蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法及生产工艺对核苷酸破坏程度的评价方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，采用以下步骤：(1)分别制备核苷酸混合标准液及碱基混合标准液，(2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的核苷酸混合标准液及碱基混合标准液作为参照液，采用高效液相色谱法通过洗出峰面积比较得到样品中游离核苷酸及游离碱基的含量值。本发明开发出使用高效液相色谱测定单细胞蛋白原料中5种碱基(胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤)，5种核苷酸(胞苷酸、尿苷酸、鸟苷酸、肌苷酸、腺苷酸)，5种核苷(胞苷、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷)。然后根据碱基与核苷酸、核苷之间的关系判断生产工艺对核苷酸的破坏程度。
【专利说明】蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法及生产工艺对核苷 酸破坏程度的评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸水解物测定【技术领域】，尤其属于单细胞蛋白生产质量控制领域。
【背景技术】
[0002] 单细胞蛋白（Singlecellprotein简称SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白，是利 用工业废水、废气、天然气、石油烷烃类、农副加工产品以及有机垃圾等作为培养基，培养酵 母、非病源性细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体，然后经过净化干燥处理后制成，是食品工 业和饲料工业重要的蛋白质来源。
[0003] 单细胞蛋白产品含有丰富的核苷酸，市场上酵母类的产品是饲料工业主要的核苷 酸提供者。由于工艺特点的原因，自溶酵母、酶解酵母、水解酵母等产品含有较多游离态的 核酸水解物，研究发现现有很多酵母产品既含有游离核苷酸，也含有较高含量的碱基。游离 核苷酸能被动物快速吸收，发挥重要生理功能，碱基则会对动物肝脏肾脏造成不良影响。碱 基含量过多意味着生产过程当中有重要营养价值的核苷酸被酶解、水解或微生物代谢。这 会造成酵母产品的质量下降，提供的核苷酸含量降低，进而能为动物提供免疫功能的作用 减少，同时增加的碱基如腺嘌呤则会对动物造成毒性。
[0004] 判断单细胞蛋白的生产工艺对核苷酸的破坏程度，开发既能反应工艺条件的优劣 又能为产品质量控制提供科学的、反映营养价值的评估方法就变得极为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种测定单细胞蛋白中游离核酸含量的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：蛋白产品中游离核酸水解物的 测定方法，其特征在于采用以下步骤：
[0007] (1)分别制备核苷酸混合标准液及碱基混合标准液，
[0008] (2)配制待测样品的溶液，以步骤1所述的核苷酸混合标准液及碱基混合标准液 作为参照液，采用高效液相色谱法通过洗出峰面积比较得到样品中游离核苷酸及游离碱基 的含量值。
[0009] 所述核苷酸混合标准液是通过分别量取尿苷酸标准储备液2. 0ml、腺苷酸标准储 备液2. 0ml、鸟苷酸二钠标准储备液2. 0ml、胞苷酸标准储备液2. 0ml、肌苷酸标准储备液 2. 0ml、鸟苷标准储备液I. 0ml、腺苷标准储备液I. 0ml、尿苷标准储备液I. 0ml、肌苷标准储 备液I. 〇ml、胞苷标准储备液I.Oml至IOOml容量瓶内，加水定容至100ml，
[0010] 所述尿苷酸标准储备液、腺苷酸标准储备液、鸟苷酸二钠标准储备液、胞苷酸标准 储备液、肌苷酸标准储备液、鸟苷标准储备液、腺苷标准储备液、尿苷标准储备液、肌苷标准 储备液和胞苷标准储备液单独配制且浓度分别为0. 8?I. 2mg/ml。
[0011] 所述碱基混合标准液是通过分别量取胞嘧啶标准储备液I. 0ml、尿嘧啶标准储备 液I. 0ml、鸟嘌呤标准储备液10. 0ml、胸腺嘧啶标准储备液I. 0ml、腺嘌呤标准储备液I.Oml 至250ml容量瓶内，加水定容至250ml，
[0012] 其中，胞嘧啶标准储备液浓度为3. 0?5.Omg/ml;尿嘧啶标准储备液浓度为 3.O?5.Omg/ml;鸟嘌呤标准储备液浓度为0. 3?0. 5mg/ml;胸腺嘧啶标准储备液浓度为 3.O?5.Omg/ml;腺嘌呤标准储备液浓度为3.O?5.Omg/ml。
[0013] 所述步骤2中配制待测样品的溶液的操作包括：称取0. 1000克粉碎细度达60目 的样品于玻璃管内，加水15ml，漩涡震荡3次，每次lmin，每次间隔20min;超声20min，并再 次漩涡震荡；12000g高速离心15min;取上清液稀释一倍，混匀后保存过滤上机测定。
[0014] 所述步骤2中的高效液相色谱法采用流动相A为0.IM的磷酸二氢钾溶液，流动相 B为质量含量为25 %的甲醇溶液。
[0015] 所述步骤2中的高效液相色谱法采用如下梯度洗脱程度：
[0016]
【权利要求】
1. 蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于采用以下步骤： (1) 分别制备核苷酸混合标准液及碱基混合标准液， (2) 配制待测样品的溶液，以步骤1所述的核苷酸混合标准液及碱基混合标准液作为 参照液，采用高效液相色谱法通过洗出峰面积比较得到样品中游离核苷酸及游离碱基的含 量值。
2. 根据权利要求1所述的蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于：所述 核苷酸混合标准液是通过分别量取尿苷酸标准储备液2. Oml、腺苷酸标准储备液2. Oml、鸟 苷酸二钠标准储备液2. 0ml、胞苷酸标准储备液2. 0ml、肌苷酸标准储备液2. 0ml、鸟苷标准 储备液I. 〇ml、腺苷标准储备液I. 0ml、尿苷标准储备液I. 0ml、肌苷标准储备液I. 0ml、胞苷 标准储备液I. Oml至IOOml容量瓶内，加水定容至100ml， 所述尿苷酸标准储备液、腺苷酸标准储备液、鸟苷酸二钠标准储备液、胞苷酸标准储备 液、肌苷酸标准储备液、鸟苷标准储备液、腺苷标准储备液、尿苷标准储备液、肌苷标准储备 液和胞苷标准储备液单独配制且浓度分别为〇. 8?I. 2mg/ml。
3. 根据权利要求1所述的蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于：所述 碱基混合标准液是通过分别量取胞嘧啶标准储备液I. 〇ml、尿嘧啶标准储备液I. 0ml、鸟噪 呤标准储备液10. 〇ml、胸腺嘧啶标准储备液I. 0ml、腺嘌呤标准储备液I. Oml至250ml容量 瓶内，加水定容至250ml， 其中，胞嘧啶标准储备液浓度为3. 0?5. Omg/ml ;尿嘧啶标准储备液浓度为3. 0? 5. Omg/ml ;鸟嘌呤标准储备液浓度为0. 3?0. 5mg/ml ;胸腺嘧啶标准储备液浓度为3. 0? 5. Omg/ml ;腺嘌呤标准储备液浓度为3. 0?5. Omg/ml。
4. 根据权利要求1所述的蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于所述 步骤2中配制待测样品的溶液的操作包括：称取0. 1000克粉碎细度达60目的样品于玻璃 管内，加水15ml，漩涡震荡3次，每次lmin，每次间隔20min ;超声20min，并再次漩涡震荡； 12000g高速离心15min ;取上清液稀释一倍，混匀后保存过滤上机测定。
5. 根据权利要求1所述的蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于：所述 步骤2中的高效液相色谱法采用流动相A为0. IM的磷酸二氢钾溶液，流动相B为质量含量 为25 %的甲醇溶液。
6. 根据权利要求5所述的蛋白产品中游离核酸水解物的测定方法，其特征在于：所述 步骤2中的高效液相色谱法采用如下梯度洗脱程度：
O
7. 生产工艺对核苷酸破坏程度的评价方法，其特征在于包括如下步骤： 设定Ka值及K值，其中，
总游离碱基是游离胞嘧啶、游离尿嘧啶、游离鸟嘧啶、游离胸腺嘧啶和游离腺嘌呤的总 和；总游离核苷是游离鸟苷、游离腺苷、游离尿苷、游离肌苷、游离胞苷的总和；总游离核苷 酸是游离尿苷酸、游离腺苷酸、游离鸟苷酸二钠、游离胞苷酸、游离肌苷酸的总和； 按下表以心及K值共同评价蛋白产品的质量及生产工艺，
8. 根据权利要求7所述的评价方法，其特征在于：游离核苷酸、游离核苷及游离碱基的 含量通过权利要求1?6任一所述的方法测定且计算得到。
【文档编号】G01N30/02GK104515817SQ201410652446
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年11月17日
【发明者】许建刚 申请人:上海征泰饲料有限公司