丹参药材中水溶性成分的含量测定方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丹参药材中水溶性成分的含量测定方法及其应用，所述含量测定方法是以丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A对照品为对照，以0.026％磷酸水溶液-乙腈＝85～10∶15～90为流动相梯度洗脱的超高效液相色谱法。本发明提供的丹参药材中水溶性成分的含量测定方法，能够同时测定丹参药材中多种水溶性成分的含量，并可应用于丹参药材指纹图谱的检测中。该测定方法对丹参药材中水溶性成分的分离效果好，具有快速、准确、高重现性、高回收率的特点，而且其专属性强、精密度高、重复性好、稳定性高、测量结果准确。应用该方法所测得指纹图谱的峰多，反映的信息较完全；峰形好，易于鉴别，相似度高，准确可靠。
【专利说明】丹参药材中水溶性成分的含量测定方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及丹参药材中水溶性成分含量测定方法及其应用，属于中药检测技术领 域。
【背景技术】
[0002] 丹参（拉丁学名：Salvia miltiorrhiza Bunge)又名赤参，紫丹参，红根等。根入 药，含丹参酮，为强壮性通经剂，有祛瘀、生新、活血、调经等效用，为妇科要药，主治子宫出 血，月经不调，血瘀，腹痛，经痛，经闭，庙痛。对治疗冠心病有良好效果。此外亦治神经性衰 弱失眠，关节痛，贫血，乳腺炎，淋巴腺炎，关节炎，疮疖痛肿，丹毒，急慢性肝炎，肾孟肾炎， 跌打损伤，晚期血吸虫病肝脾肿大，癫癎。外用又可洗漆疮。
[0003] 丹参的主要化学成分分为脂溶性和水溶性两大类：丹参的脂溶性成分大多为共轭 醌、酮类化合物，丹参的水溶性成分主要为酚酸类物质。丹参的主要药理作用为可降低沙土 鼠和大鼠缺血性脑卒中的发病率和死亡率，减轻缺血后引起的脑水肿，改善冠脉循环，对心 肌缺血和心肌梗死保护，改善微循环,改善血液流变性,抑制凝血、激活纤溶,抑制血小板功 能和抗血栓形成，稳定红细胞膜，抗肝纤维化，降血脂和抗动脉粥样硬化，促进组织的修复 与再生作用等。
[0004] 丹参品种、产地和采收期的不同会造成其成品质量的差异。为保证产品质量的稳 定性，对其水溶性成分的含量测定及指纹图谱研究较多。《丹参药材水溶性成分的高效液相 色谱指纹图谱研究》（周欣等，色谱，2005年03期，292?295)中公开了一种丹参药材水溶 性成分的高效液相色谱指纹图谱的检测方法。
[0005] 现有技术中，丹参药材中水溶性成分含量测定及指纹图谱检测中，一般只测定其 中一至两种成分的含量。为了减少分开多次测定丹参药材不同水溶性成分含量而产生的误 差，如果能一次性测定多种成分的含量，不仅可以节约时间和成本，还可以使得同一系统条 件下的测试结果更稳定、可靠。然而目前尚未有同时测定和检测丹参多种组分的含量以及 指纹图谱的相关报道。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种丹参药材中水溶性成分的含 量测定方法及其应用，能够同时测定丹参药材中多种水溶性成分的含量，并检测其指纹图 谱，所述测定方法对丹参药材中水溶性成分的分离效果好，具有快速、准确、高重现性、高回 收率的特点。
[0007] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0008] 丹参药材中水溶性成分的含量测定方法，所述方法是以丹参素、原儿茶醛、迷迭香 酸、丹酚酸B和丹酚酸A对照品为对照，以0.026%磷酸水溶液-乙腈=85?10 : 15? 90为流动相梯度洗脱的超高效液相色谱法。
[0009] 具体的含量测定方法为：照超高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
[0010] (1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0. 026% 磷酸水溶液为流动相4，乙腈为流动相84:8 = 85?10:15?90，梯度洗脱：0?51^11: A : B = 85 ?75 : 15 ?25,5 ?8min:A : B = 75 ?70 : 25 ?30,8 ?12min:A : B = 70? 50:30 ?50,12?12.01min:A:B = 50?10:50?90,12.01?17min:A:B =10 : 90 ;检测波长为276?306nm ;流速为0? 1?0? 5mL ? min-1 ;柱温为25°C?35°C ; 理论板数按按丹酚酸B峰计算应不低于2000 ;
[0011] (2)对照品溶液的制备：取丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A对照 品适量，精密称定，分别加入5%甲醇溶解，制成lmg/mL的五种对照品储备液，分别吸取各 对照品储备液，加5%甲醇配制成丹参素对照品浓度为82. 2 y g/mL、原儿茶醛对照品浓度 为15. 5 ii g/mL、迷迭香酸对照品浓度为37. 2 ii g/mL、丹酚酸B对照品浓度为522. 5 ii g/mL、 丹酚酸A对照品浓度为32. 2 y g/mL的混合溶液，于4°C冷藏备用，作为对照品溶液；
[0012] (3)供试品溶液的制备：取丹参药材粉末0. 2g，精密称定，置IOOmL具塞锥形瓶中， 加入40mL 5%甲醇，超声提取30min，用5%甲醇补足重量；滤过，取续滤液，即得；
[0013] (4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各I y L，注入超高效液相色谱 仪，测定，即得。
[0014] 前述含量测定方法中，步骤（1)中检测波长为286nm，流速为0. 2mL ? min-1，柱温 为 30°C。
[0015] 丹参药材中水溶性成分的含量测定方法在丹参药材指纹图谱检测中的应用。
[0016] 前述含量测定方法的应用，是用指纹图谱软件对含量测定方法中得到的17分钟 内的色谱图进行处理，即得丹参药材水溶性成分的指纹图谱。
[0017] 前述含量测定方法的应用中，所述丹参药材水溶性成分的指纹图谱中有17个共 有峰。
[0018] 虽然丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A均属于丹参药材中水溶性 成分，但其各有区别，适宜的含量测定条件往往并不相同，要同时测定它们的含量，必须对 UPLC的各项条件参数进行摸索、试验。为了能将丹参药材中水溶性成分有效分离开来，对色 谱条件尤其是流动相种类、流动相比例以及梯度洗脱条件的摸索、确定是非常关键的。本发 明在现有技术的基础之上，继续探索，通过对流动相种类、流动相比例、梯度洗脱条件、对照 品及供试品的制备方法等进行摸索、筛选，最终建立了丹参药材中水溶性成分的含量测定 方法。
[0019] 一、主要仪器与试药
[0020] 美国WATERS超高效液相色谱（UPLC)Acquity系统，包括自动进样器，四元溶剂 管理器，PDA检测器以及Empower 3色谱工作站，WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (2. I X 100mm，I. 7 u m)
[0021] 乙腈为色谱纯，美国Fisher公司；其他试剂为分析纯，购买于国药集团。
[0022] 丹酚酸B、丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸及丹酚酸A均为HPLC级，纯度> 98%。
[0023] 丹参药材共13批，其中：1?3批药材（SI、S2、S3药材）来源于四川逢春制药股 份有限公司（道地药材）、4?13批药材（S4?S13药材）来源于贵州信邦中药材发展有 限公司。
[0024] 二、含量测定的方法与结果
[0025] I、色谱条件的选择
[0026] I. 1柱温的选择
[0027] 为寻找最佳柱温，采用不同柱温进行实验，观察结果，结果见表1。
[0028] 表1柱温实验表
[0029]
【权利要求】
1. 丹参药材中水溶性成分的含量测定方法，其特征在于：所述方法是以丹参素、原儿 茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A对照品为对照，以0. 026 %磷酸水溶液-乙腈=85? 10 : 15?90为流动相梯度洗脱的超高效液相色谱法。
2. 根据权利要求1所述的丹参药材中水溶性成分的含量测定方法，其特征在于：按照 以下步骤测定： (1) 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.026 %磷 酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，A : B = 85?10 : 15?90,梯度洗脱：0?5min:A : B = 85 ?75 : 15 ?25,5 ?8min:A : B = 75 ?70 : 25 ?30,8 ?12min:A : B = 70? 50:30 ?50,12?12.01min:A:B = 50?10:50?90,12.01?17min:A:B =10 : 90 ;检测波长为276?306nm ;流速为0? 1?0? 5mL ? min-1 ;柱温为25°C?35°C ; 理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000 ; (2) 对照品溶液的制备：取丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A对照品 适量，精密称定，分别加入5%甲醇溶解，制成lmg/mL的五种对照品储备液，分别吸取各对 照品储备液，加5%甲醇配制成丹参素对照品浓度为82. 2 y g/mL、原儿茶醛对照品浓度为 15. 5 ii g/mL、迷迭香酸对照品浓度为37. 2 ii g/mL、丹酚酸B对照品浓度为522. 5 ii g/mL、丹 酚酸A对照品浓度为32. 2 y g/mL的混合溶液，于4°C冷藏备用，作为对照品溶液； (3) 供试品溶液的制备：取丹参药材粉末0. 2g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，加入 40mL 5%甲醇，超声提取30min，用5%甲醇补足重量；滤过，取续滤液，即得； ⑷测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1 U L，注入超高效液相色谱仪，测 定，即得。
3. 根据权利要求2所述的丹参药材中水溶性成分的含量测定方法，其特征在于：所述 步骤（1)中检测波长为286nm，流速为0. 2mL ? mirT1，柱温为30°C。
4. 如权利要求1?3任一项所述丹参药材中水溶性成分的含量测定方法在丹参药材指 纹图谱检测中的应用。
5. 根据权利要求4所述丹参药材中水溶性成分的含量测定方法的应用，其特征在于： 用指纹图谱软件对含量测定方法中得到的17分钟内的色谱图进行处理，即得丹参药材水 溶性成分的指纹图谱。
6. 根据权利要求5所述丹参药材中水溶性成分的含量测定方法的应用，其特征在于： 所述丹参药材水溶性成分的指纹图谱中有17个共有峰。
【文档编号】G01N30/02GK104374844SQ201410639741
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】张观福 申请人:贵州信邦制药股份有限公司