，PdCuOMWCNTs (1 mg/mL)，HRP (1 mg/mL)和 G0X(1 mg/mL)混合后放在 4 °C下震荡 24 h，得到 PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适 配体溶液； 步骤b制备电化学适配体传感器工作电极的具体步骤如下： ① 将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁； ② 配制浓度为2 mg/mL的金掺杂的石墨烯溶液，然后将所述金掺杂的石墨烯溶液滴到 电极上，室温晾干； ③ 将0. 5 mg/mL的硫堇溶液滴到电极表面，室温瞭干； ④ 用Tris-HCl配制5Mmol/L捕获探针（SSDNA1)，然后将其滴到电极表面，将电极在4 °C放置2 h ; ⑤ 将孵化好的PdCu@MWCNTs/HRP/GOx/腺苷适配体溶液修饰到电极上，在4 °C放置4 h ； ⑥ 再滴上一系列不同浓度的腺苷溶液，在4 °C保存晾干，即得到电化学适配体传感器 的工作电极； 步骤c制作电化学适配体传感器工作曲线的具体步骤如下： ① 将作为参比电极的饱和甘汞电极、作为对电极的钼丝电极和上述制备的工作电极 正确连接在电化学工作站上； ② 含有浓度为1 mmol/L葡萄糖的pH 8.0的PBS缓冲溶液作为底液，通过方波伏安法 (SWV)检测工作电极的电流；根据电流响应的差值（不加腺苷溶液和加入腺苷溶液）与腺 苷标准溶液浓度的关系，绘制工作曲线。
2.如权利要求1所述的电化学适配体传感器在测定腺苷中的用途。
【文档编号】G01N27/26GK104391020SQ201410611415
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】吴丹, 魏琴, 庞雪辉, 胡丽华, 范大伟 申请人:济南大学
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