甘磷酸胆碱中杂质的检测方法
【专利摘要】本发明以摩尔浓度为0.0005～0.002mol/L的甲酸铵溶液和乙腈的混合溶液作为流动相A，以摩尔浓度为0.03～0.05mol/L的甲酸铵溶液和乙腈的混合溶液作为流动相B，采用二元梯度洗脱程序，对甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第一液相色谱检测，得到杂质甘油、氯化胆碱和甘油磷脂酰肌醇的含量；采用乙腈和水做为流动相，对甘磷酸胆碱待测样品进行第二液相色谱检测，得到杂质甘油磷脂酰乙醇胺的含量。本发明提供的检测方法可针对不同的杂质建立了不同的色谱条件进行检测，从而得到全部已知杂质的含量，避免了仅测定部分杂质就判断甘磷酸胆碱质量的片面性，实现了全面、有效的监控甘磷酸胆碱质量的目的。
【专利说明】甘磷酸胆碱中杂质的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析领域，尤其涉及甘磷酸胆碱中杂质的检测方法。
【背景技术】
[0002] 老年痴呆症是一种渐进性神经退化性失调症，其主要表现为记忆功能衰减及识别 能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍。研究发现，我国老年痴呆症发病率居高不 下，其中65岁老人中明显痴呆者占2%?5%，而85岁以上的老人中几乎一半患有不同程 度的老年痴呆症。随着世界人口老龄化速度的加快，老年痴呆症已成为危及老年人生命的 第四大病因，严重影响了老年人的身体健康和生活质量。因此，抗痴呆症药物的研究与开发 引起了世界各国医药界的高度重视。
[0003] 研究表明，老年痴呆症的发病机制与神经递质乙酰胆碱的缺乏密切相关，如果能 够提高脑内乙酰胆碱的水平，就可以改善老年痴呆的症状。甘磷酸胆碱能够穿过血脑屏障， 为乙酰胆碱的合成提供必要的胆碱源，促使乙酰胆碱的合成，增加了脑内神经突触间的乙 酰胆碱的含量，从而将海马区、脑皮质和杏仁体与基底前脑区相联系，延长胆碱能受体的作 用，达到治疗老年痴呆症的目的。甘磷酸胆碱在治疗老年痴呆症方面疗效显著，副作用少， 并且具有良好的耐受性和安全性，是一种非常具有市场前景的药物。
[0004] 但是，甘磷酸胆碱在生产及储存的过程中，由于不同的工艺因素和环境因素（如 温度、氧化和光照等）的影响，有可能会产生一些杂质，会直接影响药品的质量，所以，需要 一种分析方法，能够对甘磷酸胆碱中各种杂质的种类及含量进行检测，从而达到控制甘磷 酸胆碱质量的目的。目前还没有能够有效检测甘磷酸胆碱中杂质的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供甘磷酸胆碱中杂质的检测方法，本发明提供的甘磷酸胆碱中 杂质的检测方法能够有效检测出甘磷酸胆碱中的杂质及其含量，实现控制甘磷酸胆碱质量 的目的。
[0006] 本发明提供甘磷酸胆碱中杂质的检测方法，包括以下步骤：
[0007] 将甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第一液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱待测样品溶 液的第一液相色谱图；
[0008] 所述第一液相色谱检测的流动相包括流动相A和流动相B;所述流动相A包括第 一甲酸铵溶液和乙腈，所述第一甲酸铵溶液的摩尔浓度为〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一 甲酸铵溶液和乙腈的体积比为（1?10) : (99?90);
[0009] 所述流动相B包括第二甲酸铵溶液和乙腈，所述第二甲酸铵溶液的摩尔浓度为 0? 03?0? 05mol/L，所述第二甲酸铵溶液和乙腈的体积比为（35?45) : (65?55);
[0010] 根据所述第一液相色谱图与预定的标准样品溶液的第一标准曲线，得到甘磷酸胆 碱待测样品中第一杂质的含量，所述第一杂质包括甘油、氯化胆碱和甘油磷脂酰肌醇；
[0011] 将甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第二液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱待测样品溶 液的第二液相色谱图，所述第二液相色谱的流动相包括乙腈和水，所述乙腈和水的体积比 为（72 ?78) : (28 ?22);
[0012] 根据所述第二液相色谱图与预定的标准样品溶液的第二标准曲线，得到甘磷酸胆 碱待测样品中第二杂质的含量，所述第二杂质包括甘油磷脂酰乙醇胺。
[0013] 优选的，所述第一液相色谱检测中的色谱柱为阳离子交换柱；
[0014] 所述第一液相色谱检测色谱柱的柱温为20?30°C;
[0015] 优选的，所述第一液相色谱检测中流动相A的流速为0. 95?1. 05mL/min;
[0016] 所述流动相B的流速为0? 95?1. 05mL/min。
[0017] 优选的，所述第一液相色谱检测采用梯度洗脱程序；
[0018] 所述梯度洗脱程序为：
[0019] 在< 35min内，流动相A与流动相B的体积比为（93?97) : (7?3);
[0020] 在彡35且< 65min内，流动相A与流动相B的体积比为（45?55) : (55?45);
[0021] 在彡65且< 70min内，流动相A与流动相B的体积比为（35?44) : (65?56);
[0022] 在彡70且< 120min内，流动相A与流动相B的体积比为（0?5) : (100?95)。
[0023] 优选的，所述流动相A的pH值为2. 0?4. 0 ;
[0024] 所述流动相B的pH值为4. 0?6. 0。
[0025] 优选的，所述第二液相色谱检测中流动相的流速为0. 95?1. 05mL/min。
[0026] 优选的，所述第二液相色谱检测中流动相的pH值为2. 0?4. 0。
[0027] 优选的，所述第二液相色谱检测中的色谱柱为氨基键合硅胶色谱柱；
[0028] 所述第二液相色谱检测中色谱柱的柱温为20?40°C。
[0029] 优选的，所述第一液相色谱检测的检测器为蒸发光散射检测器；
[0030] 所述第一液相色谱检测中蒸发光散射检测器的喷雾器温度为70?90°C;
[0031] 所述第一液相色谱检测中蒸发光散射检测器的载气压力为〇? 1?〇? 2MPa。
[0032] 优选的，所述第二液相色谱检测的检测器为蒸发光散射检测器；
[0033] 所述第二液相色谱检测中蒸发光散射检测器的喷雾器温度为70?90°C;
[0034] 所述第二液相色谱检测中蒸发光散射检测器的载气压力为0? 1?0? 2MPa。
[0035] 本发明以摩尔浓度为0. 0005?0. 002mol/L的甲酸铵溶液和乙腈的混合溶液作为 流动相A，以摩尔浓度为0. 03?0. 05mol/L的甲酸铵溶液和乙腈的混合溶液作为流动相B， 采用二元梯度洗脱程序，对甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第一液相色谱检测，得到甘磷酸 胆碱中甘油、氯化胆碱和甘油磷脂酰肌醇的含量；采用乙腈和水做为流动相，对甘磷酸胆碱 待测样品溶液进行第二液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱中甘油磷脂酰乙醇胺的含量。本发 明提供的检测方法可针对不同的杂质建立了不同的色谱条件进行检测，从而得到全部已知 杂质的含量，避免了仅测定部分杂质就判断甘磷酸胆碱质量的片面性，实现了全面、有效的 监控甘磷酸胆碱质量的目的，同时，也提高了甘磷酸胆碱的质量监控标准。
[0036] 实验结果表明，本发明提供的检测方法能够有效检测出全部已知杂质的含量，并 且经过多次检测后，同一物质的保留时间基本不变，说明本发明提供的检测方法具有良好 的可重复性和稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1为本发明实施例1得到的甘磷酸胆碱混合溶液第一液相色谱图；
[0038] 图2为本发明实施例2得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图；
[0039] 图3为本发明实施例3得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图；
[0040]图4为本发明实施例4得到的辅料样品溶液的第一液相色谱图；
[0041] 图5为本发明实施例5得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图；
[0042]图6为本发明实施例6得到的辅料样品溶液的第一液相色谱图；
[0043] 图7为本发明实施例7得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图；
[0044]图8为本发明实施例8得到的辅料样品溶液的第一液相色谱图；
[0045] 图9为本发明实施例9得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图；
[0046]图10为本发明实施例10得到的辅料样品溶液的第一液相色谱图；
[0047] 图11为本发明实施例11得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图；
[0048]图12为本发明实施例12得到的辅料样品溶液的第一液相色谱图；
[0049] 图13为本发明实施例13得到的信噪比为3:1的甘磷酸胆碱待测样品溶液第一次 进样的第一液相色谱图；
[0050] 图14为本发明实施例13得到的信噪比为3:1的甘磷酸胆碱待测样品溶液第二次 进样的第一液相色谱图；
[0051] 图15为本发明实施例13得到的信噪比为3:1的甘磷酸胆碱待测样品溶液第三次 进样的第一液相色谱图；
[0052] 图16为本发明实施例14得到的甘磷酸胆碱混合溶液在柱温20°C下的第一液相色 谱图；
[0053] 图17为本发明实施例15得到的甘磷酸胆碱混合溶液在柱温25°C下的第一液相色 谱图；
[0054] 图18为本发明实施例16得到的甘磷酸胆碱混合溶液在柱温30°C下的第一液相色 谱图；
[0055] 图19为本发明实施例17得到的甘磷酸胆碱混合溶液在流动相A和流动相B的流 速为0. 95mL/min时的第一液相色谱图；
[0056] 图20为本发明实施例18得到的甘磷酸胆碱混合溶液在流动相A和流动相B的流 速为1. 05mL/min时的第一液相色谱图；
[0057] 图21为本发明实施例19得到的放置0小时后的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一 液相色谱图；
[0058] 图22为本发明实施例20得到的放置2小时后甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液 相色谱图；
[0059] 图23为本发明实施例21得到的放置4小时后的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一 液相色谱图；
[0060] 图24为本发明实施例22得到的放置8小时后的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一 液相色谱图；
[0061] 图25为本发明实施例23得到的甘磷酸胆碱标准样品溶液的第二标准液相色谱 图；
[0062] 图26为本发明实施例24得到的氯化胆碱标准样品溶液的第二标准液相色谱图；
[0063] 图27为本发明实施例25得到的甘油磷脂酰肌醇标准样品溶液的第二标准液相色 谱图；
[0064]图28为本发明实施例26得到的甘油磷脂酰乙醇胺标准样品溶液的第二标准液相 色谱图；
[0065]图29为本发明实施例27得到的辅料标准样品溶液的第二标准液相色谱图； [0066] 图30为本发明实施例28得到的甘磷酸胆碱混合溶液a的第二液相色谱图； [0067]图31为本发明实施例29得到的空白溶剂的第二液相色谱图；
[0068]图32为本发明实施例30得到的甘油磷脂酰乙醇胺标准样品溶液的第二液相色谱 图；
[0069]图33为本发明比较例1得到的甘磷酸胆碱混合溶液的第二液相色谱图；
[0070] 图34为本发明比较例2得到的甘磷酸胆碱混合溶液的第二液相色谱图；
[0071] 图35为本发明比较例3得到的甘磷酸胆碱混合溶液的第二液相色谱图；
[0072] 图36为本发明比较例4得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液相色谱图；
[0073] 图37为本发明比较例5得到的氯化胆碱样品溶液的第二液相色谱图；
[0074] 图38为本发明比较例6得到的甘油磷脂酰肌醇样品溶液的第二液相色谱图；
[0075] 图39为本发明比较例7得到的甘油磷脂酰乙醇胺样品溶液的第二液相色谱图；
[0076] 图40为本发明比较例8得到的辅料样品溶液的第二液相色谱图；
[0077] 图41为本发明比较例9得到的甘磷酸胆碱混和样品溶液的第二液相色谱图；
[0078] 图42为本发明实施例31得到的放置0小时后甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液 相色谱图；
[0079] 图43为本发明实施例32得到的放置2小时后甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液 相色谱图；
[0080] 图44为本发明实施例33得到的放置4小时后的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二 液相色谱图；
[0081] 图45为本发明实施例34得到的放置6小时后的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二 液相色谱图；
[0082] 图46为本发明实施例35得到的放置8小时后的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二 液相色谱图；
[0083] 图47为本发明实施例36得到的放置12小时后的甘磷酸胆碱待测样品溶液的第 二液相色谱图；
[0084] 图48为本发明实施例37得到的空白溶剂的第二液相色谱图；
[0085]图49为本发明实施例38得到的辅料样品溶液的第二液相色谱图；
[0086] 图50为本发明实施例39得到的空白溶剂的第一液相色谱图；
[0087] 图51为本发明实施例40得到的甘磷酸胆碱对照溶液a的第一液相色谱图；
[0088] 图52为本发明实施例40得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液a的第一液相色谱图；
[0089] 图53为本发明实施例40得到的甘磷酸胆碱对照溶液a的第二液相色谱图； [0090]图54为本发明实施例40得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液a的第二液相色谱图； [0091]图55为本发明实施例41得到的甘磷酸胆碱对照溶液b的第一液相色谱图；
[0092]图56为本发明实施例41得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液b的第一液相色谱图；
[0093] 图57为本发明实施例41得到的甘磷酸胆碱对照溶液b的第二液相色谱图；
[0094] 图58为本发明实施例41得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液b的第二液相色谱图；
[0095] 图59为本发明实施例42得到的甘磷酸胆碱对照溶液c的第一液相色谱图；
[0096] 图60为本发明实施例42得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液c的第一液相色谱图；
[0097] 图61为本发明实施例42得到的甘磷酸胆碱对照溶液c的第二液相色谱图；
[0098] 图62为本发明实施例42得到的甘磷酸胆碱待测样品溶液c的第二液相色谱图； [0099]图63为本发明实施例43得到的市售甘磷酸胆碱对照溶液的第一液相色谱图； [0100]图64为本发明实施例43得到的市售甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图
[0101] 图65为本发明实施例43得到的市售甘磷酸胆碱对照溶液的第二液相色谱图；
[0102] 图66为本发明实施例43得到的市售甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液相色谱 图。
【具体实施方式】
[0103] 本发明提供了甘磷酸胆碱中杂质的检测方法，包括以下步骤：
[0104] 将甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第一液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱待测样品溶 液的第一液相色谱图；
[0105] 所述第一液相色谱检测的流动相包括流动相A和流动相B;所述流动相A包括第 一甲酸铵溶液和乙腈，所述第一甲酸铵溶液的摩尔浓度为〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一 甲酸铵溶液和乙腈的体积比为（1?10) : (99?90);
[0106] 所述流动相B包括第二甲酸铵溶液和乙腈，所述第二甲酸铵溶液的摩尔浓度为 0? 03?0? 05mol/L，所述第二甲酸铵溶液和乙腈的体积比为（35?45) : (65?55);
[0107] 根据所述第一液相色谱图与预定的标准样品溶液的第一标准曲线，得到甘磷酸胆 碱待测样品中第一杂质的含量，所述第一杂质包括甘油、氯化胆碱和甘油磷脂酰肌醇；
[0108] 将甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第二液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱待测样品溶 液的第二液相色谱图，所述第二液相色谱的流动相包括乙腈和水，所述乙腈和水的体积比 为（72 ?78):(28 ?22);
[0109] 根据所述第二液相色谱图与预定的标准样品溶液的第二标准曲线，得到甘磷酸胆 碱待测样品中第二杂质的含量，所述第二杂质包括甘油磷脂酰乙醇胺。
[0110] 本发明将甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第一液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱待测 样品溶液的第一液相色谱图。本发明优选将甘磷酸胆碱待测样品与水混合，得到甘磷酸胆 碱待测样品溶液。在本发明中，所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的质量浓度优选为40?60g/ L，更优选为50g/L。
[0111] 所述第一液相色谱检测的进样量优选为15?25yL，更优选为17?23yL，最优 选为20uL。
[0112] 在本发明中，所述第一液相色谱检测的色谱柱优选为阳离子交换柱，所述色谱柱 的填料优选为硅胶，具体的，可以使用资生堂CAPCELLPAKSCX液相色谱柱；所述第一液相 色谱检测的色谱柱柱温优选为20?30°C，更优选为22?37°C，最优选为25°C;
[0113] 在本发明中，所述第一液相色谱检测的流动相包括流动相A和流动相B。在本发 明中，所述流动相A包括第一甲酸铵溶液和乙腈，所述第一甲酸铵溶液的浓度为0. 0005? 0. 002mol/L，优选为0. 0008?0. 0015mol/L，更优选为0.OOlmol/L;所述第一甲酸铵溶液和 乙腈的体积比为（1?10) : (99?90)，优选为（1?5) : (99?95)，更优选为1 :99 ;所述流 动相A的pH值优选为2. 0?4. 0,更优选为2. 5?3. 5,最优选为3. 0 ;本发明优选采用酸 性介质对所述流动相A的pH值进行调节，所述酸性介质优选为甲酸；本发明优选采用酸性 溶液作为酸性介质，本发明对所述酸性溶液的浓度和用量没有特殊的限制，能够将所述流 动相A的pH值调节至上述范围即可。
[0114] 在本发明中，所述流动相A的流速优选为0. 95?1. 05mL/min，更优选为0. 98? L02mL/min,最优选为lmL/min〇
[0115] 在本发明中，所述流动相B包括第二甲酸铵溶液和乙腈，所述第二甲酸铵溶液的 浓度为〇. 03?0. 05mol/L，优选为0. 035?0. 045mol/L，更优选为0. 04mol/L;所述第二 甲酸铵溶液和乙腈的体积比为（35?45) : (65?55)，优选为（38?43) : (62?57)，更优 选为40 :60 ;所述流动相B的pH值优选为4. 0?6. 0,更优选为4. 5?5. 5,最优选为5. 0 ; 本发明优选采用酸性介质对所述流动相B的pH值进行调节，所述酸性介质优选为甲酸；本 发明优选采用酸性溶液作为酸性介质，本发明对所述酸性溶液的浓度和用量没有特殊的限 制，能够将所述流动相B的pH值调节至上述范围即可。
[0116] 在本发明中，所述流动相B的流速优选为0. 95?1. 05mL/min，更优选为0. 98? L02mL/min,最优选为lmL/min〇
[0117] 在本发明中，所述第一液相色谱检测优选采用梯度洗脱程序，所述梯度洗脱程序 优选为：
[0118] 在< 35min内，流动相A与流动相B的体积比为（93?97):(7?3);
[0119] 在彡35且< 65min内，流动相A与流动相B的体积比为（45?55):(55?45);
[0120] 在彡65且< 70min内，流动相A与流动相B的体积比为（35?44) : (65?56);
[0121] 在彡70且< 120min内，流动相A与流动相B的体积比为（0?5) : (100?95)。
[0122] 更优选为：
[0123] 在< 35min内，流动相A与流动相B的体积比为（94?96):(6?4);
[0124] 在彡35且< 65min内，流动相A与流动相B的体积比为（47?53):(53?47);
[0125] 在彡65且< 70min内，流动相A与流动相B的体积比为（47?53):(53?47);
[0126] 在彡70且< 120min内，流动相A与流动相B的体积比为（0?3) : (100?97);
[0127] 最优选为：
[0128] 在< 35min内，流动相A与流动相B的体积比为95 :5;
[0129] 在彡35且< 65min内，流动相A与流动相B的体积比为50 :50;
[0130] 在彡65且< 70min内，流动相A与流动相B的体积比为40 :60;
[0131] 在彡70且< 120min内，流动相A与流动相B的体积比为0 :100。
[0132] 所述第一液相色谱检测的检测器优选为蒸发光散射检测器，所述第一液相色谱检 测中蒸发光散射检测器的漂移管温度优选为60?100°C，更优选为70?90°C，最优选为 80°C;所述第一液相色谱检测中蒸发光散射检测器优选氮气作为雾化气；所述雾化气的压 力优选为〇. 1?〇. 2MPa，更优选为0. 13?0. 18MPa，最优选为0. 15MPa;所述雾化气的流速 优选为2?3L/min，更优选为2. 5L/min;所述第一液相色谱检测中蒸发光散射检测器的喷 雾器温度优选为70?90°C，更优选为80°C;。
[0133] 得到甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图后，本发明根据所述甘磷酸胆碱 待测样品溶液的第一液相色谱图与预定的标准样品溶液的第一标准曲线，得到甘磷酸胆碱 待测样品中第一杂质的含量，所述第一杂质包括甘油、氯化胆碱和甘油磷脂酰肌醇。本发明 优选对所述第一杂质进行定量检测前，对所述甘磷酸胆碱待测样品溶液第一液相色谱图中 的色谱峰进行定性，即对出峰位置进行定位；
[0134] 本发明优选将所述第一杂质的标准样品溶液进行第一液相色谱检测，得到第一杂 质的第一液相色谱图，将所述第一杂质的第一液相色谱图中色谱峰的保留时间与所述甘磷 酸胆碱待测样品溶液第一液相色谱图中色谱峰的保留时间进行比对，实现所述甘磷酸胆碱 待测样品溶液第一液相色谱图中色谱峰的定性。
[0135] 在本发明中，所述第一标准曲线为第一杂质的质量浓度与其对应的色谱峰面积之 间的线性曲线，所述第一标准曲线优选按照以下方法获得：
[0136] 配制系列浓度的第一标准样品溶液，所述第一标准样品为第一杂质的标准样品；
[0137] 将所述系列浓度的第一标准样品溶液进行第一液相色谱检测，得到系列的第一标 准液相色谱图；
[0138] 将所述系列的第一标准液相色谱图中第一杂质的色谱峰面积与其对应的第一杂 质标准样品的浓度进行线性拟合，得到第一标准曲线。
[0139] 在本发明中，所述第一标准样品溶液包括甘油标准样品溶液、氯化胆碱标准样品 溶液和甘油磷脂酰肌醇标准样品溶液。在本发明中，所述第一标准样品溶液可以是各组分 独立的标准样品溶液，也可以是各组分的混合标准样品溶液。本发明优选将甘油的纯品溶 于水，配制得到系列浓度的甘油标准样品溶液。本发明对所述甘油纯品的来源没有特殊的 限制，采用甘油纯品的市售商品即可。在本发明中，所述甘油标准样品溶液的质量浓度优选 为1?5mg/mL，更优选为2?4mg/mL，最优选为3mg/mL。
[0140] 得到所述系列浓度的甘油标准样品溶液后，本发明优选将得到的系列浓度的甘油 标准样品溶液进行第一液相色谱检测，得到甘油标准样品溶液的系列第一标准液相色谱 图。
[0141] 得到所述甘油标准样品溶液的系列第一标准液相色谱图后，本发明优选以所述甘 油标准样品溶液的系列第一标准液相色谱图中的峰面积为纵坐标，以其对应的甘油标准样 品溶液的质量浓度为横坐标，得到峰面积和质量浓度的曲线，将所述曲线进行线性拟合，得 到甘油标准样品溶液的第一标准曲线。在本发明中，所述峰面积优选采用积分得到，本发明 对所述积分的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的计分方法即可。本发明对 所述线性拟合的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的线性拟合的方法即可。
[0142] 本发明优选按照上述技术方案，得到所述第一标准样品溶液中除甘油外的其他已 知杂质的标准样品溶液的第一标准曲线，包括氯化胆碱标准样品溶液的第一标准曲线和甘 油磷脂酰肌醇标准样品溶液的第一标准曲线，不同的是，在本发明中，所述氯化胆碱标准样 品溶液的质量浓度优选为〇. 05?0. 45g/L，所述甘油磷脂酰肌醇标准样品溶液的质量浓度 优选为〇? 05?0? 45g/L。
[0143] 得到所述第一标准样品溶液的第一标准曲线后，本发明根据所述第一标准曲线， 得到所述甘磷酸胆碱待测样品溶液中第一杂质的质量浓度；根据所述甘磷酸胆碱待测样品 的质量、所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的质量、与所述甘磷酸胆碱待测样品溶液中第一杂 质的质量浓度，得到所述甘磷酸胆碱待测样品中第一杂质的含量，所述第一杂质包括甘油。 氯化胆碱和甘油磷脂酰肌醇。
[0144] 除了已知的甘油、氯化胆碱和甘油磷脂酰肌醇以外，所述第一杂质中优选还包括 未知杂质。所述未知杂质包括在酸、碱和光照等条件下产生的杂质。本发明优选将所述甘 磷酸胆碱样品进行第一主成分自身对照检测，以得到所述甘磷酸胆碱样品中未知杂质的含 量，包括以下步骤：
[0145] 1)提供甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液；
[0146] 2)将所述步骤1)中的甘磷酸胆碱对照溶液注入液相色谱仪，调节色谱仪灵敏度；
[0147] 3)将所述步骤1)中的甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液分别进行 第一液相色谱检测，得到所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图和甘磷酸胆碱对 照溶液的第一液相色谱图；
[0148] 4)根据所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图和甘磷酸胆碱对照溶液 的第一液相色谱图，得到甘磷酸胆碱待测样品溶液中未知杂质的含量。
[0149] 在本发明中，所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的来源与质量浓度与上述技术方案中 甘磷酸胆碱待测样品溶液的来源和质量浓度一致，在此不再赘述。本发明优选将所述甘磷 酸胆碱待测样品溶液进行稀释，得到甘磷酸胆碱对照溶液。在本发明中，所述甘磷酸胆碱对 照溶液与所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的质量浓度之比优选为1 :1〇〇。
[0150] 得到所述甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液后，本发明将所述甘磷 酸胆碱对照溶液注入液相色谱仪，调节灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10? 25 %，优选为20%。在本发明中，所述甘磷酸胆碱对照溶液的进样量优选为20yL。
[0151] 灵敏度调节完毕后，本发明将所述步骤1)中的甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷 酸胆碱对照溶液分别进行第一液相色谱检测，得到所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液 相色谱图和甘磷酸胆碱对照溶液的第一液相色谱图。在本发明所述的第一主成分自身对照 检测中，所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图的记录时间优选为主成分色谱峰 保留时间的2倍；所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图中如有甘油、甘油磷脂 酰肌醇和氯化胆碱杂质峰，其峰面积不得大于所述甘磷酸胆碱对照溶液的第一液相色谱图 中主峰面积的一半，即不得大于所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图中主峰面 积的0. 5% ;其他任一杂质峰峰面积不得大于所述甘磷酸胆碱对照溶液的第一液相色谱图 中主峰面积的1/5,即不得大于所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图中主峰面 积的0. 2% ;各杂质峰面积之和不得大于所述甘磷酸胆碱对照溶液的第一液相色谱图中主 峰面积的两倍，即不得大于所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图中主峰面积的 2. 0%。
[0152] 本发明优选按照上述获得甘油标准样品溶液的第一标准曲线的技术方案，得到甘 磷酸胆碱标准样品溶液的第一标准曲线。本发明根据得到的甘磷酸胆碱标准样品溶液的第 一标准曲线和所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色谱图中甘磷酸胆碱对应的峰面 积，得到所述甘磷酸胆碱待测样品中甘磷酸胆碱的含量。
[0153] 得到所述甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液的第一液相色谱图后， 本发明根据所述甘磷酸胆碱待测样品中甘磷酸胆碱的含量、所述甘磷酸胆碱对照溶液与所 述甘磷酸胆碱待测样品溶液的质量浓度之比、所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第一液相色 谱图中未知杂质的峰面积和所述甘磷酸胆碱对照溶液第一液相色谱图中甘磷酸胆碱的峰 面积，得到所述甘磷酸胆碱待测样品中未知杂质的含量。
[0154] 本发明将甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第二液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱待测 样品溶液的第二液相色谱图。本发明优选将甘磷酸胆碱待测样品与水混合，得到甘磷酸胆 碱待测样品溶液。在本发明中，所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的质量浓度优选为40?60g/ L，更优选为50g/L。
[0155] 在本发明中，所述第二液相色谱检测的进样量优选为15?25yL，更优选为17? 23iiL，最优选为20iiL。
[0156] 在本发明中，所述第二液相色谱检测的色谱柱优选为氨基键合硅胶色谱柱；所述 第二液相色谱检测的色谱柱柱温优选为20?40°C，更优选为30°C。
[0157] 在本发明中，所述第二液相色谱检测的流动相包括乙腈和水，所述乙腈和水的体 积比为（72?78) : (28?22)，优选为（73?77) : (27?23)，更优选为75 :25 ;所述第二液 相色谱检测中流动相的pH值优选为2. 0?4. 0,更优选为2. 5?3. 5,最优选为3. 0 ;本发明 优选采用酸性介质对所述第二液相色谱检测的流动相的pH值进行调节，所述酸性介质优 选为冰醋酸；本发明优选采用酸性溶液作为酸性介质，本发明对所述酸性溶液的浓度和用 量没有特殊的限制，能够将所述第二液相色谱检测中流动相的pH值调节至上述范围即可。
[0158] 在本发明中，所述第二液相色谱检测中流动相的流速优选为0. 95?1. 05mL/min， 更优选为〇. 98?1. 03mL/min，最优选为lmL/min。
[0159] 在本发明中，所述第二液相色谱检测的检测器优选为蒸发光散射检测器，所述第 二液相色谱检测中蒸发光散射检测器的漂移管温度优选为60?100°C，更优选为70? 90°C，最优选为80°C;所述第二液相色谱检测中的蒸发光散射检测器优选氮气作为雾化气； 所述雾化气的压力优选为〇. 1?〇. 2MPa，更优选为0. 13?0. 18MPa，最优选为0. 15MPa;所 述雾化气的流速优选为2?3L/min，更优选为2. 5L/min;所述第二液相色谱检测中蒸发光 散射检测器的喷雾器温度优选为70?90°C，更优选为80°C;
[0160] 得到甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液相色谱图后，本发明根据所述甘磷酸胆碱 待测样品溶液的第二液相色谱图与预定的第二标准样品溶液的第二标准曲线，得到甘磷酸 胆碱待测样品溶液中第二杂质的含量，所述第二杂质包括甘油磷脂酰乙醇胺。本发明优选 对所述第二杂质进行定量检测前，对所述甘磷酸胆碱待测样品溶液第二液相色谱图中的色 谱峰进行定性，即对出峰位置进行定位；
[0161] 本发明优选将所述第二杂质的标准样品溶液进行第二液相色谱检测，得到第二杂 质的第二液相色谱图，将所述第二杂质的第二液相色谱图中色谱峰的保留时间与所述甘磷 酸胆碱待测样品溶液第二液相色谱图中色谱峰的保留时间进行比对，实现所述甘磷酸胆碱 待测样品溶液第二液相色谱图中色谱峰的定性。
[0162] 在本发明中，所述第二标准曲线为第二杂质的质量浓度与其对应的色谱峰面积之 间的线性曲线，所述第二标准曲线优选按照以下方法获得：
[0163] 配制系列浓度的第二标准样品溶液，所述第二标准样品为第二杂质的标准样品；
[0164] 将所述系列浓度的第二标准样品溶液进行第二液相色谱检测，得到第二标准样品 溶液的系列第二液相色谱图；
[0165] 将所述第二标准样品溶液的系列第二标准液相色谱图中第二杂质的色谱峰面积 与其对应的第二杂质标准样品的浓度进行线性拟合，得到第二标准曲线。
[0166] 在本发明中，所述第二标准样品溶液包括甘油磷脂酰乙醇胺标准样品溶液。在本 发明中，所述甘油磷脂酰乙醇胺标准样品溶液的来源和质量浓度与上述技术方案中甘油磷 脂酰乙醇胺标准样品溶液的来源和质量浓度一致，在此不再赘述。
[0167] 得到所述系列浓度的第二标准样品溶液后，本发明优选将得到的系列浓度甘油磷 脂酰乙醇胺样品溶液进行第二液相色谱检测，得到甘油磷脂酰乙醇胺样品溶液的系列第二 标准液相色谱图。
[0168] 得到所述甘油磷脂酰乙醇胺的系列第二标准液相色谱图后，本发明优选以所述甘 油磷脂酰乙醇胺标准样品溶液的系列第二标准液相色谱图中的峰面积为纵坐标，以其对应 的甘油磷脂酰乙醇胺标准样品溶液的质量浓度为横坐标，得到峰面积和质量浓度的曲线， 将所述曲线进行线性拟合，得到甘油磷脂酰乙醇胺的标准曲线。在本发明中，所述峰面积优 选采用积分得到，本发明对所述积分的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的 计分方法即可。本发明对所述线性拟合的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知 的线性拟合的方法即可。
[0169] 得到所述甘油磷脂酰乙醇胺的标准曲线后，本发明根据所述甘磷酸胆碱待测样品 溶液的第二液相色谱图与所述甘油磷脂酰乙醇胺的标准曲线可得到所述甘磷酸胆碱待测 样品溶液中甘油磷脂酰乙醇胺的质量浓度；根据所述甘磷酸胆碱待测样品的质量、所述甘 磷酸胆碱待测样品溶液的质量与所述甘磷酸胆碱待测样品溶液中甘油磷脂酰乙醇胺的质 量浓度，得到所述甘磷酸胆碱待测样品中第二杂质的含量，所述第二杂质包括甘油磷脂酰 乙醇胺。
[0170] 除了已知杂质甘油磷脂酰乙醇胺外，所述第二杂质还包括未知杂质。所述未知杂 质包括在酸、碱和光照等条件下产生的杂质。本发明优选将所述甘磷酸胆碱样品进行第二 主成分自身对照检测，以得到所述甘磷酸胆碱样品中未知杂质的含量，包括以下步骤：
[0171] I)提供甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液；
[0172] II)将所述步骤I)中的甘磷酸胆碱对照溶液注入液相色谱仪，调节色谱仪灵敏 度；
[0173] III)将所述步骤I)中的甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液分别进 行第二液相色谱检测，得到所述甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液的第二液 相色谱图；
[0174] IV)根据所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液相色谱图和甘磷酸胆碱对照溶 液的第二液相色谱图，得到甘磷酸胆碱待测样品溶液中未知杂质的含量。
[0175] 本发明按照上述技术方案得到甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液， 并按照上述技术方案将所述甘磷酸胆碱对照溶液注入液相色谱仪，调节灵敏度。
[0176] 灵敏度调节完毕后，本发明将所述步骤I)中的甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷 酸胆碱对照溶液分别进行第二液相色谱检测，得到所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液 相色谱图和甘磷酸胆碱对照溶液的第二液相色谱图。在所述第二主成分自身对照检测中， 所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液相色谱图中如有甘油磷脂酰乙醇胺杂质峰，其峰 面积不得大于所述甘磷酸胆碱对照溶液的第二液相色谱图主峰面积的〇.5倍，即不得大于 所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液相色谱图主峰面积的〇. 5%。
[0177] 本发明优选按照上述获得第二标准曲线的技术方案，得到甘磷酸胆碱标准样品溶 液的第二标准曲线。本发明根据得到的甘磷酸胆碱标准样品溶液的第二标准曲线和所述甘 磷酸胆碱待测样品溶液的第二液相色谱图中甘磷酸胆碱对应的峰面积，得到所述甘磷酸胆 碱待测样品中甘磷酸胆碱的含量。
[0178] 得到所述甘磷酸胆碱待测样品溶液和甘磷酸胆碱对照溶液的第二液相色谱图后， 本发明根据所述甘磷酸胆碱待测样品中甘磷酸胆碱的含量、所述甘磷酸胆碱对照溶液与所 述甘磷酸胆碱待测样品溶液的质量浓度之比、所述甘磷酸胆碱待测样品溶液的第二液相色 谱图中未知杂质的峰面积和所述甘磷酸胆碱对照溶液第二液相色谱图中甘磷酸胆碱的峰 面积，得到所述甘磷酸胆碱待测样品中未知杂质的含量。
[0179] 本发明提供的检测方法不仅能检测出甘磷酸胆碱中已知杂质甘油、氯化胆碱、甘 油磷脂酰肌醇和甘油磷脂酰乙醇胺的含量，还能检测出在酸、碱和光照等条件下可能产生 的未知杂质的含量，避免了仅测定部分杂质就判断甘磷酸胆碱质量的片面性，实现了全面、 有效的监控甘磷酸胆碱质量的目的。
[0180] 为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的甘磷酸胆碱中杂质的检 测方法进行详细描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0181] 在下述实施例中，所用乙腈购自MREDATECHNOLOGYINC公司，纯度为色谱纯，甲酸 铵购自国药集团化学试剂有限公司，纯度为分析纯，甲酸购自北京化工厂，纯度为分析纯， 乙酸购自北京化工厂，纯度为分析纯。
[0182] 实施例1
[0183] 将甘磷酸胆碱、氯化胆碱、甘油磷脂酰肌醇、空胶囊壳和甘油与水混合，混合均 匀后进行过滤，得到甘磷酸胆碱混合溶液A，每lmL甘磷酸胆碱混合溶液中含甘磷酸胆碱 50mg、氯化胆碱0. 25mg、甘油磷脂酰肌醇0. 25mg、空胶囊壳50mg、甘油3mg。
[0184] 取20L所述甘磷酸胆碱混合溶液A，注入岛津液相色谱仪，采用Alltech2000ES 型蒸发光散射检测器进行检测。
[0185] 岛津液相色谱仪采用LC-lOATvp型泵，CBM-20A型控制器，CLASS-VP型色谱工作 站；
[0186]Alltech2000ES型蒸发光散射检测器的漂移管温度为，喷雾器温度为80°C，雾化 气为氮气，雾化气流速为2. 5L/min，载气压力为0? 15MPa;
[0187] 色谱条件为：资生堂CAPCELLPAKSCX色谱柱，色谱柱填料颗粒大小5iim，色谱柱 尺寸为4. 6X250mm;采用二元梯度洗脱程序，如表1所示，表1为本发明实施例1采用的二 元梯度洗脱程序。流动相A为体积比为99:1的乙腈和摩尔浓度为0. 001m〇l/L甲酸铵溶液， 流速为1.OmL/min，用甲酸调节pH值为3. 0 ;流动相B为体积比为60:40的乙腈和摩尔浓度 为0. 04mol/L甲酸铵溶液，流速为1.OmL/min，用甲酸调节pH值为5. 0 ;
[0188] 表1本发明实施例1采用的二元梯度洗脱程序
[0189]
【权利要求】
1. 甘磷酸胆碱中杂质的检测方法，包括以下步骤： 将甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第一液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱待测样品溶液的 第一液相色谱图； 所述第一液相色谱检测的流动相包括流动相A和流动相B ;所述流动相A包括第一甲 酸铵溶液和乙腈，所述第一甲酸铵溶液的摩尔浓度为〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一甲酸 铵溶液和乙腈的体积比为（1?10) : (99?90); 所述流动相B包括第二甲酸铵溶液和乙腈，所述第二甲酸铵溶液的摩尔浓度为0. 03? 0.05mol/L，所述第二甲酸铵溶液和乙腈的体积比为（35?45) :(65?55); 根据所述第一液相色谱图与预定的标准样品溶液的第一标准曲线，得到甘磷酸胆碱待 测样品中第一杂质的含量，所述第一杂质包括甘油、氯化胆碱和甘油磷脂酰肌醇； 将甘磷酸胆碱待测样品溶液进行第二液相色谱检测，得到甘磷酸胆碱待测样品溶液 的第二液相色谱图，所述第二液相色谱的流动相包括乙腈和水，所述乙腈和水的体积比为 (72 ?78) : (28 ?22); 根据所述第二液相色谱图与预定的标准样品溶液的第二标准曲线，得到甘磷酸胆碱待 测样品中第二杂质的含量，所述第二杂质包括甘油磷脂酰乙醇胺。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一液相色谱检测中的色谱柱 为阳离子交换柱； 所述第一液相色谱检测色谱柱的柱温为20?30°C。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一液相色谱检测中流动相A的 流速为 〇? 95 ?1. 05mL/min ; 所述流动相B的流速为0. 95?1. 05mL/min。
4. 根据权利要求1?3任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述第一液相色谱检测 采用梯度洗脱程序； 所述梯度洗脱程序为： 在< 35min内，流动相A与流动相B的体积比为（93?97) : (7?3); 在彡35且< 65min内，流动相A与流动相B的体积比为（45?55) : (55?45); 在彡65且< 70min内，流动相A与流动相B的体积比为（35?44) : (65?56); 在彡70且< 120min内，流动相A与流动相B的体积比为（0?5) : (100?95)。
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A的pH值为2. 0?4. 0 ; 所述流动相B的pH值为4. 0?6. 0。
6. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二液相色谱检测中流动相的 流速为 〇? 95 ?1. 05mL/min。
7. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二液相色谱检测中流动相的 pH值为2. 0?4. 0。
8. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二液相色谱检测中的色谱柱 为氨基键合硅胶色谱柱； 所述第二液相色谱检测中色谱柱的柱温为20?40°C。
9. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一液相色谱检测的检测器为 蒸发光散射检测器； 所述第一液相色谱检测中蒸发光散射检测器的喷雾器温度为70?90°C ; 所述第一液相色谱检测中蒸发光散射检测器的载气压力为〇. 1?〇. 2MPa。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二液相色谱检测的检测器为 蒸发光散射检测器； 所述第二液相色谱检测中蒸发光散射检测器的喷雾器温度为70?90°C ; 所述第二液相色谱检测中蒸发光散射检测器的载气压力为〇. 1?〇. 2MPa。
【文档编号】G01N30/02GK104458942SQ201410698223
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】傅超婷, 云冲, 刘五生, 李锦云, 朱峰, 王玉娟, 李富志 申请人:海南通用三洋药业有限公司