一种定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素o的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素O的检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明提供一种检测试剂盒，包括互相独立的类风湿因子检测试纸卡和抗链球菌溶血素O检测试纸卡，所述类风湿因子检测试纸卡和抗链球菌溶血素O检测试纸卡均各自包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。本发明所提供的检测试剂盒首次将风湿三项中的类风湿因子、抗链球菌溶血素O通过荧光微球免疫层析技术同时进行检测，通过一次加样操作就能检测出样本中类风湿因子、抗链球菌溶血素O的含量，简化了操作过程，兼具灵敏性和特异性，快速准确评估类风湿关节炎临床症状。
【专利说明】-种定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素O的检测试剂 合 Sl
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血 素0的检测试剂盒及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 类风湿因子（rheumatoid factor, RF)可分为 IgM、IgA、IgG、IgD、IgE 五型（注： 在临床内科学中描述为四型，没有IgD型；但在实验室诊断学中描述为5型），是类风湿关 节炎血清中针对IgG FC片段上抗原表位的一类自身抗体，类风湿因子阳性患者较多伴有关 节外表现，如皮下结节及血管炎等。IgM型RF阳性率为60% -78%。
[0003] 机体因咽炎、扁桃体炎、猩红热、丹毒、脓皮病、风湿热等感染A组链球菌后，可产 生链球菌溶血素〇抗体，即"Anti-Streptolysin O(ASO) "。
【发明内容】
[0004] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种定量检测类风湿因 子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
[0005] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种定量检测类风湿因子（RF)、抗 链球菌溶血素O(ASO)的检测试剂盒，包括互相独立的类风湿因子检测试纸卡和抗链球菌 溶血素0检测试纸卡，所述类风湿因子检测试纸卡和抗链球菌溶血素0检测试纸卡均各自 包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、突光标记物结合垫、硝酸纤 维素膜和吸水垫，所述类风湿因子检测试纸卡的荧光标记物结合垫上包含人变性IgG，所述 抗链球菌溶血素〇检测试纸卡的荧光标记物结合垫上包含链球溶菌素O(SLO)，所述各硝 酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述荧光标记物结合垫上的链球溶菌素〇和人变性 I gG米用突光微球标记。
[0006] 优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明中所述的荧光标 记物结合垫还经过预处理，预处理中所使用的预处理缓冲液包括下列组分：水苏糖、明矾、 果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸 的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，缓冲液的pH值为7. 2 - 7. 6。
[0007] 优选的，各组分在缓冲液中的浓度为：
[0008] 水苏糖 0.8-3g/L;
[0009] 明石凡 O.l-lg/L； 果糖二磷酸钠 0.8-3 g/L; 六偏磷酸钠 0.05-0.5 g/L; 甘氨酸 1.5-2.25g/L;
[0010] 所述预处理缓冲液的溶剂为水。
[0011] 所述预处理的具体步骤为：将突光标记物结合垫在预处理液中浸泡I. 5-2. 5h,取 出放于36-38 °C烘干。
[0012] 所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
[0013] 优选的，所述底板为PVC底板。
[0014] 优选的，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样 端较远一侧。
[0015] 优选的，所述类风湿因子检测试纸卡的检测线上包被有人变性IgG。。
[0016] 优选的，所述抗链球菌溶血素0检测试纸卡的检测线上包被有链球菌溶血素0。
[0017] 优选的，质控线上包被羊抗鼠抗体。
[0018] 优选的，还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有两个平行的试纸卡 卡槽，所述试纸卡分别嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有两个测试窗和两个加样孔，所 述两个测试窗的位置分别与两个试纸卡的检测线和质控线的位置相配合，所述两个加样孔 的位置与两个试纸卡的样品垫的位置相配合。
[0019] 更优选的，所述卡壳为塑料卡壳。
[0020] 更优选的，所述两个加样孔之间还设有连接两个加样孔的横槽。
[0021] 优选的，所述检测试剂盒用于同时定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的含 量。
[0022] 本发明所提供的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒在检测时 采用双抗原夹心免疫层析法，配套免疫定量分析仪器使用。免疫分析仪器通过采集检测线 (T)和质控线（C)条带荧光信号，计算T/C信号值。使用前先将不同标准品滴加到试纸卡 上，分析处理建立定标曲线（T/C信号值与标准品真实值的关系），再将检测样品时获得的 T/C值与标准曲线比较，即可获得检测样品中的类风湿因子、抗链球菌溶血素0的含量。
[0023] 本发明第二方面提供所述定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒 的制备方法，包括如下步骤：
[0024] 1)用荧光微球标记的SLO和人变性IgG溶液分别喷涂抗链球菌溶血素0、类风湿 因子荧光标记物结合垫；
[0025] 2)在抗链球菌溶血素0硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂SLO及羊抗 鼠抗体，在类风湿因子硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂人变性IgG及羊抗鼠抗 体；
[0026] 3)将两套样品垫、步骤1制备的荧光标记物结合垫、步骤2制备的硝酸纤维素膜、 吸水垫依次粘贴在各自的底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得 检测试剂盒。
[0027] 优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明中所述的荧光标 记物结合垫还经过预处理，预处理中所使用的预处理缓冲液包括下列组分：水苏糖、明矾、 果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸 的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，缓冲液的pH值为7. 2 - 7. 6。
[0028] 优选的，各组分在缓冲液中的浓度为：
[0029] 水苏糖 0.8-3g/L; 明矾 0.1-lg/L; 果糖-憐fe納 0.8-3 g/L; 六偏磷酸钠 0.05-0.5 g/L; 甘氨酸 1.5-2.25g/L;
[0030] 所述预处理缓冲液的溶剂为水。
[0031] 所述预处理的具体步骤为：将荧光标记物结合垫在预处理液中浸泡2h，取出放于 37°C烘干。
[0032] 本发明第三方面提供所述定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒 在类风湿因子、抗链球菌溶血素〇检测领域的用途。
[0033] 本发明所提供的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒首次将风 湿三项中的类风湿因子、抗链球菌溶血素〇通过荧光微球免疫层析技术同时进行检测，通 过一次加样操作就能检测出样本中类风湿因子、抗链球菌溶血素〇的含量，简化了操作过 程，兼具灵敏性和特异性，快速准确评估类风湿关节炎临床症状。此外，所述检测试剂盒具 有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点，受血清（或血浆）严重血脂、溶血干扰小，当 血清（或血浆）血红蛋白彡600mg/L、甘油三酯彡lOOmg/dL时、胆红素彡20mg/dL，对准确 度的影响变差< 10%。
【具体实施方式】
[0034] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0035] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"这个"包括复数形式。
[0036] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0037] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition, 2001 ;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.),Academic Press,San Diego, 1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker, ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0038] 实施例I
[0039] 本发明试纸卡的制备：
[0040] 1)使用预处理缓冲液对荧光标记物结合垫进行预处理，预处理缓冲液为：水苏糖 2g/L，明矾0. 5g/L，果糖二磷酸钠I. 5g/L，六偏磷酸钠0. 3g/L，甘氨酸I. 88g/L的水溶液，pH =7. 4,预处理的具体步骤为：将荧光标记物结合垫在预处理液中浸泡2h，取出放于37°C烘 干；用适量的荧光微球标记的SLO和人变性IgG缓冲溶液分别喷涂经预处理的荧光标记物 结合垫，制得两种荧光标记物结合垫，溶液中荧光微球与标记物的质量比为5: 1，溶液的浓 度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm ;
[0041] 2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂适量的SLO和羊抗鼠抗体溶液， 以及涂适量的人变性IgG和羊抗鼠抗体溶液，制得两种包被后的硝酸纤维素膜，喷涂溶液 的浓度为lmg/ml，喷涂量为lul/cm ;
[0042] 3)将样品垫、步骤1制备的荧光标记物结合垫、步骤2制备的硝酸纤维素膜、吸水 垫依次粘贴在各自的PVC底板上，切裁制得宽3-5_的类风湿因子检测试纸卡和抗链球菌 溶血素0检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
[0043] 标准线曲线：
[0044] 分别将浓度为 0、20、50、100、150、200、250、300、400、500ng/mL 的类风湿因子缓冲 溶液滴加于样品垫上，每个浓度设5个重复（检测结果取5个重复的平均值），膜层析10分 钟以后，使用免疫分析仪器通过采集检测线（T)和质控线（C)条带荧光信号，分析仪的对荧 光信号的检测范围是AD值0-10000,计算T/C信号值，建立类风湿因子定标曲线，其中Y轴 为T/C信号值，X轴为标准品真实值。
[0045] 分别将浓度为 0、20、50、100、150、200、250、300、400、500pg/mL 的抗链球菌溶血素 〇缓冲溶液滴加于样品垫上，每个浓度设5个重复（检测结果取5个重复的平均值），膜层析 10分钟以后，使用免疫分析仪器通过采集检测线（T)和质控线（C)条带荧光信号，计算T/C 信号值，建立抗链球菌溶血素〇定标曲线，其中Y轴为T/C信号值，X轴为标准品真实值。
[0046] 类风湿因子、抗链球菌溶血素0含量抗干扰性的检测：
[0047] 将检测样品滴加于样品垫上，每个样品设5个重复（检测结果取5个重复的平均 值），膜层析10分钟以后，将检测样品时获得的T/C值与标准曲线比较，获得检测样品中的 类风湿因子、抗链球菌溶血素0含量的检测数据，再将检测获得的类风湿因子、抗链球菌溶 血素O含量数据与真实类风湿因子、抗链球菌溶血素O含量数据进行对比，获得准确度影响 偏差值。
[0048] 样品I :50ng/mL类风湿因子、300pg/mL抗链球菌溶血素0含量、600mg/L血红蛋 白、100mg/dL甘油三酯、10mg/dL胆红素；
[0049] 样品2 :100ng/mL类风湿因子、200pg/mL抗链球菌溶血素0含量、500mg/L血红蛋 白、50mg/dL甘油三酯、15mg/dL胆红素；
[0050] 样品3 :150ng/mL类风湿因子、150pg/mL抗链球菌溶血素0含量、80mg/L血红蛋 白、20mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素；
[0051] 样品4 :200ng/mL类风湿因子、lOOpg/mL抗链球菌溶血素0含量、150mg/L血红蛋 白、30mg/dL甘油三酯、4mg/dL胆红素；
[0052] 样品5 :300ng/mL类风湿因子、50pg/mL抗链球菌溶血素0含量、300mg/L血红蛋 白、80mg/dL甘油三酯、9mg/dL胆红素；
[0053] 空白对照样品：300mg/L血红蛋白、80mg/dL甘油三酯、9mg/dL胆红素血清样本。
[0054] 样品1-5所获得的检测的类风湿因子含量数据分别为48ng/mL、102ng/mL、149ng/ mL、198ng/mL、315ng/mL，抗链球菌溶血素 0 含量分别为 290pg/mL、202pg/mL、145pg/mL、 95pg/mL、52pg/mL，准确度的影响变差< 10%，空白对照未发现明显荧光信号变化。
[0055] 实施例2
[0056] 对比例试纸卡的制备：只改变预处理缓冲液配方，对比例试纸卡的预处理缓冲液 为25mM甘氨酸缓冲液，pH = 7. 4,其他步骤均与实施例1中制备步骤相同。
[0057] 类风湿因子、抗链球菌溶血素0的灵敏性和检测限对比实验：
[0058] 用荧光仪器进行判断，分析仪的对荧光信号的检测范围是AD值0-10000,根据仪 器的性能，⑶TOFF值为50,在特定浓度下，90%以上检测例AD值> 50,即认为试剂盒能够 用于该浓度下的检测。
[0059] 采用5% BSA生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。取0. 3-5. 3ng/ mL梯度浓度的类风湿因子已知血样进行灵敏性检测，每间隔0. 2ng/mL设置一个梯度，每 个梯度设置20个样本，记录检测结果。结果显示实施例1所制备的试纸卡最低检测限为 0. 5ng/mL，对比例试纸卡的最低检测限高于5. 3ng/mL。
[0060] 采用5% BSA生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。取l-50pg/mL 的抗链球菌溶血素〇已知血样进行灵敏性检测，每间隔lpg/mL设置一个梯度，每个梯度设 置20个样本，记录检测结果。结果显示实施例1所制备的试纸卡最低检测限为3pg/mL，对 比例试纸卡的最低检测限高于50pg/mL。
[0061] 综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0062] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属【技术领域】中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【权利要求】
1. 一种定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒，包括互相独立的类风 湿因子检测试纸卡和抗链球菌溶血素0检测试纸卡，所述类风湿因子检测试纸卡和抗链球 菌溶血素0检测试纸卡均各自包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品 垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述类风湿因子检测试纸卡的荧光标记物 结合垫上包含人变性IgG，所述抗链球菌溶血素0检测试纸卡的荧光标记物结合垫上包含 链球溶菌素〇,所述各硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述荧光标记物结合垫上的 链球溶菌素〇和人变性IgG采用荧光微球标记。
2. 如权利要求1所述的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒，其特征 在于，所述各硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一 侧。
3. 如权利要求1所述的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒，其特征 在于，所述类风湿因子检测试纸卡的检测线上包被有人变性IgG。
4. 如权利要求1所述的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒，其特征 在于，所述抗链球菌溶血素〇检测试纸卡的检测线上包被有链球菌溶血素0。
5. 如权利要求1所述的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒，其特征 在于，所述各质控线上包被羊抗鼠抗体。
6. 如权利要求1所述的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒，其特征 在于，还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有两个平行的试纸卡卡槽，所述 试纸卡分别嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有两个测试窗和两个加样孔，所述两个测 试窗的位置分别与两个试纸卡的检测线和质控线的位置相配合，所述两个加样孔的位置与 两个试纸卡的样品垫的位置相配合。
7. 如权利要求6所述的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒，其特征 在于，所述两个加样孔之间还设有连接两个加样孔的横槽。
8. 如权利要求1所述的定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素0的检测试剂盒，其特征 在于，所述检测试剂盒用于同时定量检测类风湿因子、抗链球菌溶血素〇的含量。
9. 如权利要求1-8任一权利要求所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤： 1) 用荧光微球标记的SL0和人变性IgG溶液分别喷涂抗链球菌溶血素0、类风湿因子 突光标记物结合垫； 2) 在抗链球菌溶血素0硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂SL0及羊抗鼠抗 体，在类风湿因子硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂人变性IgG及羊抗鼠抗体； 3) 将两套样品垫、步骤1制备的荧光标记物结合垫、步骤2制备的硝酸纤维素膜、吸水 垫依次粘贴在各自的底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测 试剂盒。
【文档编号】G01N33/558GK104374911SQ201410738142
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】段继凤 申请人:重庆乾德生物技术有限公司