一种诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片。通过合成针对三种病毒膜蛋白胞外表位的多肽，进行免疫母鸡，每一种病毒都筛选出一对IgY抗体；制备固相支持物，待与每种病毒一对抗体中其中一个IgY抗体孵育后，IgY抗体会结合在固相支持物上，当结合有IgY的固相支持物与待检样品反应，样品中的大部分病毒颗粒被特异性的结合；加入一对抗体中的另外一个IgY抗体，加入碱性磷酸酶标记的二抗，洗涤、分离后加入底物AMPPD，AMPPD生产中介体AMPD；AMPD从高能激发状态回到低能量的稳定态，同时发射光子；通过光量子阅读系统记录发光强度，并从标准曲线上计算出待测样品中病毒颗粒的数量。
【专利说明】一种诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫诊断领域，具体的说是一种运用生物信息学的方法预测引起仔猪病毒性腹泻的三种病毒膜蛋白胞外部分表位，根据表位、结构、同源性的具体特点，合成一定长度的多肽，免疫母鸡，获得灵敏度高、特异性强的三对IgY抗体，然后制备固相支持物，采用基因芯片的制作方法，通过检测三种病毒颗粒表面特定蛋白质的多少来判定病毒颗粒的数量和种类，进而快速诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片。
【背景技术】
[0002]猪流行性腹湾(porcine epidemic diarrhea，PED)是猪流行性腹写病毒(porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪肠道传染性疾病。目前其在临床上与猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)和猪轮状病毒(porcinerotavirus, PRV)腹湾共存混合感染，给该病的防控和研宄带来极大的不利。猪流行性腹湾仅发生在猪上，各种年龄的猪都能感染。本病多发于寒冷季节。春秋季节也有小规模流行发生。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率高达100%，尤以对哺乳仔猪的危害最为严重。成年母猪发病率为70%-90%。虽然PED首次在欧洲发生，但是目前已经成为包括中国、韩国、日本、菲律宾以及泰国等亚洲国家猪产业中严重的传染性疾病，造成了巨大的经济损失。我国目前猪流行性腹泻的发病率仍呈逐年上升趋势。爆发该病时无特效抗病毒药物可以使用。故早期风险评估诊断对于防控的作用就显得非常重要。
[0003]随免疫学的不断发展，运用各种新的免疫技术，如化学发光技术、时间分辨荧光免疫测定技术、荧光偏振免疫分析测定技术等进行自动化免疫分析的仪器不断涌现。它们不仅提高了工作人员的效率，还大大提高了检测的准确度和灵敏度，其中有的灵敏度可达Hg甚至Pg级水平。
[0004]鸡卵黄抗体是从鸡蛋的蛋黄中分离得到的免疫球蛋白，相比别的免疫球蛋白，鸡免疫球蛋白具有更好的稳定性，加上鸡免疫球蛋白来之于鸡蛋的蛋黄，产量非常丰富，还增加了生物安全性，且提纯工艺简单，还具有一定的动物福利。同时母鸡与哺乳动物亲缘关系较远，也不结合类风湿因子。减少了在免疫检测中假阳性反应机会。种种优势，使得鸡免疫球蛋白在检测诊断产品中的应用具有很大的市场价值。
[0005]蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研宄蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA-蛋白质、RNA-蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等，蛋白芯片能同时在同一个样本中对多个细胞因子进行分析，对全面分析治病因子，给疾病的诊断和治疗是很有价值。也是时下诊断产品应用中的热点。
【发明内容】
[0006]本发明目的即在于提供一种快速、廉价、全面的诊断猪病毒性腹泻的免疫化学发光蛋白芯片。
[0007]本发明涉及一种新型诊断猪病毒性腹泻的免疫化学发光蛋白芯片。通过合成针对三种病毒(roEV/TGEV/PRV)膜蛋白(Μ蛋白，S蛋白)胞外表位的多肽，进行免疫母鸡，每一种病毒都筛选出一对特异性强，灵敏度高的IgY抗体。然后制备固相支持物，将琼脂糖铺在经过处理的玻片上，进行环氧化和羧基化处理，让琼脂糖连接羧基(COOH)，再与2-巯基乙醇反应，获得只结合IgY的固相支持物，待与每种病毒一对抗体中其中一个IgY抗体孵育后，IgY抗体会结合在这个固相支持物上，当结合有IgY的固相支持物与待检样品反应，样品中的大部分病毒颗粒被特异性的结合。加入一对抗体中的另外一个IgY抗体，加入碱性磷酸酶标记的二抗，经温育后形成固相包被抗体-抗原-抗体-酶标记二抗复合物。洗涤、分离后加入底物AMPro作为化学发光剂，AMPPD在碱性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生产中介体AMPD。AMPD很快分解，从高能激发状态，回到低能量的稳定态，同时发射光子，这种发光稳定、持续时间可长达I小时。通过光量子阅读系统记录发光强度，并从标准曲线上计算出待测样品中病毒颗粒的数量。
[0008]本发明首次采用只结合IgY抗体的固相支持物作为反应平台，也首次采用三种病毒(roEV/TGEV/PRV)膜蛋白(M蛋白、S蛋白)胞外表位的多肽，免疫母鸡，每种病毒都获得一对灵敏度和特异性强的抗体，还首次将这三种病毒的检测放在一个反应体系中，组成一个蛋白芯片。
[0009]本发明包括以下步骤:1.多肽位置和长度的选择；2.母鸡的免疫；3.抗体的纯化和筛选；4.固相支持物的制备；5.酶标二抗的制备。
【具体实施方式】
[0010]本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明:
[0011]实施例:
[0012]1.多肽位置和长度的选择
[0013]利用生物信息学的方法分析出三种病毒膜蛋白(M蛋白和S蛋白)胞外部分具有特征性表位的蛋白序列，然后分析这些序列在蛋白和膜上的位置、同源性等，根据相应的特点，合理选择一定的长度，并送上海生物工程有限公司合成。
[0014]2.母鸡的免疫
[0015]将合成的多肽与BSA偶连，第一次用福氏完全佐剂完全乳化，皮下多点注射免疫母鸡，第二次和接下来的免疫均采用非完全佐剂，时间间隔为半个月，第四次免疫完成后，提取抗体，检验效价，效价、灵敏度和特异性未达到我们的标准的鸡，均被淘汰掉，符合要求的将继续免疫。
[0016]3.抗体的纯化和制备
[0017]根据生产的需要，选着一定量的鸡蛋，用体积浓度75%的酒精清洗鸡蛋表面，用打蛋器分离蛋清和蛋黄，取蛋黄，用7?8倍体积的去离子水溶解、搅拌，用硫酸铵沉淀法初步提取抗体，利用经过鉴定的病毒，筛选出一对灵敏度和特异性好的抗体，最后用IgY柱子提取总的IgY抗体。
[0018]4.固相支持物的制备
[0019]用浓硫酸和高锰酸钾浸泡玻璃载体，用去离子水反复冲洗、烘干，用带有一个平方厘米大小正方形孔径的胶板贴在玻璃上，务必整齐平整，将琼脂糖在烧杯中加热至融化，用移液枪吸取处于溶化状态的琼脂糖，添加到胶板的孔径中去，待琼脂糖冷却后，进行环氧化和羧基化处理，让琼脂糖连接羧基(COOH)，再与2-巯基乙醇反应，使琼脂糖表面布满巯基。将每种病毒一对抗体中的其中一个用毛细管点在带有巯基的琼脂糖表面，37度孵育两个小时，然后用PBS-T清洗，干燥，接着用惰性蛋白封闭一个小时，清洗，干燥，最后用标签贴封装，放入2-8 °C冰箱储备待用。
[0020]5.酶标二抗的制备
[0021]选取经过筛选，具有非常少的非特异性的羊抗鸡抗体，使用HRP酶标试剂试剂盒，标记，用阴离子交换柱子分离，纯化，同时检测酶标效率。
[0022]检测方法:
[0023]用100份已知的三种单病毒样本；100份已知的感染PEDV，TGEV, PRV三种病毒猪的粪便样本；100份已知的感染PEDV，TGEV 二种病毒猪的粪便样本；100份已知的感染PEDV, PRV 二种病毒猪的粪便样本；100份已知的感染TGEV，PRV 二种病毒猪的粪便样本；100份已知健康猪粪便样本进行随机鉴定。琼脂糖上包被的抗体与样本孵育后，样本中的大部分病毒颗粒被特异性的结合。加入混合三种病毒的抗体，加入酶标二抗，经温育后形成固相包被抗原-抗体-酶标记二抗复合物。洗涤、分离后加入底物AMPH)作为化学发光剂，碱性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生产中介体AMPD。AMPD很快分解，从高能激发状态，回到低能量的稳定态，同时发射光子，通过光量子阅读系统记录发光强度，并从标准曲线上计算出待测病毒颗粒的浓度。PEDV感染的阳性样本中，病毒颗粒在55IU/ml?3000IU/ml ；TGEV感染的阳性样本中，病毒颗粒在40IU/ml?1800IU/ml ;PRV感染的阳性样本中，病毒颗粒在45IU/ml?900IU/ml ;健康猪样本三种病毒的浓度均在10IU/ml以下，故在10IU/ml可判定为阴性；任意一种病毒高于40IU/ml判定为高风险群体。
【权利要求】
1.一种诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片，其特征在于，包括如下程序:通过合成针对三种病毒roEV/TGEV/PRV膜蛋白胞外表位的多肽，进行免疫母鸡，每一种病毒都筛选出一对IgY抗体；然后制备固相支持物，将琼脂糖铺在玻片上，进行环氧化和羧基化处理，让琼脂糖连接羧基，再与2-巯基乙醇反应，获得只结合IgY的固相支持物，待与每种病毒一对抗体中其中一个IgY抗体孵育后，IgY抗体会结合在所述固相支持物上，当结合有IgY的固相支持物与待检样品反应，样品中的大部分病毒颗粒被特异性的结合；加入一对抗体中的另外一个IgY抗体，加入碱性磷酸酶标记的二抗，经温育后形成固相包被抗体-抗原-抗体-酶标记二抗复合物；洗涤、分离后加入底物AMPro作为化学发光剂，AMPPD在碱性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生产中介体AMPD ；AMPD很快分解，从高能激发状态，回到低能量的稳定态，同时发射光子；通过光量子阅读系统记录发光强度，并从标准曲线上计算出待测样品中病毒颗粒的数量。
2.根据权利要求1所述的诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片，其特征在于:用三种病毒roEV/TGEV/PRV膜蛋白胞外表位的多肽来制备抗体，来间接的检测病毒颗粒的数量。
3.根据权利要求1所述的诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片，其特征在于:用只结合IgY的固相支持物，作为反应的平台。
4.根据权利要求1所述的诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片，其特征在于:将三种病毒颗粒的检测放在同一个反应体系中，同时对样本中的三种病毒颗粒进行分析。
【文档编号】G01N33/68GK104459156SQ201410766011
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】周丽华 申请人:周丽华