植物无选择转化的制作方法

植物无选择转化的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物无选择转化方法。本发明提供用于鉴定再生转化植物和分化的转化植物部分的方法，所述方法在使植物细胞再生以得到分化组织之前，无需让植物细胞经历选择条件。在具体的实施方案中，所述植物细胞是玉米植物细胞。也提供了植物的培育和处理方法，包括对表现出特定目标性状的植物的鉴定方法。
【专利说明】植物无选择转化
[0001] 本申请是申请日为2007年8月31日的中国专利申请200780039999. 9"植物无选 择转化"的分案申请。
[0002] 发明背景
[0003] 本申请要求于2006年8月31日申请的美国临时申请顺序号60/841，519的优先 权，该临时申请所公开的全部内容都通过引用结合到本文中。 1.

【技术领域】
[0004] 本发明涉及植物生物【技术领域】。具体地讲，本发明涉及产生转基因植物的方法，该 方法在得到再生植物或植物部分之前无需使用选择标记基因。 2.

【背景技术】
[0005] 植物细胞的稳定转化和转基因植物的产生通常需要选择步骤，其中在接触一个或 多个外源核酸序列（包括含有一个或多个编码目标基因和标记基因的序列的外源核酸序 列）后，在选择剂存在下选择植物组织。经过这样的选择后，可使含有目标基因（GOI)的稳 定转化植物再生并进行鉴定。然而，一旦产生含有GOI的转化植物后，通常就不再需要本身 并非GOI的可选择或可筛选的标记基因，而且其存在可能使后续分析和产品开发工作变得 复杂化。此外，需要强启动子以驱动选择标记，已经显示出会偏倚所需基因的表达（Υ〇〇等， 2005)。
[0006] 已经报道了产生无标记基因的转基因植物的各种方法，例如共转化、可转座元件、 位点特异性重组和染色体内重组（例如Darbani等，2007)。然而，这些系统大部分既耗时 又低效。Goldsbrough(2001)综述了在转基因植物的产生中避免使用或排除选择标记基因 的方法。
[0007]DeVetten等（2003;和美国专利申请公布说明书2005/0097641)描述了营养体繁 殖作物（例如马铃薯）的无标记转化方法，然而会产生嵌合植物。Palys等（PCT公布说明 书TO2004/081184)介绍了番茄、莴苣和甘蓝的无选择转化。Francis和Spiker(2005)介 绍了用基于PCR的筛选来鉴定转基因拟南芥（Arabidopsis)系，以免转基因整合中的选择 偏倚。相比之下，本发明提供通过在获得再生玉米植物之前不需要存在选择剂或可筛选标 记基因（例如目测标记基因）的方法而快速有效产生种系转化玉米植物的方法。


【发明内容】

[0008] -方面，本发明提供转基因玉米植物的鉴定方法，所述方法包括：(a)获得用含有 目标核酸序列的DNA区段转化的玉米植物细胞；(b)不经过测定所述DNA区段存在的初次 筛选，就从所述细胞再生出多个玉米植株或分化的玉米植物部分；和（c)从多个玉米植株 或分化的玉米植物部分中鉴定出至少第一转基因玉米植物或转基因分化植物部分。在一 些实施方案中，DNA区段不包含选择标记基因或目测标记基因。在其它实施方案中，植物在 固体培养基、液体培养基或者固体与液体培养基组合上生长而得以再生。在具体的实施方 案中，植物通过接触GOI之后仅在液体培养基上生长的细胞、而在鉴定转基因玉米植物或 转基因分化植物部分之前就得以再生。在某些实施方案中，将接触GOI之后仅生长在液体 培养基中的细胞、而在鉴定转基因植物或转基因植物部分之前的细胞转化频率，与接触GOI 之后在固体培养基或土壤上生长的细胞、而在鉴定转基因植物或转基因植物部分之前的细 胞转化频率进行比较，前者相对更高。
[0009] 在某些实施方案中，植物细胞是未成熟的玉米胚细胞。在具体的实施方案中，未成 熟玉米胚的长度约I. 5mm至约3. 5_，或长度约I. 9mm至约2. 3_。
[0010] 在某些实施方案中，所述方法在步骤（b)与（c)之间还包括（1)将多个玉米植物 或分化的植物部分放入装有生长培养基或水的培养管或生长穴盆（growthplug)中并保留 玉米植物各自的识别标记；和（2)让植物或植物部分经历至少第一测定，看DNA区段是否存 在，从而根据测定结果来鉴定一个或多个植物或植物部分是转基因的。测定还可选自DNA 印迹杂交、PCR、DNA测序、RNA印迹、蛋白质印迹、免疫测定和DNA区段所编码的酶活性测定。 在具体的实施方案中，在将再生植株植入土壤之前进行测定。在其它实施方案中，鉴定推定 缺乏目标核酸序列的转化玉米植物或分化的植物部分，其中在包含汇集所述多个玉米植物 或分化的植物部分的合并核酸亚类的植物组织上进行测定。
[0011] 在一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于6周使玉米植物或 玉米植物部分再生。在其它实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于4周使 玉米植物或玉米植物部分再生。在又一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后 不迟于3周使玉米植物或玉米植物部分再生。在再一些实施方案中，在DNA区段转化到玉 米植物细胞后不迟于2周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它实施方案中，在DNA区 段转化到玉米植物细胞后不迟于1周使玉米植物或玉米植物部分再生。
[0012] 在某些实施方案中，通过细菌介导的转化、电穿孔、PEG介导的转化或粒子轰击法， 将DNA区段引入玉米植物细胞中。在具体的实施方案中，细菌介导的转化是由选自土壤杆 菌（Agrobacterium)细胞、根瘤菌（Rhizobium)细胞、中华根瘤菌（Sinorhizobium)细胞和 中间根瘤菌（Mesorhizobium)细胞的细菌细胞介导的。
[0013] 该方法还可包括在植物或植物部分再生后、使从第一玉米植物细胞获取的玉米植 物或植物部分经历培养条件的步骤，所述条件选择或允许筛选目标核酸序列的存在与否。 在某些实施方案中，生长培养基是固体培养基。在又一些实施方案中，生长培养基是液体。 在再一些实施方案中，生长培养基是土壤。在其它实施方案中，再生植物或分化的植物部分 就DNA区段的存在而言是一致的。
[0014] 附图简沭
[0015] 下列附图构成本说明书的组成部分，用于进一步证明本发明的某些方面。参考这 些附图中的一幅或多幅并结合本文所给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本 发明。
[0016] 图1.无选择（"nosel"）转化方案和2T转化方案的示意性比较。（有关2T策 略的细节请参见Huang等，2004)。
[0017] 图2.用代表性再生品系的⑶S进行的组织化学分析。
[0018]图3.通过用草甘膦溶液喷洒各植株后"无选择"方法的草甘膦耐受性事件的恢 复。
[0019] 图4.来自如实施例4所述的所选Rtl植物的代表性DNA印迹分析数据。
[0020] 图5.用Rtl花粉和与亲本系回交验证GUS基因的继代种系传递和分离。
[0021] 图6.所选独立转化事件后代的DNA印迹分析数据，证明转化序列（CP4基因）的 稳定传递。
[0022] 图7.安排生长穴盆以允许在转基因序列存在的测定后容易鉴定各个植株。
[0023] 图8.利用半固体培养基-比较有选择方法和无选择方法的再生方案的示意图。
[0024] 图9.用获取再生植株之前的无选择液体培养的再生方案-增殖培养基的比较。

【具体实施方式】
[0025] 许多现代遗传转化植物的产品开发都包括将多个转基因性状集中在一起，从而给 农民们提供多个增值性状。该方法的一个主要瓶颈就是存在着选择标记基因，在转化期间 这些基因与目标基因（GOI) -起携带，因为该过程通常依赖于使用选择标记基因以确保植 物细胞的转化。尽管在转化后去除选择标记基因有多种方法可行，但这些方法通常都耗时 且效率也不高。
[0026] 本发明通过开发无需使用选择标记基因的有效转化方法，以及用于推进无选择产 生的转基因事件的有效的植物处理和筛选方法，从而消除了上述瓶颈。具体地讲，本发明涉 及不用选择而提高植物转化效率和随后再生的方法，导致产生无标记转基因事件。这是产 生转基因作物的一项重大突破，因为少标记的转化（以及随后在选择剂不存在时进行植物 再生）避免了去除标记所带来的麻烦，避免了因需要启动选择标记基因表达而使所得转化 事件遗传结构发生偏倚，同时也避免了后代生长期间的潜在困难（例如因为相应GOI与选 择标记编码基因的转基因分离）。该方法也消除了对用于可选择或可筛选标记基因的额外 表达盒的需要，因而降低了转化载体的大小并带来相关益处（例如降低了因重复性盒序列 所致沉默机会，降低了启动子干扰并简化了转化载体的构建）。
[0027] 无选择标记转基因植物的高通量产生，需要转化体的有效产生。优选的是无选择 转化、尤其是在获得再生苗或完整小植株（包含苗和根）之前的无选择转化，可以在选择剂 不存在时进行。在某些实施方案中，转化到靶植物细胞的核酸序列可不包含选择标记基因。 在其它实施方案中，可存在选择标记基因或目测标记基因，但转化细胞和再生组织仍然不 经历选择剂，所述选择剂是选择标记基因所能耐受、抵抗或对其具有指定的其它可测定表 型。
[0028] 此外，优选这些转化体对于GOI的存在而言是非嵌合的（即一致的），因为对于 GOI的存在而言是非一致的嵌合植物组织的存在，使得对含GOI的后代植物的进一步分 析、产生和鉴定变得复杂化。因此，已经发现，对常规产生非嵌合转基因植物而言的无选 择转化（包括随后的再生步骤）需要有效产生大的转基因部分并快速产生苗原基（shoot primordia)〇
[0029] 此外，在选择压力不存在时，大量植物都可再生，它们许多或大多数都缺乏G0I。因 此，提供了用于再生、培育和鉴定潜在包含GOI的植物的有效方法。在某些实施方案中，植 物的再生是在半固体培养基中进行，然后才将推定的转化体移栽到土壤中。在其它实施方 案中，培养基可以是液体的。在又一些实施方案中，在再生期间，可采用半固体和液体培养 基的组合，以便在筛选和移至组织培养期间所用的不同生长条件时进行植物的处理并能节 省时间、金钱和费用。在再一些实施方案中，再生期间只使用液体培养基。在具体的实施方 案中，在液体培养基上再生可提高目标基因所接触细胞的转化频率。
[0030] 在再生出转化植株的整个组织培养步骤中，选择剂的存在可使所选组织特性发生 偏倚，所述偏倚基本上需要某水平的选择标记的表达，以使组织在选择压力下存活。举例来 说，这可导致倾向得到异源核酸序列的多重或复合插入的转基因事件的偏倚。因此，本发明 提供得到推定转化植物群体或系列的方法，所述方法不需要让植物在组织培养（例如愈伤 组织增殖、预再生（pre-regeneration)和再生）阶段期间经历这样的选择压力，而且所述 植物可表现出有利的GOI表达特性、和/或在指定事件中发现的转基因插入位点分子结构 和遗传分离相关的有利特性。具体地讲，这样的有利特性可包括例如表现出GOI的有利表 达水平的有效比例的转化事件，或表现出低拷贝数（即1-2拷贝）插入的有效比例的转化 事件。在具体的实施方案中，低拷贝数转化事件缺乏oriV或其它载体骨架（backbone)序 列，如果这些序列在转化过程开始最初接触植物细胞的原始转化构建体中存在的话。
[0031] 根据本发明方法，无这类选择的转化和再生是可重现且有效的。在某些实施方案 中，转化频率（transformationfrequency，TF)定义为所得到的稳定转化的一致（即非嵌 合）植物的数量除以包含与异源核酸构建体接触的细胞的未成熟胚或其它外植体；转化频 率为至少3%，根据胚的大小和培养条件（包括再生方法种类）的不同，转化频率的范围为 约3%至约60%。在具体的实施方案中，TF的范围为约10%至约15%。或者，可用其它方 式计算TF，例如根据所得转化植株数量除以所述未成熟胚或其它外植体中再生并生长的植 株数量而求出TF。
[0032] 在某些实施方案中，无选择转化的作物选自单子叶作物，包括禾本科（Poaceae)， 例如玉米、水稻、高粱、小麦、黑麦、黍、甘鹿、燕麦、小黑麦、草坪草（turfgrass)和柳枝稷 (switchgrass)植物。在一个具体的实施方案中，作物是玉米植物。在某些实施方案中，接 触异源核酸序列的转化靶组织（例如外植体）包括分生组织，例如胚或苗分生组织（shoot meristem)。在某些实施方案中，外植体是胚。在具体的实施方案中，胚是未成熟胚。在再 一些实施方案中，未成熟胚是未成熟玉米胚，大小介于约I. 9-3. 5mm之间，或大小介于约 I. 6-1. 8mm之间。在具体的实施方案中，未成熟玉米胚的大小介于约I. 9-2. 5mm之间，优选 约2. 3mm。在其它实施方案中，未成熟玉米胚的大小为约2. 5-3. 2mm，或约2. 8-4. 0mm。根据 其发育阶段或分离时间、授粉后的天数（DAP)(例如约9-14天DAP或约10-12DAP)，也可选 择未成熟胚作为转化革巴。
[0033] 为了启动本发明的转化过程，首先需要选择准备插入到植物细胞或组织中的遗传 组件。遗传组件可包括用本发明方法引入到植物细胞或组织中的任何核酸。遗传组件可包 括非植物DNA、植物DNA或合成DNA。
[0034] 在一个优选的实施方案中，将遗传组件掺入到DNA组成中，例如包含至少一个或 更多以下类型的遗传组件的重组双链质粒或载体分子：(a)在植物细胞中起作用并导致产 生RNA序列的启动子，（b)导致产生农艺学有用产物的编码RNA序列的结构DNA序列，和（c) 在植物细胞中起作用并使聚腺苷酸化核苷酸添加到RNA序列3'端的3'非翻译DNA序列。
[0035] 载体可含有大量遗传组件以便转化植物细胞或组织并调节所需基因的表达。在一 个优选的实施方案中，遗传组件是定向的，以便能表达mRNA，而在一个实施方案中可翻译为 蛋白质。以双链形式存在的植物结构编码序列（基因，cDNA、合成DNA或其它DNA)的表达 包括通过RNA聚合酶从一条DNA链转录出信使RNA(mRNA)，然后在核内加工mRNA初级转录 物。该加工涉及将聚腺苷酸化核苷酸添加到mRNA的3'端的3'非翻译区。
[0036] 含所需遗传组件的质粒或载体的制备方法是本领域众所周知的。载体通常由大量 遗传组件组成，包括但不限于调节元件，例如启动子、前导序列、内含子和终止序列。根据元 件与它们所控制的序列或基因的接近度，调节元件也称为顺式或反式调节元件。
[0037] 将DNA转录为mRNA是由通常称为"启动子"的DNA区调节的。启动子区含有这样 的碱基序列：所述序列发信号给RNA聚合酶而使其与DNA缔合并启动转录为mRNA，用DNA链 之一为模板制备相应的RNA互补链。
[0038] 文献中已经介绍了在植物细胞中具有活性的大量启动子。这些启动子可包括但不 限于根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)根瘤诱导质粒携带的胭脂碱合酶（NOS) 和章鱼碱合酶（OCS)的启动子、花椰菜花叶病毒启动子（例如花椰菜花叶病毒（CaMV) 19S 启动子和35S启动子）以及玄参花叶病毒（FMV)35S启动子、增强型CaMV35S启动子（e35S)、 核酮糖二磷酸羧化酶小亚基（ssRUBISCO，一种非常丰富的植物多肽）的光诱导型启动子。 所有这些启动子都已用于产生各类DNA构建体，其已在植物中表达。
[0039] 也可构建启动子杂合体以增强转录活性（美国专利号5, 106, 739)，或与所需转录 活性、诱导性和组织特异性或发育特异性结合。在植物中起作用的启动子包括但不限于所 述诱导型启动子、病毒启动子、合成启动子、组成型启动子以及用于时间调节、空间调节和 时空调节的启动子。本领域也已知组织增强型启动子、组织特异性启动子或发育调节型启 动子等其它启动子，它们都可用于本发明的实践中。
[0040] 启动子可得自不同来源，例如来自植物和植物DNA病毒，包括但不限于CaMV35S和 FMV35S启动子和从植物基因（例如ssRUBISCO基因）中分离的启动子。如下所述，优选的 是所选具体启动子应当能引起足够表达，导致产生有效量的目标基因产物。
[0041] 如有必要,可修饰本发明DNA构建体（例如嵌合/重组植物基因）中所用的启动 子，以影响其控制特性。可通过与操纵子区连接、随机或控制诱变等方式来衍生启动子。此 夕卜，可改变启动子，使其含有多个"增强子序列"以便提高基因表达。
[0042] 本发明DNA构建体所产生的mRNA也可含有5'非翻译前导序列。该序列可衍生 自选择用于表达基因的启动子，并可经过特异性修饰以增加mRNA的翻译。5'非翻译区也 可得自病毒RNA、合适的真核基因或合成基因序列。这样的"增强子"序列有望提高或改变 所得mRNA的翻译效率。本发明不限于这样的构建体：其中非翻译区得自启动子序列所伴随 的5'非翻译序列。相反，非翻译前导序列可得自无关启动子或基因（参见例如美国专利 5, 362, 865)。用于增强表达或影响基因转录或翻译的其它遗传组件也视为遗传组件。
[0043] 嵌合构建体3'非翻译区应含有转录终止子、或具有等同功能的元件以及在植物 中起作用的聚腺苷酸化信号，以使聚腺苷酸化核苷酸添加到RNA的3'端。合适3'区的实 例是（1)含有土壤杆菌根瘤诱导（Ti)质粒基因（例如胭脂碱合酶（NOS)基因）聚腺苷酸 化信号的3'转录、非翻译区，和（2)植物基因例如大豆贮存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷 酸羧化酶小亚基（ssRUBISCO)基因。优选的：V区的实例来自豌豆的ssRUBISCOE9基因 (欧洲专利申请0385962)。
[0044] 通常，位于聚腺苷酸化位点下游几百个碱基对的DNA序列的作用是终止转录。该 DNA序列在本文中称为转录终止区。该区是转录信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化所必需 的，称为3'非翻译区。RNA聚合酶通过聚腺苷酸化发生位点转录编码DNA序列。
[0045] 在一个实施方案中，T-DNA不包括可选择、可筛选或可记录的标记基因。或者，待 转移的DNA可含有可选择、可筛选或可记录的标记基因，尽管在本发明的某些实施方案中， 仅仅为了在再生发生后标记的存在而选择或筛选植物组织。这些遗传组件在本文中也称 为功能性遗传组件，因为它们产生在转化植物鉴定中起作用的产物或具有农艺学用途的产 物。利用选择组分的DNA在可再生植物组织（尤其是已再生组织）中起作用，以产生赋予 植物组织抵抗别的毒性化合物的化合物。用作可选择、可筛选或可记录标记的目标基因包 括但不限于编码GUS的UidA、编码绿色荧光蛋白（GFP)的gfp、花色素苷生物合成相关基 因（Cl,B-peru)、萤光素酶（LUX)基因和赋予例如卡那霉素等抗生素抗性的基因（Dekeyser 等，1989)和赋予例如草甘膦等除草剂抗性的基因（Della-Cioppa等，1987)。其它选择方法 也可采用，包括但不限于草胺膦（phosphinothricin)耐受性、双丙氨膦耐受性和阳性选择 机制，它们也都落入本发明的范围之内。
[0046] 本发明可以与任何合适的植物转化质粒或载体一起使用，所述质粒或载体含有可 选择或可筛选标记和所述相关调节元件，以及一个或多个核酸，其表达方式足以赋予特定 性状。本发明所包括的合适的具有农艺学价值的结构基因的实例包括但不限于昆虫或病虫 害耐受性基因、除草剂耐受性基因、品质改良基因（例如产量、营养增强、环境或胁迫的耐 受性）、或者在植物生理、生长、发育、形态或植物产物方面的任何所需改变的基因。
[0047] 或者，DNA编码序列可通过编码非翻译RNA分子而影响这些表型，其可导致对内源 基因表达的定向抑制，例如通过反义或共抑制介导的机制（参见例如Bird等，1991)。RNA 也可以是催化性RNA分子（例如核酶），所述分子经改造可切割所需内源mRNA产物（参见 例如Gibson和Shillitoe，1997)。更具体地讲，有关基因表达在植物细胞中的反义调节的 描述，可参见美国专利5, 107,065 ;有关植物中通过dsRNA转录所致的基因抑制的描述，可 参见美国专利6, 506, 559、美国专利申请公布说明书号2002/0168707A1和美国专利申请顺 序号 09/423, 143 (参见TO98/53083)、09/127, 735 (参见TO99/53050)和 09/084, 942 (参 见WO99/61631)，所有这些文献都通过引用结合到本文中。因此，能产生表达目标表型或形 态变化的蛋白质或mRNA的任何基因都可用于本发明的实践。
[0048] 可通过本发明方法引入的示例性核酸包括例如来自另一物种的DNA序列或基因， 或者甚至是原来存在于相同物种、但通过遗传工程方法（而非传统繁殖或育种技术）掺入 到受体细胞的基因或序列。然而，术语外源也指在所转化的细胞中通常不存在的基因，或者 仅在转化DNA区段或基因的某种形式、结构等中不存在的基因，或者是当人们需要时（例如 过量表达）正常存在的基因。因此，术语"外源"基因或DNA是指引入受体细胞的任何基因 或DNA区段，无论类似基因在所述细胞中是否已经存在。外源DNA所包括的DNA类型可包 括植物细胞中已经存在的DNA、来自另一植物的DNA、来自不同生物体的DNA或外部产生的 DNA(例如含基因的反义信息的DNA序列）或编码基因的合成或修饰形式的DNA序列。
[0049] 将DNA引入细胞的技术是本领域技术人员众所周知的，可分为包括但不限于 下列类型：（1)化学方法；（2)物理方法，例如显微注射、电穿孔和微弹轰击；（3)病毒载 体；(4)受体介导机制；和（5)根瘤菌介导（例如土壤杆菌介导）的植物转化方法（例如 Broothaerts等，2005)。
[0050] 对于土壤杆菌介导的转化，在构建植物转化载体或构建体之后，将体外制备成DNA 组分的所述核酸分子引入合适的宿主（例如大肠杆菌（E.coli))中并与另一合适宿主（例 如土壤杆菌）交配，或直接转化到感受态土壤杆菌。这些技术是本领域技术人员众所周知 的，已经描述了用于包括以下许多植物系统在内的所述技术：大豆、棉花和小麦（参见例如 美国专利号5, 569, 834和5, 159, 135和WO97/48814,通过引用全部结合到本文中）。
[0051] 本发明包括用细菌菌株将一个或多个遗传组件引入植物中。本领域技术人员将 会知道土壤杆菌介导的转化方法在这类过程中的应用。携带Ti质粒或Ri质粒的根癌土 壤杆菌和发根土壤杆菌（Agrobacteriumrhizogenes)的许多野生型菌株和解武装菌株 (disarmedstrain)可用于将基因传递给植物。优选的土壤杆菌宿主分别含有解武装Ti质 粒和Ri质粒（其不含引起根瘤或发根的癌基因），所述质粒用作载体并含有随后引入植物 的目标基因。优选的菌株可包括但不限于来自C58菌株的根癌土壤杆菌，胭脂碱型菌株（可 用于介导将DNA传递给植物细胞）、章鱼碱型菌株（例如LBA4404)或琥珀碱型菌株（例如 EHAlOl或EHA105)。可以修饰与植物具有天然相互作用的其它细菌（例如中华根瘤菌、根瘤 菌和中间根瘤菌）以介导将基因传递给各种不同植物。可以使这些植物相关的共生菌成为 感受态，用于通过同时得到解武装Ti质粒和合适双元载体而进行基因传递Oroothaerts 等，2005)。这些菌株在植物转化中的应用已有报道，这些方法是本领域技术人员熟知的。
[0052] 外植体可来自单一基因型或来自基因型组合。任何可发芽的玉米种子都是有活力 的原料。在一个优选的实施方案中，来自植物杂种的优良外植体可用作外植体。例如，可用 含有几种基因型的杂种胚产生具有高培养响应（更高频率的胚性愈伤组织形成、生长率、 植物再生率等）的快速生长的细胞系。在一个实施方案中，杂交育种的F1杂种或第一代后 代可用作供体植物并与另一基因型杂交。本领域技术人员知道，当两个近交系杂交时会产 生杂种优势（在本文中也称为"杂种活力"）。因此，本发明包括使用来自三系杂交的外植 体，其中至少一个或更多近交系是高度可再生和可转化的，而且三系杂交外植体的转化和 再生频率超过近交系各自的频率。其它组织也可用于本发明的实践。外植体可包括成熟胚、 未成熟胚、分生组织、愈伤组织或可转化和可再生的任何其它组织。
[0053] 在转化过程中任何合适的植物培养基都可能使用。这些培养基的实例可包括但不 限于Murashige和Skoog(1962)，N6(Chu等，1975);Linsmaier和Skoog(1965);Uchimiya 和Murashige(1962);Gamborg氏培养基（1968),D培养基（Duncan等，1985),McCown氏 Woody植物培养基（McCown和Lloyd, 1981)，Nitsch和Nitsch(1969),以及Schenk和 Hildebrandt(1972)或这些补充培养基的衍生物，以及以下描述的多种培养基。本领域技术 人员知道，可以针对具体的目标变种来优化培养基和培养基补充物（例如用于转化和再生 的营养物和生长调节剂）和其它培养条件（例如培养时的光强度、PH和培养温度）。
[0054] 在包含苗、或者包含苗和根的小植株再生出来之后，可对小植株或小植株部分施 用选择剂，例如如果选择标记基因与GOI-起转化到原始靶植物细胞中的话，或者如果GOI 本身就编码选择标记的话。因此，当通过本发明方法产生植物后，可根据本发明将选择剂施 用于所述植物，以便测定或鉴定显示有用特性的转化植物。
[0055] 本发明也包括有效处理再生植株的方法，所述方法允许鉴定含有GOI的转化植 物。这些方法简化并理顺了再生和培育推定转化植物群体的过程，节省了过程所需的时间、 空间和费用，并使该方法成为商业上可行的方法。
[0056] 在一个实施方案中，将植物靶组织（例如未成熟玉米胚（IE))与包含GOI的土壤 杆菌菌株在23°C共培养例如1-3天，然后在相同的共培养培养基或愈伤组织增殖培养基 上，在30°C继续再培养?7-10天。观察胚，以便鉴定哪些胚"有反应"，即产生可再生而形成 小植株的胚性愈伤组织。然后，将具有愈伤组织的有反应的胚（通常是盾片愈伤组织）从 共培养物中移入第一预再生培养基或第一再生培养基中，用合适的温度、光照和营养的培 养条件，让愈伤组织进一步生长、分化和再生。可将愈伤组织放入半固体再生培养基中或放 在其上。或者，可将它们放在接触液体再生培养基的支持物（例如培养板中的垫子（felt) 和/或滤纸）上，使愈伤组织可以生长和分化。
[0057] 如有需要，可以培养接种的胚，例如在30°C暗培养1-2周，包括移至新鲜营养培养 基。在暗培养后，培养物可在再生培养基中在光照黑暗受替周期中生长，例如在16/8光照 /黑暗周期下生长1-3周，在约27°C，光强度为约100μE，或根据所研究的植物种或变种的 合适条件和植物组织培养领域技术人员的知识。通常，在开始共培养的1-3周内植物开始 再生，尤其是当存在生长的愈伤组织阶段（callusphaseofgrowth)时。该方法也可包括 预再生步骤，其包括使用含有比愈伤组织增殖培养基中的植物生长素水平更低的基础植物 组织培养基。
[0058] 在半固体或液体培养基上培养和再生约2-3周后，可将从单个外植体（例 如未成熟胚（IE))再生出的植株移入单个生长培养基容器中。一个这样的实例是 PHYTATRAY(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，其包含半固体或液体植物组织培养再生培养基 并让其生长约4周，然后将所得植株移入生长培养基（例如土壤中的生长穴盆）中以便进 行壮苗。因为移栽到土壤中是时间和劳动密集型过程，所以最好在移栽之前筛选各植株，或 者甚至在将它们放入PHYTATRAY之前就筛选出存在GOI或其它目标性状的植株。在选择压 力不存在时，再生小植株的数量可以比在愈伤组织生长和植物再生期间使用了选择剂的类 似实验高出20-50倍。因此，提供了处理大量植物的方法，例如将其从组织培养期移至非无 菌条件下生长时。本发明的再一个实施方案是在非无菌条件下使用园艺穴盆或分离的培养 管或盘，以允许小植株生长并进行分析。这些小植株还可以这样培养：无需标记所有单个植 株、而是对生长的植株进行适当分组，以便容易找出给定植株及其组织之间的相关性，所述 组织经历一种或多种测定或筛选以鉴定含GOI的转化植物。
[0059] 在一个实施方案中，可米用基于PCR的筛选，以便在移入生长培养基（包括液体 生长培养基，例如在PHYTATRAY中）之前就能排除非转化植物。因此，例如在用细菌菌株 转化时如果使用约5000个未成熟玉米胚，则可产生约25, 000株植物，需要约5, 000个 PHYTATRAY。如果达到约10%的转化频率，处于PHYTATRAY生长期的再生植株的初次筛选 将得到约2500株推定的转化植物，相当于500个有反应的胚或需要约500个PHYTATRAY， 它们可移入土壤中的生长穴盆。筛选方法可包括将来自各个Phytatray或任何其它生长容 器（例如穴盆）的再生植株的组织合并起来。设计合并的组织可用于通过分析多个合并 组织来鉴定群体的单个成员，而无需单独分析群体的每个成员。一个合并的方法是将来自 PHYTATRAY或类似生长容器中的外植体（优选IE)的所有植物分组，并弃去阴性容器，因而 极大地减少了植物处理和检测相关工作量。合并在一起的植株数量还可进一步增加到PCR 测定的检出限。
[0060] 可处理生长穴盆或将其分组，以提高进一步筛选步骤的效率，而且不需要给每个 再生植株做标签。例如可将穴盆分组排列，以对应于测定模式使用的微量滴定板，例如植 物生长在96个穴盆组中，对应于96孔板。这可快速准确地建立测定结果与植物（测定组 织正是自这些植物分离的）之间的关系。在某些实施方案中，在推定转化再生的无标记植 物中检测GOI存在与否的测定可选自基于PCR的测定、DNA印迹杂交、DNA测序、RNA印迹、 蛋白质印迹、免疫测定和在与土壤杆菌共培养期间接触靶组织的转基因DNA区段所编码的 酶活性测定。在一个具体的实施方案中，测定是基于PCR的测定。在某些实施方案中，基 于PCR的测定或其它测定是在自再生植株分离的植物组织上进行的，其中再生植株生长在 PHYTATRAY或等同物上，随后才移栽到基于土壤的生长培养基上。
[0061] 对于得到无标记转基因植物而言，本发明的方法比其它典型方法更有效，所述其 它方法例如土壤杆菌介导的方法，使用一个或多个含GOI的T-DNA和可选择或可筛选标记 (图1)。本发明的各实施方案提供的优势包括：
[0062] 1.转化构建体较小，简化了克隆过程。
[0063] 2.标记基因表达盒的消除释放了标记盒所需的表达元件，减少了因重复元件存在 所致的重组稳定性的有关问题。标记盒中重复调节元件的消除也可降低基因沉默的可能 性。
[0064] 3.Rtl植物的筛选方法更简化。在现有方法中，必须筛选至少两个元件（G0I和选择 标记基因）。在本发明方法中，无需筛选标记。另外，需要筛选GOI阳性植物以判定标记基 因插入序列是否与GOI插入序列连锁，并且通常发现连锁，这会干扰对下一代缺乏选择标 记的植物的鉴别能力。相反，连锁却并非本发明方法的问题。
[0065] 4.也发现在后代中效率提高。对于现有方法（例如2-T转化方法），必须筛选一 大群F1植物或R1植物才能鉴定GOI阳性的无标记植物。对于通过本发明方法产生的植物， 不需要标记基因的分离。
[0066] 5.允许更快速选出最好的含GOI事件、而不存在选择标记基因，因而有助于多个 GOI的有效堆积，例如当选择标记基因编码目标农艺学性状时。
[0067] 本发明提供有效产生无标记转基因植物的方法，通常当原始靶外植体接触外源核 酸后7-10周内，能够在基于土壤的培养基上生长。本发明的高通量方法允许开发有效的无 选择转化系统。具体地讲，处理再生组织和再生植株的简化允许许多步骤的机械化并能节 省时间、金钱和人机工程总费用。在每次转化实验中，本系统使用约100个胚，就可产生约 4-6个可用的无标记转化事件（即单拷贝事件和无载体骨架事件），因此加快了转化植物产 物的流程。
[0068]实施例
[0069] 下列实施例用于说明本发明的实施方案。本领域技术人员应当知道，下列实施例 中公开的技术代表本发明人发现的并在本发明实践中行之有效的技术。然而，根据本说明 书，本领域技术人员应当知道，在不偏离本发明的构思、精神和范围的前提下，可以对所公 开的具体实施方案进行许多改动，而仍能得到同样或类似的结果。更具体地讲，应当清楚， 某些化学和生理相关的试剂可以替代本文所述的试剂，而仍可达到相同或类似的结果。本 领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改都视为在本发明的精神、范围和构思 之内，如同所附权利要求书所限定的那样。
[0070] 实施例1
[0071] 无标记转化
[0072] 可通过根瘤菌介导的方案进行可再生的未成熟玉米胚的转化，所述方案的一般性 描述例如参见Cai等（美国专利申请公布说明书20040244075)。具体地讲，使用改进的土 壤杆菌介导的方法。从玉米穗中选出大小范围为1.9-2. 5mm(例如约2. 3mm)的未成熟胚 并与ABI土壤杆菌菌株C58共培养，以介导DNA向含有目标重组构建体（例如同时含有处 于肌动蛋白启动子表达控制之下的⑶S和CP4EPSPS的pM0N93040)的植物细胞转移，从而 允许对转化细胞和部分（sector)两者进行目测分析，并允许使用Weathermax?草甘膦喷 洒作为替代品，用于随后的再生后筛选，再进行转化植物的基于PCR的筛选的证实试验。也 可使用较大的胚（例如大小为约2. 5mm或最多至约3. 2mm)，而且最好是通过在组织培养的 预再生和再生期之前减少愈伤组织增殖而使每个胚产生很少植株。以下所用培养基组成 见下表1。用土壤杆菌接种后，将胚移至Lynx1947或Lynx1898,在23°C共培养1-3天， 然后在30°C在相同平板或愈伤组织增殖培养基（例如Lynx1316)上培养7-14天，最后 在预再生培养基（Lynx1844 ;2232 ;2197)或再生培养基（Lynx1344、2282、2379等）上 培养。用下列两种方法进行植物的最后培育：1)将来自每个胚源性愈伤组织的植株移至 含Lynx1607的Phytatray?上或2)将来自每个胚源性愈伤组织的植株移至含液体Lynx 2168的Phytatray?上。让植株在Phytatray?中生长约4周，然后移至穴盆（QPlugs,产 自InternationalHorticulturalTechnologies，Hollister，CA)。在将植株移栽到穴盆 前1周，当植株仍在Phytatray?中时，自植株上采样并进行测定，以去除掉无GOI的植株。 塞植后（post-plugging)大约10天，自各植株采样，进行DNA印迹分析，鉴定GOI阳性植株 并保留它们，使其进一步生长发育。
[0073]

【权利要求】
1. 一种鉴定转基因玉米植物的方法，所述方法包括： (a) 获得用含有目标核酸序列的DNA区段转化的玉米植物细胞； (b) 不经过针对所述DNA区段存在的初次筛选，就从所述细胞再生出多个玉米植物或 分化的玉米植物部分； (c) 从所述多个玉米植物或分化的玉米植物部分中鉴定出至少第一转基因玉米植物 或转基因分化植物部分。
2. 权利要求1的方法，其中所述DNA区段不包含选择标记或目测标记基因。
3. 权利要求1的方法，其中所述植物在固体培养基、液体培养基或者固体与液体培养 基组合上生长而得以再生。
4. 权利要求3的方法，其中所述植物通过仅在液体培养基上生长而得以再生，然后鉴 定所述转基因玉米植物或转基因分化植物部分。
5. 权利要求4的方法，其中将细胞与GOI接触之后、鉴定转基因植物或转基因植物部 分之前仅生长在液体培养基中的细胞的转化频率，与将细胞与GOI接触之后、鉴定转基因 植物或转基因植物部分之前在固体培养基、半固体培养基、土壤或者固体培养基、半固体培 养基、液体培养基和/或土壤的组合中生长的细胞的转化频率进行比较，前者相对更高。
6. 权利要求1的方法，其中所述植物细胞是未成熟玉米胚细胞。
7. 权利要求6的方法，其中所述未成熟玉米胚的长度为约1. 5 mm至约3. 5 mm。
8. 权利要求7的方法，其中所述未成熟玉米胚的长度为约1. 9 mm至约2. 3 mm。
9. 权利要求1的方法，所述方法在步骤（b)与（c)之间还包括： (1) 将所述多个玉米植物或分化的植物部分放入包含生长培养基或水的培养管或生 长穴盆中，同时保留玉米植物各自的识别标记；和 (2) 让所述植物或植物部分经历至少第一测定，看所述DNA区段是否存在，从而根据 所述测定结果来鉴定一个或多个植物或植物部分是转基因的。
10. 权利要求9的方法，其中所述测定选自DNA印迹杂交、PCR、DNA测序、RNA印迹、蛋 白质印迹、免疫测定和所述DNA区段所编码的酶活性测定。
11. 权利要求9的方法，其中所述测定是在将所述再生植物移入土壤前进行的。
12. 权利要求10的方法，其中鉴定缺乏目标核酸序列的推定转化的玉米植物或分化 的植物部分，其中在包含来自所述多个玉米植物或分化的植物部分的合并核酸亚类的植物 组织上进行所述测定。
13. 权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于6周使所 述玉米植物或玉米植物部分再生。
14. 权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于4周使所 述玉米植物或玉米植物部分再生。
15. 权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于3周使所 述玉米植物或玉米植物部分再生。
16. 权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于2周使所 述玉米植物或玉米植物部分再生。
17. 权利要求1的方法，其中在所述DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于1周使所 述玉米植物或玉米植物部分再生。
18. 权利要求1的方法，其中通过细菌介导的转化、电穿孔、PEG介导的转化或粒子轰 击法，将所述DNA区段引入所述玉米植物细胞中。
19. 权利要求18的方法，其中所述细菌介导的转化是由选自土壤杆菌 细胞、根瘤菌细胞、中华根瘤菌（ S'iflorAizoAitt?)细胞和中 间根瘤菌（ifesorAizoAiwa?)细胞的细菌细胞介导的。
20. 权利要求1的方法，所述方法还包括在植物或植物部分再生后、使源自第一玉米 植物细胞的玉米植物或植物部分经历培养条件的步骤，所述条件选择或允许筛选目标核酸 序列的存在与否。
21. 权利要求1的方法，其中所述生长培养基是固体培养基。
22. 权利要求21的方法，其中所述生长培养基是土壤。
23. 权利要求1的方法，其中所述再生植物或分化的植物部分就所述DNA区段的存在 而言是一致的。
【文档编号】G01N33/53GK104357535SQ201410643281
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2007年8月31日 优先权日:2006年8月31日
【发明者】J.R.劳特 申请人:孟山都技术有限公司