一种猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种家畜疫病感染与免疫的鉴别检测器具，特别是涉及一种猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，检测膜上含有强毒检测线T1“│”，疫苗毒检测线T2“│”和质控线C“│”印迹。鉴别检测时，在检测膜显现三条红色条带“│││”为猪伪狂犬强毒感染；两条红色条带“││”为猪伪狂犬疫苗毒疫苗免疫；只显现一条红色条带“│”为猪伪狂犬病毒阴性。本鉴别检测试纸特异性强，敏感性高，反应谱广，可检测现有疫苗毒株和和多数流行强毒株，且操作简便、快速，可广泛用于猪伪狂犬病毒感染与免疫的鉴别检测，易于在生产实践中推广应用。
【专利说明】一种猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种家畜疫病感染与免疫的鉴别检测器具，特别是涉及一种猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸。
【背景技术】
[0002]伪狂犬病((Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus, PRV)引起的多种动物共患传染病，可感染牛、猪、犬、羊、狐狸和猫等。猪是伪狂犬病的传染源和自然贮存宿主，猪感染PRV后表现为发热，仔猪神经症状、高死亡率，大中猪呼吸道症状，母猪流产等临床特点。在2010年，伪狂犬病是我国规模化猪场进行疫病控制最为理想的疾病之一，许多猪场已经达到免疫无感染状态。然而在2011年，一些Bartha-K61疫苗免疫的猪场出现了变异的猪伪狂犬病病毒，表明传统的gE基因缺失疫苗不能提供足够的免疫保护。河南省猪群伪狂犬病的感染率自2005年以来呈现整体下降趋势，临床上以散发或非典型病例为主。但是，从2011年底开始，我省部分猪场突发伪狂犬疫情，很快在省内各地爆发，广泛流行；而且，部分猪场附近的羊、犬、猫、狐狸等动物也出现感染死亡状况。因此，现阶段我国猪伪狂犬病的防控变得更为棘手和复杂。
[0003]PRV 属于抱疫病毒科(Herpesviridae), a_ 抱疫病毒亚科(Alphaherpesvirinae)的成员，基因组为线性双链DNA，大小约150 kb。整个PRV基因组至少含有70个基因，编码70-100余种蛋白。目前研究发现PRV可编码11个糖蛋白:gB、gC、gD、gE、gG、gH、g1、gK、gL、gM和gN。gB、gH、gL和gM疱疹病毒科中保守，而且gB、gH和gL对所有疱疹病毒在细胞培养物中进行复制都是必需的。gB蛋白能够诱导中和抗体的产生，与免疫保护相关。PRV gE蛋白最早被称为gl蛋白。1960年代筛选制备的PRV疫苗株如Bartha株及BUK株等均存在gE缺失。在二十世纪80年代中期，通过DNA重组技术构建了 gE缺失的PRV突变株；在此基础上，将TK进行缺失使PRV病毒得到进一步致弱。许多gE缺失疫苗均能够预防攻毒感染或减轻攻毒感染造成的临床症状。虽然当前也存在gC和gG缺失的PRV疫苗，但在许多国家仅允许猪群使用gE缺失疫苗。从1990年代到2011年底，我国80%以上猪群均使用了gE基因缺失疫苗Bartha进行免疫接种。gE疫苗和gE抗体诊断配套使用用于PRV净化的前提是所有流行毒株均表达gE蛋白，而且流行株感染的动物均产生gE蛋白的抗体。目前几乎所用PRV野毒株均表达gE蛋白。通过gE基因缺失疫苗与gE抗体诊断方法的联合使用，一些欧洲国家如德国、奥地利、瑞典、丹麦和英国及美国已成功在家养猪群中净化了猪伪狂犬病。我国政府在2011年制订了《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》，提出到2015年，原种猪场猪伪狂犬病达到净化标准；到2020年，全国所有种猪场猪伪狂犬病达到净化标准的目标。然而病原体的净化是一项长期而且艰巨的任务。如果要实现完全净化或接近净化状态可能需要100年时间甚至更长；例如美国的猪伪狂犬病首次出现在1909年，其净化计划始自1989年，到2005年绝大多数净化项目得以完成。即便如此，野猪群中PRV病毒的存在对家猪再次感染PRV造成了很大的威胁。因此，建立简便、快速、特异、敏感的鉴别诊断方法区分疫苗免疫动物及病毒感染动物十分必要。
[0004]伪狂犬病的鉴别诊断方法包括聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等，其中ELISA试剂盒是市场上最为常用的鉴别诊断商品。商品化的ELISA试剂盒分别使用间接或阻断ELISA，由于临床血清较为复杂，间接ELISA的特异性相对于阻断ELISA稍差。阻断ELISA使用临床猪血清阻断gE蛋白特异性单抗的结合，特异性与敏感性较高；然而，阻断ELISA也存在先天的缺点。阻断ELISA使用的单抗针对的是在猪体内具有免疫优势的表位，一旦PRV病毒在gE基因发生变异就有可能使得单抗识别无效。虽然阻断ELISA仍然能够特异检测出我国新出现的变异的PRV病毒抗体，但单抗识别无效的可能性依旧存在。所以，依据现阶段的PRV变异毒株开发新的鉴别诊断方法势在必行。免疫层析试纸是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型体外检测技术,是理想的即时检测(point-of-care test,P0CT)和现场检测技术，其具有更加灵敏、特异、简便、快速等优点，尤其是可实现“傻瓜式”操作，即不需要任何附加仪器设备即可进行现场检测，并在1-5分钟内判定结果，广泛应用于各种分析物的定性和半定量快速检测，包括抗原、半抗原、抗体和核酸等，已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之一。河南省动物免疫学重点实验室从1995年开始系统开展免疫试纸快速检测技术研究,率先在国际上研制成功动物疫病病原和抗体检测胶体试纸产品一一鸡传染性法氏囊病快速诊断试纸和猪旋毛虫抗体检测纸，建立了动物疫病快速检测试纸研发技术平台，截至目前已成功开发出动物疫病抗原、抗体以及药物残留检测等系列快速检测试纸产品，大大推动了该技术的应用和发展。本发明针对PRV野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断的关键技术问题，筛选鉴定可区分PRV强、疫苗毒株的高亲和力配对单克隆抗体，建立基于免疫层析试纸的蛋白芯片技术平台，研制猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸，建立适用于养殖基层和临床检测的快捷、简便的猪伪狂犬野毒感染和疫苗免疫联检技术，实现对猪伪狂犬病毒野毒感染的实时监测，为我国猪伪狂犬防控与净化提供技术支撑，对猪伪狂犬疫情监测和防控有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:研制适用于猪伪狂犬感染与免疫鉴别检测的猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸，本试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。
[0006]本发明的技术方案是:一种猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，金标垫为吸附胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gB蛋白单克隆抗体mAbl的玻璃纤维，检测膜为印迹强毒检测线Tl、疫苗毒检测线T2和质控线C的硝酸纤维素膜，由样品端至手柄端的排列为强毒检测线Tl/疫苗毒检测线T2/质控线C:“I I I ”，强毒检测线Tl为抗猪伪狂犬病毒单克隆抗体gE蛋白mAb2印迹“ I ”，疫苗毒检测线T2为抗猪伪狂犬病毒多克隆抗体pAbl或抗猪伪狂犬病毒gB蛋白单克隆抗体mAb3印迹“ I ”，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹“ I ”。鉴别检测时，猪伪狂犬强毒感染在检测膜显现强毒检测线Tl，疫苗毒检测线T2和质控线C三条红色条带“I I I ”，猪伪狂犬疫苗毒疫苗免疫在检测膜显现疫苗毒检测线T2和质控线C两条红色条带“ I I ”，无猪伪狂犬病毒则只显现质控线C 一条红色条带“丨”。
[0007]以猪伪狂犬病毒gB和gE重组蛋白为免疫抗原，通过杂交瘤细胞技术生产鉴定抗猪伪狂犬病毒gB和gE蛋白单克隆抗体，利用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选区分猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒的单克隆抗体，以叠加酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选识别不同抗原表位的单克隆抗体。用于胶体金标记的单克隆抗体mAbl和疫苗毒检测线T2的单克隆抗体mAb3均特异识别猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒疫苗株，分别识别猪伪狂犬病毒gB蛋白的不同抗原表位，用于强毒检测线T2的单克隆抗体mAb2特异识别猪伪狂犬病毒强毒株gE蛋白，但不与疫苗毒株反应。同时，以IPMA筛选与猪伪狂犬病毒反应谱广的单克隆抗体，胶体金标记单克隆抗体mAbl和疫苗毒检测线T2单克隆抗体mAb3可识别猪伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒疫苗以及多数流行强毒株，强毒检测线Tl单克隆抗体mAb2可识别多数猪伪狂犬病毒流行强毒株。以猪伪狂犬病毒疫苗毒Bartha株为免疫抗原制备抗猪伪狂犬病毒多克隆抗体pAbl,可用于疫苗毒检测线T2印迹。以小鼠IgG为免疫抗原制备羊抗小鼠IgG多克隆抗体pAb2，pAb2和金黄色葡萄球菌SPA均可用于质控线C印迹。
[0008]本发明有益的积极效果:猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸实现了猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒的同步联检，可有效鉴别猪群猪伪狂犬强毒感染与疫苗免疫，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。检测试纸条具有下列各项优点:
(I)强毒和疫苗毒联检。猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸在检测膜上含有识别猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒的疫苗毒检测线和识别强毒但不识别疫苗毒的强毒检测线，可同步进行猪伪狂犬病毒的强毒株和疫苗毒株联检，实现猪伪狂犬的强毒和疫苗毒鉴别检测。
[0009](2)特异性强，敏感性高。猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸以可区分猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒的高亲和力配对单克隆抗体为基础制备而成，单克隆抗体的特异性强和敏感性高，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对标记抗体的反应性影响很小，且具有较高的标记率。因此，鉴别检测试纸具有较高的特异性和敏感性。
[0010](2)操作简便快速。使用鉴别检测试纸时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品10秒左右，在2分钟内即可判定检测结果。
[0011](3)显示检测结果形象、直观准确。鉴别检测试纸以显示红棕色“ I ”、“ I I ”和“I I I ”印迹作为检测的阴性、疫苗毒和强毒阳性标记，即在检测膜上显示一条棕红色条带“ I ”为猪伪狂犬病毒阴性，表示被检测样品无疫苗毒疫苗或强毒感染，两条棕红色条带“ I I ”为猪伪狂犬病毒疫苗毒阳性，表示被检样品为疫苗毒疫苗免疫，三条棕红色条带“I I I ”为猪伪狂犬病毒强毒阳性，表示被检样品为强毒感染，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
[0012](4)成本低，投资少。使用鉴别检测试纸，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
[0013]【专利附图】
【附图说明】下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0014]图1是猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸侧视结构示意图。
[0015]图2是猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸俯视结构示意图。
[0016]图中，1.支撑板，2.样品垫，3.金标垫，4.检测膜，5.吸水垫，6.强毒检测线Tl印迹，7.疫苗毒检测线T2印迹，8.质控线C印迹，9-1.样品端保护膜，9-2.手柄端保护膜，10.标记线。
[0017]【具体实施方式】猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸可广泛应用于猪群猪伪狂犬病毒强毒感染和疫苗免疫的鉴别检测。制备猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸，首先需制备猪伪狂犬病毒免疫抗原，进而制备抗猪伪狂犬病毒多克隆抗体和单克隆抗体，并筛选区分猪伪狂犬强毒和疫苗毒的单克隆抗体，识别猪伪狂犬强毒和疫苗毒的单克隆抗体mAbl用于制备胶体金标记物，识别猪伪狂犬强毒而不识别疫苗毒的单克隆抗体mAb2用于印制强毒检测线印迹“ I ”，识别猪伪狂犬强毒和疫苗毒的多克隆抗体pAbl或单克隆抗体mAb3用于印制疫苗毒检测线印迹“ I ”，其次需制备羊抗小鼠IgG抗体或金黄色葡萄球菌SPA，用于印制质控线印迹“ I ”。
[0018](I)猪伪狂犬病毒免疫抗原的制备。
[0019](1.1)猪伪狂犬病毒gB重组蛋白的制备
以PCR扩增PRVgB蛋白的中和表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gB基因重组表达质粒pET-gB，经I mol/L IPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gB重组蛋白,Western blot检测表明gB表达蛋白均能被PRV阳性血清特异识别，具有良好的反应性。采用Ni柱亲和层析纯化及稀释复性技术获得纯度约90%的gB重组蛋白15mg/L。
[0020](1.2)猪伪狂犬病毒gE重组蛋白的制备
以PCR扩增PRVgE蛋白的表位富集区，将目的基因克隆入原核表达载体pET-28a，构建gB基因重组表达质粒pET-gE，经0.4 mol/L IPTG诱导，在大肠杆菌中高效表达gE重组蛋白，Western blot检测表明gE表达蛋白均能被PRV强毒阳性血清特异识别，具有良好的反应性。采用Ni柱亲和层析纯化技术获得纯度约90%的gE重组蛋白12mg/L。
[0021](2)抗猪伪狂犬病毒单克隆抗体的制备。
[0022](2.1)杂交瘤细胞株的建立。
[0023]分别将猪伪狂犬病毒gB和gE重组蛋白与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，以50mg-100 mg/只免疫BALB/c系小鼠3次，每次间隔15-30天；第3次加强免疫后3_4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75%酒精浸泡5-10 min，无菌取其脾脏；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将I X 18的脾细胞与2-5 X 10 7的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1000 r/min离心10 min，弃上清，在37°C的水浴中将0.7-1 ml的40%_50%PEG 4000 (pH8.5-9.0)缓缓加入细胞，温育I min后，缓慢加入无血清1640培养基15 ml,以终止PEG的作用，37°C水浴5-10 min, 1000 r/min离心10 min，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100 ml-200 ml/孔)，置37°C 5% CO2培养箱中培养。培养7-10天后，取杂交瘤细胞培养上清以酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选阳性杂交瘤细胞。以猪伪狂犬病毒标准强毒感染仓鼠肾细胞(BHK-21)，经甲醇固定后，5%脱脂奶37°C封闭I h ;加待检细胞培养上清50mL/孔，设HAT培养基和小鼠免疫血清为阴性和阳性对照；加1:500稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体(50 mL/孔)，37°C作用30 min ;每步反应后均用含0.05% Tween-20的PBS充分洗涤；以底物AEC室温显色10-20 min，用水冲洗中止显色后，在显微镜下观察显色结果。选取强阳性、细胞生长旺盛的克隆孔进行连续3次有限稀释克隆化，扩大培养后冻存细胞，分别建立抗猪伪狂犬病毒gB蛋白和gE蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株8株和12株。
[0024](2.2)单克隆抗体的制备:以体内诱生腹水制备单抗。取经降殖烷或液体石蜡致敏的经产Balb/c小鼠，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞17个/只，7 d?10 d后抽取腹水，离心后取上清，分装，冻存。
[0025](2.3)单克隆抗体的鉴定 (2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的ELISA效价分别在1:640和1: 5 X 15以上，IPMA效价分别在1:16和1:8000以上。
[0026](2.3.2)单克隆抗体的特异性
用PRV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株感染仓鼠肾细胞(BHK-21)，以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定单抗与PRV流行毒株的反应性，筛选获得同时特异识别PRV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株的gB蛋白单克隆抗体6株，而特异识别PRV标准毒株和流行毒株但不识别疫苗毒株的单克隆抗体8株。以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测上述14株单克隆抗体与疫苗株和流行毒株的反应谱，证明用于胶体金标记和疫苗毒检测线T2的gB蛋白单克隆抗体可识别猪伪狂犬病毒疫苗毒株以及多数流行强毒株，用于强毒检测线的gE蛋白单克隆抗体可识别多数猪伪狂犬病毒流行强毒株，均具有较广的PRV反应谱。
[0027](2.3.3)单克隆抗体识别抗原表位分析
以阻断ELISA或叠加ELISA对PRV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析，筛选获得分别识别猪伪狂犬病毒gB蛋白不同抗原表位的单克隆抗体mAbl和mAb3，其分别用于胶体金标记和疫苗毒检测线T2印迹；获得特异识别猪伪狂犬病毒标准毒株和流行毒株，而不与疫苗毒疫苗株反应的gE蛋白单克隆抗体mAb2，用于强毒检测线Tl印迹。
[0028](2.3.3.1)阻断ELISA:以HRP分别标记单克隆抗体，ELISA阻断试验鉴定单克隆抗体识别抗原表位的特异性，首先在gB或gE重组蛋白包被的酶标板中逐行加入未标记的单抗，设PRV阳性血清、阴性血清和PBS对照，37°C作用I h ;然后逐列加入HRP标记的单抗，37°C作用I h ;以底物TMB进行显色，读取各检测孔的OD45tl值。显著抑制酶标单抗结合的未标记单抗识别相同或相近的抗原表位，而对酶标单抗结合无明显影响的未标记单抗则识别不同的抗原表位。
[0029](2.3.3.2)叠加ELISA:首先利用包被抗原的酶标板以间接ELISA测定各单抗的工作浓度，绘制抗原饱和曲线。在叠加ELISA试验中，根据抗原饱和曲线适当稀释单抗，并配对加入酶标板各孔，37°C孵育I h?2 h ;分别加入酶标二抗和TMB进行显色，读取各孔OD45tl值，按下列公式计算叠加系数(AI):AI=[2'0D1+2/ (OD^OD2)-1] '100%，其中0D1+2为配对单抗孔的OD45tl值，OD OD 2为两个独立单抗孔的OD 45(|值。两个单抗的Al值小于40%判为识别相同或相近抗原表位；AI值大于40%判为识别不同抗原表位。
[0030](2.4)单克隆抗体的纯化:以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。取I mL小鼠腹水，加入2 mL 0.06 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0),以0.1 mol/L HCl调至pH 4.5 ；于室温搅拌下，逐滴加入33 mL辛酸，4°C静置2 h，15000 r/min离心30 min，弃沉淀；在离心上清中加入 1/10 体积 0.01 mol/L PBS (ρΗ7.4)，以 0.1 mol/L NaOH 调至 pH 7.4 ;于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至终浓度45%,4°C静置2 h, 10000 r/min离心30 min,弃上清；以适量PBS重悬沉淀，对PBS透析过夜，换液3次。以分光光度计法或考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定纯化单克隆抗体IgG的蛋白含量在lmg/ml以上，以酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定小鼠腹水和纯化IgG的抗体效价在1:5X 15和1:4000以上，分装，冻存。
[0031](3)抗猪伪狂犬病毒多克隆抗体的制备。
[0032]以50 mg~100 mg/kg体重的猪伪狂犬疫苗经肌肉注射免疫健康仔猪3~4次,末次免疫10天后，前腔静脉采血，以IPMA测定其血清抗体效价在1:1000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清，以无水硫酸钠(Na2SO4)提取免疫猪血清IgG，取I份免疫血清加
2份 0.01 mol/L PBS (ρΗ7.2)混合，加入无水 Na2SO4至终浓度 18%, 37°C水浴 30min, 4000r/min离心20min,弃上清，以适量PBS (pH7.2)重悬沉淀，加终浓度16%的Na2SO4, 37。。沉淀30min，4000r/min离心20min，弃上清，再以适量PBS (pH7.2)重悬沉淀，以终浓度14%的Na2SOjX淀，4000r/min离心20min，弃上清，以适量PBS(pH7.2)重悬沉淀，对PBS (ρΗ7.2)过夜透析，换液2~3次，测定抗体效价和蛋白浓度(10-20 mg/ml )，所制备抗猪伪狂犬病毒多克隆抗体PAbl可用于检测试纸疫苗毒检测线T2印迹的印制。
[0033](4)兔抗小鼠IgG多克隆抗体的制备
以纯化的小鼠IgG免疫2.0 kg左右健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射50 mg/只，每次加强免疫间隔3 W，以弗氏不完全佐剂乳化抗原肌肉注射，最后一次加强免疫2 w后，以琼脂扩散试验(AGP)测定免疫血清抗体效价高于1:40时，采集高免兔全血，分离血清，以辛酸-硫酸铵法纯化兔抗小鼠IgG，方法同(2.4)单抗纯化，辛酸用量为45 mL/mL血清，测定抗体效价和蛋白浓度(10-20 mg/ml )，所制备兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAb2可用于检测试纸质控线C印迹的印制。
[0034](5)单克隆抗体的胶体金标记
(5.1)胶体金的制备:取100 mL超纯水置于500 mL洁净的锥形瓶，加入I mL 1% (w/V)氯金酸煮沸；在搅拌状态下迅速加入新鲜配制的I mL 1% (w/v)柠檬酸钠溶液，煮沸约3min至溶液颜色由黄色变为紫红色，继续煮沸2 min;待溶液凉至室温，补超纯水至100 mL,以0.2 mol/L K2C03iI pH至9.0，4°C避光可保存数月。
[0035](5.2)最适标记蛋白浓度测定:取待标记抗PRV单抗IgG对20 mmol/L硼酸钠溶液(pH 8.0) 4°C过夜透析。在微孔板中以25 mL超纯水以1:2.1:4.1:8……倍比稀释待标记PRV单抗；各孔加入125 mL胶体金溶液，RT静置5 min ;加入125 mL I mol/L NaCl溶液；各孔颜色随蛋白浓度的降低而由红色变为蓝色。以颜色未变蓝的单抗最高稀释度的蛋白浓度为胶体金最适标记浓度，胶体金标记时，蛋白浓度增加20%。
[0036](5.3)单克隆抗体的胶体金标记:取2 mL最适蛋白浓度的待标记单抗IgG,加入10mL胶体金溶液(pH 9.0),迅速混勻，室温作用10 min?15 min ;加入1/10体积含10% (w/V)牛血清白蛋白(BSA)的20 mmol/L硼酸钠溶液,迅速混勻,RT作用10 min?15 min ；4°C15000 g离心30min，小心移去上清；以含1% (w/v)BSA的20 mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，同上离心,弃上清；重复洗涤I次，以I mL含1% (w/v) BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，4°C保存备用。
[0037](6)检测膜的制备
将硝酸纤维素检测膜切成2.5X30 cm2的长条，置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；用PBS (pH 7.2)将特异识别猪伪狂犬病毒强毒株但不与疫苗毒株反应的gE蛋白单抗、特异识别猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒疫苗株的gB蛋白单抗或多抗IgG和兔抗鼠IgG稀释至1.0 mg/mL,并分别放于忙存池；利用B1jet Quanti 3000以1.0 mL/cm分别将抗PRV gE蛋白单抗、gB蛋白单抗或PRV多抗IgG溶液和兔抗鼠IgG溶液喷点于检测膜中央，形成强毒检测线Tl、疫苗毒检测线T2和质控线C印迹，检测线与质控线相距0.5 cm ;置42°C干燥箱30 min或室温自然干燥；将检测膜置塑料袋，加干燥剂4°C密闭保存备用。
[0038](7)结合垫的制备
将玻璃棉切成1.5X30 cm2的长条，置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；取ImL 胶体金标记物加入 2 mL 含 2% (w/v) BSA>3% (w/v)鹿糖、0.6 mol/L NaCl、0.2% Tween20 (v/v)和 0.1% (w/v)叠氮钠的 20 mmol/L 硼酸钠溶液(pH 8.0);利用 Airjet Quanti3000以15 mL/cm将抗胶体金标记物溶液喷点于玻璃棉；置50°C干燥箱30 min干燥；将胶金垫置塑料袋，加干燥剂4°C密闭保存备用。
[0039](8)样品垫的制备
将玻璃棉切成1.5X30 cm2的长条，以将含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween 20 (v/v)和0.1% (w/v)叠氮钠的PBS (pH 7.2)溶液浸泡玻璃棉条；置50°C干燥箱30 min干燥；将样品垫置塑料袋，加干燥剂RT密闭保存备用。
[0040](9)吸水垫的制备
将玻璃棉切成2.5X30 cm2的长条，将吸水垫置塑料袋，加干燥剂RT密闭保存备用。
[0041](10)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC支撑板，切成7.5X30 Cm2的长板，制备支撑板。
[0042](11)试纸的组装
利用LM5000试纸装配仪或手工将上述材料装配成试纸板。先将检测膜粘贴于支撑板中央，然后将胶金垫和样品垫依次粘贴于检测膜的样品端，各层间重叠I mm?2 mm，再将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，与检测膜重叠I mm?2 mm，在样品端以白色塑胶膜包裹样品垫和胶金垫，塑胶膜上印有检测方向及检测溶液上限标记，在手柄端以蓝色塑胶膜包裹吸水垫。
[0043](12)切割与包装
利用CM4000切割仪将装配好的试纸板切成宽度为0.3 cm的试纸条，将试纸条分装入塑料袋，加干燥剂4°C密闭保存。
[0044]( 13)猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸的实施结构
参见图1，图2，图中，I为支撑板用不吸水薄片条，实施中可采用塑胶薄片条或采用不吸水的硬质纸片材，反应试剂载体吸附层由2，3，4，5，组合而成，从样品端2开始，到手柄端5依次粘贴在支撑层I上面；其中2为样品端样品垫，实施中可使用玻璃纤维棉简称玻璃棉，3为吸附胶体金标记识别猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒株gB蛋白单克隆抗体mAbl的金标玻璃纤维棉，可采用精制玻璃纤维棉，简称为金标垫，4为检测膜，实施中可采用硝酸纤维素膜，5为手柄端吸水垫，采用吸水纸，如滤纸或其它吸水纸均可，试纸条总长8 cm,宽度0.4cm，6为用特异识别猪伪狂犬病毒强毒株但不与疫苗毒株反应的gE蛋白单克隆抗体mAb2在硝酸纤维素膜上印制的强毒检测线印迹“ I ”，7为特异识别猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒疫苗株的gB蛋白单克隆抗体mAb3或抗猪伪狂犬病毒多克隆抗体pAbl在硝酸纤维素膜上印制的疫苗毒检测线印迹“ I ”，8为兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA在硝酸纤维素膜上印制的质控线印迹“ I ”，在检测膜上的强毒检测线印迹、疫苗毒检测线印迹和质控线印迹组合排列为“ III”。9为保护膜，覆盖在玻璃棉及金标玻璃棉的保护膜为9-1，覆盖在吸水层滤纸上的保护膜为9-2。在玻璃棉和金标玻璃棉交界处对应位置的白色保护膜上偏向玻璃棉一方0.5 cm处的保护膜上印有一条标记线10,在标记线10右边印有箭头和Max字样，手柄端保护膜可用黄色或其它颜色，2，3，4，5各层彼此之间交界处纤维互相交叉渗透。
[0045]( 14)猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸实施检测反应原理
当猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸作用带动待检PRV抗原及金标抗体mAbl —起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中，在扩散过程中金标抗体mAbl与待检PRV强毒株或疫苗毒株抗原相结合，形成金标抗体-抗原复合物，PRV强毒株的金标复合物可同时与检测膜上的强毒检测印迹mAb2和疫苗毒检测印迹mAb3结合，生成红棕色“ I I ”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的PAb2或SPA结合，生成红棕色标记“ I ”，两种标记组合叠加，形成三条红棕色阳性标记“ I I I”，表示样品中含有猪伪狂犬强毒；而？1^疫苗毒株的金标复合物不能与检测膜上的强毒检测印迹mAb2结合，只能与疫苗毒检测印迹mAb3结合，生成红棕色“ I ”标记，部分未与抗原结合的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上与质控印迹中的pAb2或SPA结合，生成红棕色标记“ I ”，两种标记组合叠加，形成两条红棕色阳性标记“ I I ”，表示样品中只含有猪伪狂犬疫苗毒；当样品中不含猪伪狂犬病毒抗原时，没有金标抗体-抗原复合物形成，不能与强毒检测印迹和疫苗毒检测印迹结合，则生成阴性标记“ I ”。如果检测膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。
[0046](15)猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸检测实例操作方法
(15.1)检测样品溶液的制备:采集待检猪拭子(咽拭和肛拭)、病(死)猪组织、粪便和疫苗等不同检测样本，加适量PBS或水进行简单混悬或研磨
(15.2)试纸检测:将猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸样品端浸入待检溶液10 S?20 S ;取出试纸水平放置5 min?10 min观察结果。
[0047](15.3)检测结果判定:试纸显现三条红棕色条带(强毒检测线、疫苗毒检测线和质控线)“III ”为PRV强毒阳性，表示待检样品中含有PRV强毒抗原；两条红棕色条带(疫苗毒检测线和质控线)“ I I ”为PRV疫苗毒阳性，表示待检样品中含有PRV疫苗毒抗原；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为PRV阴性，表示待检样品未检出PRV抗原；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0048]实施例一，猪伪狂犬强毒感染快速诊断，采集病(死)猪的病变组织，包括脑、肺、肝、脾、肾、气管、小肠、大肠和淋巴结、流产胎儿等，以1:5或1:10加适量PBS或水进行简单研磨，制备待检溶液，以猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，鉴别诊断病(死)猪强毒感染或疫苗免疫。试纸显现三条红棕色条带(强毒检测线、疫苗毒检测线和质控线)“ I I I”为PRV强毒阳性，表示待检猪为PRV强毒感染；两条红棕色条带(疫苗毒检测线和质控线)“ I I ”为PRV疫苗毒阳性，表示待检猪为PRV疫苗免疫；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为PRV阴性，表示待检猪无强毒感染或疫苗免疫；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0049]实施例二，生猪的猪伪狂犬病毒检验检疫，采集生猪拭子(咽拭和肛拭)或粪便，以1:5或1:10加适量PBS或水进行简单混悬，制备待检溶液，以猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，鉴别检测生猪的强毒感染或疫苗免疫情况。试纸显现三条红棕色条带(强毒检测线、疫苗毒检测线和质控线)“ I I I ”为PRV强毒阳性，表示待检生猪或环境为PRV强毒污染；两条红棕色条带(疫苗毒检测线和质控线)“ I I ”为PRV疫苗毒阳性，表示待检生猪或环境无PRV强毒污染，为PRV疫苗免疫；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为PRV阴性，表示待检生猪无强毒感染或疫苗免疫；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
[0050]实施例三,猪伪狂犬疫苗毒疫苗的质量检测，以1:5或1:10加适量PBS或水溶解猪伪狂犬疫苗毒活疫苗等，制备待检疫苗溶液，以猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸按(15)操作方法进行检测和结果判定，检测猪伪狂犬疫苗毒疫苗的病毒含量和鉴别检测疫苗的强毒污染情况。试纸显现三条红棕色条带(强毒检测线、疫苗毒检测线和质控线)“ I I I ”为PRV强毒阳性，表示待检疫苗为PRV强毒污染；两条红棕色条带(疫苗毒检测线和质控线)“ I I ”为PRV疫苗毒阳性，表示待检疫苗无PRV强毒污染，疫苗毒检测线的显色强度与PRV疫苗含量成正比；仅显现一条红棕色条带(质控线)“ I ”为PRV阴性，表示待检疫苗无PRV强毒污染，同时也不含疫苗毒；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需以另取检测试纸重新检测。
【权利要求】
1.一种猪伪狂犬病毒强毒和疫苗毒鉴别检测试纸，由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，其特征是:金标垫吸附胶体金标记抗猪伪狂犬病毒gB蛋白单克隆抗体mAbl，检测膜的强毒检测线Tl为抗猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体mAb2印迹“ | ”，疫苗毒检测线T2为抗猪伪狂犬病毒多克隆抗体pAbl或gB蛋白单克隆抗体mAb3印迹“ | ”，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹“ I ”。
2.根据权利要求1所述的鉴别检测试纸，其特征是:猪伪狂犬强毒感染时在检测膜显现强毒检测线Tl，疫苗毒检测线T2和质控线C三条红色条带“ I I |”，猪伪狂犬疫苗毒免疫时在检测膜显现疫苗毒检测线T2和质控线C两条红色条带“ I I ”，无猪伪狂犬病毒则只显现质控线C 一条红色条带“丨”。
3.根据权利要求1所述的鉴别检测试纸，其特征是:单克隆抗体mAbl和mAb3均特异识别猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒疫苗株，分别识别猪伪狂犬病毒gB蛋白的不同抗原表位，单克隆抗体mAb2特异识别猪伪狂犬病毒强毒株gE蛋白，但不与疫苗毒株反应。
4.根据要求I或3所述的鉴别检测试纸，其特征是:鉴别检测试纸的猪伪狂犬病毒反应谱广，疫苗毒检测线T2可检测猪伪狂犬疫苗株以及多数流行强毒株，强毒检测线Tl可检测多数猪伪狂犬病毒流行强毒株，可实现对猪伪狂犬病毒主要流行毒株与疫苗株的鉴别检测。
【文档编号】G01N33/558GK104459144SQ201410763138
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】乔松林, 杨继飞, 李青梅, 郭军庆, 邢广旭, 柴书军, 万博, 解伟涛, 王寅彪, 刘肖, 邓瑞广, 张改平 申请人:河南省农业科学院