一种筛选他克莫司于免疫t细胞中药物作用靶位的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。本筛选他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位的方法利用蛋白质组学技术，对他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选，方法包括以下步骤：步骤1)建立他克莫司于免疫T细胞作用样品组群、步骤2)制备免疫T细胞二维电泳蛋白质样品、步骤3)双向凝胶电泳、步骤4)图像采集分析得出结果。本发明筛选他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，操作思路明确、结果真实可靠，克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低的缺陷，为临床用药提供了具有药理意义和指导作用的检测结果。
【专利说明】 一种筛选他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。
【背景技术】
[0002]他克莫司(Tacrolimus)又名FK506，是从链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)中分离的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。为一种强效的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2 (L-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较他克莫司强100倍。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应性皮炎(AD)、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的作用。目前，临床上针对个体病患，他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位一直无法确定，且常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低，难以在临床用药时提供具有药理意义和指导作用的检测结果。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，提供一种利用蛋白质组学技术对他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。
[0004]为解决上述技术问题，本筛选他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位的方法利用蛋白质组学技术，对他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选，其具体方法包括以下步骤:
[0005]步骤I):将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试验组中分别加入不同浓度的他克莫司，整体形成他克莫司对免疫T细胞模型的药物作用样品组群；
[0006]步骤2):将步骤I)所述的他克莫司对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管；收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液，然后加入等体积lOmol/L脲、50mmo 1/L DTT,5%的3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmo 1/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融细胞5?8次；放入冰盐浴中静置30min ;然后升温至10°C的条件下离心2h ;离心完成后取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转移至70°C的保温箱中储存存储备用；
[0007]步骤3):将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量lOmol/L尿素、5%的3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L 二硫苏糖醇0.5%的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在平衡液中平衡30min ;平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶；
[0008]步骤4):将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与他克莫司作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比，获得他克莫司作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质；
[0009]步骤5):将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱，测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位。
[0010]本发明筛选他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，操作思路明确、结果真实可靠，克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低的缺陷，为临床用药提供了具有药理意义和指导作用的检测结果。
【具体实施方式】
[0011]本将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试验组中分别加入不同浓度的他克莫司，整体形成他克莫司对免疫T细胞模型的药物作用样品组群；
[0012]步骤2):将步骤I)所述的他克莫司对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管；收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液，然后加入等体积lOmol/L脲、50mmo 1/L DTT,5%的3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmo 1/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融细胞5?8次；放入冰盐浴中静置30min ;然后升温至10°C的条件下离心2h ;离心完成后取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转移至70°C的保温箱中储存存储备用；
[0013]步骤3):将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量lOmol/L尿素、5%的3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L 二硫苏糖醇0.5%的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在平衡液中平衡30min ;平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶；
[0014]步骤4):将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与他克莫司作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比，获得他克莫司作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质；
[0015]步骤5):将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱，测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位。
[0016]本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书描述的产品，均落入本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种筛选他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，其特征是:本方法利用蛋白质组学技术，对他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选，其具体方法包括以下步骤: 步骤I):将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试验组中分别加入不同浓度的他克莫司，整体形成他克莫司对免疫T细胞模型的药物作用样品组群； 步骤2):将步骤I)所述的他克莫司对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管；收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液，然后加入等体积lOmol/L脲、50mmol/L DTT,5%的3-[ (3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmo 1/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融细胞5?8次；放入冰盐浴中静置30min ;然后升温至10°C的条件下离心2h ;离心完成后取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转移至70°C的保温箱中储存存储备用； 步骤3):将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量lOmol/L尿素、5%的3-[(3_胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L 二硫苏糖醇0.5%的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在平衡液中平衡30min ;平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶； 步骤4):将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与他克莫司作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比，获得他克莫司作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质； 步骤5):将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱，测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得他克莫司于免疫T细胞中药物作用靶位。
【文档编号】G01N27/447GK104483371SQ201410850436
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】李化会, 莫晓媚, 刘丰海, 赵龙 申请人:青岛市市立医院