一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素a的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法。属于食品安全生物毒素检测【技术领域】。主要步骤包括食品中酵米面黄杆菌毒素A的提取、浓缩。运用串联质谱，使用ESI源，在负离子模式下，确定了酵米面黄杆菌毒素A的分子离子峰(M-1离子)为485.4，三个有代表性特征子离子，分别为441.4、397.3、321.5。将浓缩好的样品用UPLC经Waters C18 2.1mm×100mm，1.8μm分离，在MRM模式下进行定性定量分析。本发明解决了TLC和HPLC检测方法的不足，简化了提取步骤、提高了检测灵敏度和准确度，重复性好，易于推广应用。
【专利说明】一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法。属于食 品安全生物毒素检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 酵米面黄杆菌是从引起食物中毒的酵米面中分离出来的一种细菌。目前认为该菌 是引起食物中毒细菌中死亡率较高的一种。流行病学调查，我国近年在广西、云南、湖北、广 东、四川、河北、江苏等省发生多起酵米面食物中毒事件。山东、河南、河北等省因进食变质 银耳也发生同类中毒。中毒多发生在农村，特别是山区、半山区，城镇偶见。引起中毒的主 要食品是酵米面（玉米加水浸泡10?30天，用水洗，磨浆过滤，沉淀晾干成粉，加工后 做成的食品）和变质的银耳。中毒发病急、病情严重、发展迅速，病死率高达30?90%，至 今尚无特效的治疗方法。
[0003] 目前检测酵米面黄杆菌毒素A(米酵菌酸）的国家标准检测方法仅有GB/T 5009. 189-2003银耳中米酵菌酸的测定中规定的薄层色谱法和高效液相色谱法，但该方法， 仅能检测银耳中的黄杆菌毒素A(米酵菌酸），且样品提取复杂，耗时长，检测灵敏度低，无 法准确定性等问题。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法。
[0005] 本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法包括步骤如下：
[0007] (1)样品提取步骤；
[0008] (2)酵米面黄杆菌毒素A的分子离子峰、特征子离子峰及MM参数的确定；
[0009] (3)样品定性定量检测。
[0010] 所述样品提取具体步骤如下：
[0011] ⑴不含油样品：
[0012] 准确称取2.OOOg食物，加IOml纯水匀浆，用6mol/LHCL调至pH2?3,8000r/min 离心lOmin，取上清液，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40°C旋转蒸发至干，用 甲醇定容至lml，待测；
[0013] (2)含油样品：
[0014] 准确称取2.OOOg食物，加IOml40g/L碳酸氢钠匀浆，8000r/min离心lOmin，取上 清液，加石油醚IOml提取，弃去石油醚，用6mol/LHCL调至pH2?3,加正己烧提取两次，每 次10ml，合并正己烷，40°C旋转蒸发至干，用甲醇定容至lml，待测；
[0015] 所述确定酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰、特征子离子峰及
[0016] MM参数具体的步骤如下：
[0017] (1)把酵米面黄杆菌毒素A的标准品，配置成lmg/kg的浓度，通过蠕动泵注入串联 质谱仪，找到酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰（母离子，M-I离子）为485. 4、
[0018] (2)通过调节串联质谱仪的碰撞气能量（CE)和去簇电压（DP)撞击酵米面黄杆 菌毒素A分子离子峰（母离子，M-I离子）485. 4,找到三个有代表性特征子离子，分别为 441. 4,397. 3,321. 5〇
[0019] (3)通过串联质谱仪把碰撞气能量（CE)和去簇电压（DP)调节到最佳状态。选择 测定酵米面黄杆菌毒素A的离子对、碰撞电压和去簇电压详见表1。
[0020] 表1酵米面黄杆菌毒素MRM监测参数
[0021]
【权利要求】
1. 一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素 A的方法，其特征在于方法包括 步骤如下： (1) 样品提取步骤； (2) 酵米面黄杆菌毒素 A的分子离子峰、特征子离子峰及MM参数的确定； (3) 样品定性定量检测。
2. 如权利要求1所述的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素 A的方法，其特 征在于：所述样品提取具体步骤如下： (1) 不含油样品： 准确称取2. OOOg食物，加 IOml纯水匀浆，用6mol/L HCL调至pH2?3,8000r/min离心 lOmin，取上清液，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40°C旋转蒸发至干，用甲醇定 容至lml，待测； (2) 含油样品： 准确称取2. OOOg食物，加 IOml 40g/L碳酸氢钠勾衆，8000r/min离心lOmin，取上清 液，加石油醚IOml提取，弃去石油醚，用6mol/LHCL调至pH2?3,加正己烧提取两次，每次 IOml，合并正己烷，40°C旋转蒸发至干，用甲醇定容至Iml，待测。
3. 如权利要求1所述的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素 A的方法，其特 征在于：所述确定酵米面黄杆菌毒素 A分子的离子峰、特征子离子峰及MM参数具体的步骤 如下： (1) 把酵米面黄杆菌毒素 A的标准品，配置成lmg/kg的浓度，通过蠕动泵注入串联质谱 仪，找到酵米面黄杆菌毒素 A分子离子峰（母离子，M-I离子）为485. 4 ; (2) 通过调节串联质谱仪的碰撞气能量CE和去簇电压DP撞击酵米面黄杆菌毒素 A分 子离子峰（母离子，M-I离子）485. 4,找到三个有代表性特征子离子，分别为441. 4、397. 3、 321. 5 ； (3) 通过串联质谱仪把碰撞气能量CE和去簇电压DP调节到最佳状态，选择测定酵米面 黄杆菌毒素 A的离子对、碰撞电压和去簇电压详见下表；
〇
4. 如权利要求1所述的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素 A的方法，其特 征在于：所述样品检测具体步骤如下： (1)对步骤2处理后的样品使用超高效液相色谱和在ESI负离子模式下用串联四极杆 质谱进行定性定量分析； ① 色谱条件为！Waters BEH HILIC 1.7 μπι 2. IX IOOmm色谱柱及同种填料不同柱形的 色谱柱；进样量5?20 μ 1 ;柱温为30°C;流动相A为水，其中含有0. 1 %甲酸：B为甲醇，流 动相比率A:B = 30% :70%，等梯度洗脱3min，流速300 μ1/π?η ; ② 质谱条件为：离子化方式：电喷雾离子源负离子模式；检测方式:MRM ;碰撞气： Midium ;气帘气：25psi ;雾化气：45psi ;加热气：55psi ;喷雾电压：-4500V ;去溶剂温度： 400°C ;扫描时间：20ms ; (2) 对步骤2处理后的样品进行定性测定：标准品及样品溶液按照上述UPLC/MS/MS测 定条件分别进行测定，如果进行样品测定时，检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致， 并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的3个二级特征离子均出现，且与标准样品的3 个特征离子相一致，则可判断样品中存在酵米面黄杆菌毒素 A ; (3) 对步骤2处理后的样品进行定量测定：本方法中UPLC/MS/MS采用外标校准曲线法 定量测定，为减少基质对定量的测定的影响，采用不含酵米面黄杆菌毒素 A的样品洗脱液 来配制标准系列溶液，绘制标准曲线，并且保证所测样品中酵米面黄杆菌毒素 A的响应值 均在仪器的线性范围内。
【文档编号】G01N30/88GK104515823SQ201410781469
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】林佶, 许燕, 赵世文, 徐丹先 申请人:云南省疾病预防控制中心