一种检测邻苯二甲酸单甲酯的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测邻苯二甲酸单甲酯的方法及试剂盒，属于生物检测领域。本发明通过化学方法合成了MMP人工抗原，再用MMP人工抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合筛选得到分泌MMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株；再以合成的MMP人工抗原作为包被抗原、MMP单克隆抗体作为一抗创建了检测MMP的间接竞争ELISA方法和试剂盒，可用于样品中的MMP测定，该方法具有操作简单、费用低廉、快速灵敏等优点。
【专利说明】一种检测邻苯二甲酸单甲酯的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及一种快速、高效、廉价检测邻苯二甲酸单甲酯 (MMP)含量的免疫学方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸单甲醋（Monomethyl phthate)，简称MMP，分子式为C9H8O4,分子量为 180,邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs)，是邻苯二甲酸二甲酯的最终代谢产物。研宄发现，PAEs 为环境内分泌干扰物，具有生殖毒性、致癌、致畸等遗传毒性，因而各国均加强了对该物质 的检测力度。动物实验表明：当动物口服邻苯二甲酸二丁酯（DBP)48h之内，有大约80%的 DBP代谢到尿液中，主要产物为邻苯二甲酸单丁酯（MBP)，比例为88%，代谢物主要以结合 态形式存在。有研宄者对30人的尿液进行检测发现尿液中的邻苯二甲酸单酯平均含量大 小依次为邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP) >邻苯二甲酸单甲酯（MMP) >邻苯二甲酸单 乙酯（MEP) >邻苯二甲酸单丁酯（MBP) >邻苯二甲酸单丁卞酯（MBzP)，其中某一机体内MMP 含量高达1808. 9 μ g/L。
[0003] 目前，PAEs常用的检测方法有液相色谱法、气相色谱法、液质联用、气质联用等，这 些方法均能在一定浓度范围内实现对MMP的检测，但是使用上述这些方法进行检测时大多 要对样品进行处理，且检测的过程复杂，费时费事，成本较高，灵敏度较低。因此本技术通过 制备MMP的单克隆抗体使用间接竞争ELISA方法实现对MMP含量进行快速高效大批量的检 测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种分泌MMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明的目的 还在于提供一种检测MMP的间接竞争ELISA方法及试剂盒。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006] 一种分泌MMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过包含如下步骤的方法制备得到： [0007] (1)取用MMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞悬液混合。
[0008] (2)离心弃上清，在聚乙二醇（PEG)作用下进行细胞融合，然后用DMEM培养基来终 止反应，重复该步骤。
[0009] (3)离心弃上清，加入HAT培养基，铺至细胞板中进行培养。
[0010] ⑷融合后第7天观察，标出有融合细胞的孔，记录位置和克隆数，补加 HAT培养 基；2周后，全量换液，待细胞长至板底1/10时做检测。
[0011] (5)选择效价最高的并且对MMP具有特异性的阳性细胞进行克隆，克隆化结束后， 建株得到分泌MMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0012] 步骤（1)中所述的MMP人工抗原优选通过包含如下步骤的方法合成：用5mL DMF 完全溶解72mg(4mmol)MMP，再加入120mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS)和160mg N，K -二环 己基碳二亚胺（DCC)，常温下搅拌12h。离心机转速5000g离心5min收集上清。往上清中 加入IOmL含有120mg BSA的0. 2mol/L pH 9. O硼酸盐缓冲液。在磁力搅拌器上搅拌5h。 将所得反应液用低温冷冻离心机l〇〇〇〇g离心5min，得到不纯净的人工抗原MMCP-BSA，再用 葡聚糖凝胶过滤得到纯净的人工抗原MMCP-BSA。
[0013] -种检测MMP的间接竞争ELISA方法，包括如下步骤：
[0014] (1)试剂1用试剂2稀释至2 μ g/mL，100 μ L/孔包被酶标板，空白对照孔加100 μ L 试剂2,4°C过夜。
[0015] (2)用试剂3进行洗涤操作，每孔200 μ L洗涤90s，倒出孔内液体，拍干，洗涤3次 后往酶标板中加入试剂4, 250 μ L/孔，37°C温育lh。
[0016] (3)用试剂3洗涤后，加入不同浓度的MMP标准品和试剂6各50 μ L，另外加几孔 用50 μ L试剂5溶解的检测样品和50 μ L试剂6,再设几孔阳性对照（50 μ L试剂5+50 μ L 试剂6)，37°C温育Ih。
[0017] (4)用试剂3洗涤后，每孔加入100 yL试剂7, 37°C温育Ih。
[0018] (5)用试剂3洗涤后，加入新鲜配制的试剂8,100 μ L/孔，室温避光30min。
[0019] (6)每孔加50 μ L试剂9,终止反应，用酶标仪测定492nm处的吸光值。
[0020] (7)以MMP标准品的浓度为横坐标（X)，对应的抑制率I (%)为纵坐标（y)，做得 y = bln (X)+a直线，抑制率I (%)通过如下公式计算得到：
[0021]
【权利要求】
1. 一种分泌邻苯二甲酸单甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于通过包含如下 步骤的方法制备得到： (1) 取用MMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞悬液混合； (2) 离心弃上清，在聚乙二醇作用下进行细胞融合，然后用DMEM培养基来终止反应，重 复该步骤； (3) 离心弃上清，加入HAT培养基，铺至细胞板中进行培养； (4) 融合后第7天观察，标出有融合细胞的孔，记录位置和克隆数，补加HAT培养基；2 周后，全量换液，待细胞长至板底1/10时做检测； (5) 选择效价最高的并且对MMP具有特异性的阳性细胞进行克隆，克隆化结束后，建株 得到分泌MMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2. 根据权利要求1所述的分泌邻苯二甲酸单甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特 征在于：步骤（1)中所述的MMP人工抗原通过包含如下步骤的方法合成：用5mLDMF溶解 4mmolMMP，再加入120mgNHS和160mgDCC，搅拌12h;5000g离心5min收集上清，往上清 中加入10mL含有120mgBSA的0. 2mol/LpH9. 0硼酸盐缓冲液，搅拌5h;将所得反应液 10000g离心5min，得到不纯净的人工抗原MMCP-BSA，再用葡聚糖凝胶过滤得到纯净的人工 抗原MMCP-BSA。
3. -种检测邻苯二甲酸单甲酯的间接竞争ELISA方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 试剂1用试剂2稀释至2yg/mL，100yL/孔包被酶标板，空白对照孔加100yL试 剂2,4°C过夜； (2) 用试剂3进行洗涤操作，每孔200yL洗涤90s，倒出孔内液体，拍干，洗涤3次后往 酶标板中加入试剂4,250yL/孔，37°C温育lh; (3) 用试剂3洗涤后，按如下处理加样：1)MMP标准品：用试剂5梯度稀释的不同浓度的 MMP标准品50yL，2)检测样品：用试剂5溶解的检测样品50yL，3)阳性对照：50yL试剂 5 ;各处理分别再加入50yL试剂6,37°C温育lh; (4) 用试剂3洗涤后，每孔加入100yL试剂7,37°C温育lh; (5) 用试剂3洗涤后，加入新鲜配制的试剂8,100yL/孔，室温避光30min; (6) 每孔加50yL试剂9,终止反应，用酶标仪测定492nm处的吸光值； (7) 以MMP标准品的浓度为横坐标（x)，对应的抑制率I(% 为纵坐标（y)，做得一 条y=bln(x)+a直线，抑制率I(% )通过如下公式计算得到：
式中：A为阳性对照孔的吸光值，化为含有浓度i的MMP孔的吸光值，A^为空白对照孔 的吸光值； 根据检测样品的吸光值计算抑制率y，代入直线即可得出检测样品中MMP的浓度； 上述步骤中试剂1-9分别为： 试剂1 :人工抗原MMCP-BSA; 试剂2 :0? 05mol/LpH9. 6碳酸盐缓冲液； 试剂 3 :含 0? 05%Tween-20 的PBS; 试剂4:1 %卵清蛋白； 试剂5 :含1 %牛血清白蛋白的PBS; 试剂6 :MMP单克隆抗体； 试剂7:HRP标记的羊抗小鼠IgG; 试剂8 :OPD显色液； 试剂 9 :2mol/LH2S04。
4. 根据权利要求3所述的检测邻苯二甲酸单甲酯的间接竞争ELISA方法，其特征在于： 所述的MMP单克隆抗体通过包含如下步骤的方法制备得到：将1-2X106个以MMCP-BSA作为 MMP人工抗原通过权利要求1所述的方法制备的杂交瘤细胞用〇.Olmol/LpH7. 4PBS漂洗2 次，将细胞吹下，200g离心5min弃上清，再用0. 4mLPBS悬浮细胞沉淀，注射到已提前用石 蜡处理过的BALB/c小鼠腹腔内；10-12天后无菌操作收集小鼠腹水，200g离心5min，上清 中含有单克隆抗体；通过二氧化硅吸附法除去腹水中的小颗粒物质、残渣和脂肪滴；辛酸/ 硫酸铵沉淀法纯化腹水，在PBS中透析4-5天，得到纯化腹水，获得MMP单克隆抗体。
5. -种检测邻苯二甲酸单甲酯的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于：包含权利要求3 中所述的试剂1-9和MMP标准品。
【文档编号】G01N33/577GK104480073SQ201410688100
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月25日 优先权日:2014年11月25日
【发明者】可尘娟, 李慧, 袁均林, 丁书茂, 杨旭, 李睿, 陈明清 申请人:华中师范大学