出血性大肠杆菌o157:h7免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供了一种出血性大肠杆菌O157:H7的胶体金快速检测试纸条，其特征在于，包括：位于底部的衬板，以及在该衬板上依次排列的样品垫、与样品垫连接并且喷涂有由保藏号为CGMCC?No.6610的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体GS2-D3与胶体金偶联后形成的金标抗体的金标垫、与该金标垫相连接的NC膜以及与NC膜相连接的吸收垫。其中，NC膜上具有由保藏号为CGMCC?No.8458的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体3A8F11B10E7喷涂于NC膜上所形成的检测线。本实用新型对出血性大肠杆菌O157:H7检测的特异性和灵敏性均较高。
【专利说明】出血性大肠杆菌0157:H7免疫胶体金快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种免疫胶体金快速检测试纸条，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]在食品微生物检测中，检测大肠杆菌的含量是一个重要的食品安全指标。2003?2004年的统计结果显示，我国食物中毒致病因素依次为微生物性、化学性、有毒动植物性病原。微生物性病原是导致食物中毒的主要因素，中毒人数最多。食源性致病菌快速检测一直是研究关注的焦点。
[0003]肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhageEscherichia coli,EHEC)0157:H7 引起的肠道感染性疾病已成为一个严重的全球性公共卫生问题，该病可引起腹泻、出血性肠炎、继发溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。HUS和TTP的病情凶险，其中3%?5%的HUS病人死亡，约有12%的HUS病人有严重的后遗症，危害十分严重。自1982年美国首次发现该病以来，在世界上许多国家相继发生了暴发和流行，尤其1996年5月?8月间日本发生了由出血性大肠杆菌0157:H7引起的人类历史上规模最大的一次暴发流行，累积患者近万人，并有数人死亡，因此引起了世界的普遍关注。我国在1987年就发现该种大肠杆菌引起的散在感染，近几年已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫和腹泻病患者中检出该致病菌，存在着疫情暴发、流行的潜在威胁。目前市场上有多种产品用于检测出血性大肠杆菌0157:H7，其中有一些是使用免疫胶体金方法的试纸条，但是现有技术中的免疫胶体金试纸条所使用的抗体往往是使用单克隆抗体作为金标抗体和多克隆抗体作为检测抗体配合使用，因此存在着检测精度低和交叉反应高、试纸条有效期短等问题，对检测的精度和准确度造成了一些影响。
实用新型内容
[0004]为解决上述问题，本实用新型提供了一种出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金快速检测试纸条，其特征在于，包括:一种出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金快速检测试纸条，其特征在于，包括:
[0005]位于底部的衬板，以及在该衬板上依次排列的样品垫、与样品垫连接并且喷涂有单克隆抗体GS2-D3与胶体金偶联后形成的金标抗体的金标垫、与该金标垫相连接的NC膜以及与NC膜相连接的吸收垫，
[0006]其中，NC膜上具有单克隆抗体喷涂于NC膜上所形成的检测线。
[0007]另外，本实用新型的出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金快速检测试纸条，还可以具有这样的特征:其中，金标抗体是单克隆抗体GS2-D3与胶体金偶联后形成的。
[0008]实用新型作用与效果
[0009]实验结果表明本实用新型的出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条对出血性大肠杆菌0157:H7的检测特异性和灵敏性均较高。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图；
[0011]图2是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金PH结果；
[0012]图3是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体偶联胶体金结合量结果；
[0013]图4是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的结构不意图；
[0014]图5是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体组合配对结果；
[0015]图6是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的胶体金试纸条灵敏度结果；
[0016]图7是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果；以及
[0017]图8是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的胶体金试纸条模拟带菌实验结果。
[0018]保藏信息:
[0019]1.抗出血性大肠杆菌0157: H7的单克隆抗体的杂交瘤细胞株GS2-D3于2012年9月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101，
[0020]保藏号为中国普通微生物菌种保藏管理中心化6110:，中国，北京市)如.6610。
[0021]2.抗出血性大肠杆菌0157:H7的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A8F11B10E7于2013年9月保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)Jia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101
[0022]保藏号为:CGMCCN0.8458。
【具体实施方式】
[0023]以下结合附图介绍本实用新型的【具体实施方式】:
[0024]首先介绍本实用新型实施例中所使用的试剂与仪器:
[0025]主要试剂
[0026]弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、PEG、TWEEN-20Sigma ；BSA上海世泽生物科技有限公司；胶体金溶液上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)135S Millipore ；羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔生工生物工程股份有限公司。
[0027]主要仪器
[0028]酶标仪SpectraMax M2 购自 Molecular Devices ;Nanodrop2000C 购自 ThermoScientific ;点样仪AD6010购自B10-D0T ;扫描仪Phantom V9购自MICROTEK ;恒温培养摇床SPH-100B购自上海世平；蛋白纯化仪B1Logic? LP358BR5057购自B1-RAD ;单人净化工作台SW-SJ-2D型购自苏州净化。
[0029]一、出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体制备
[0030]1.免疫原和阳性标准品的准备
[0031 ] 出血性大肠杆菌0157:H7 (ATCC43895)接种在山梨醇麦康凯(SMAC)平板上，37 °C培养24h，挑取单菌落于改良E.C新生霉素增菌肉汤，37 °C、150r/min振荡培养17h，计数，加入0.3%甲醛溶液室温灭活I天。用生理盐水调整出血性出血性大肠杆菌0157:H7 (ATCC43895)浓度至 5 X 109CFU/ml 作为免疫原。
[0032]用生理盐水调整浓度为108CFU/ml出血性大肠杆菌0157:H7作为阳性对照标准品，改良E.C新生霉素增菌肉汤为阴性对照标准品。
[0033]2.单克隆抗体的制备过程
[0034]I)实验动物:选3只8周龄，体重20g左右、雌性Balb/c小鼠为实验动物。
[0035]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每间隔2周用同样剂量加强注射一次。
[0036]3)采血:3次加强免疫后从尾部静脉采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效价。待效价不再上升，腹腔注射同样量免疫原，3天后按照常规方法进行细胞融合。
[0037]4)细胞融合:取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50%PEG作用下常规融合，分别接种于96孔培养板，置于37°C、5% C02培养箱培养。
[0038]5)杂交瘤细胞筛选:采用间接非竞争酶联免疫法，筛选强阳性孔的杂交瘤细胞，将其转移至24孔培养板。
[0039]6)克隆培养及抗体制备:用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底1/10时，再用同样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 — 4次，直至阳性率达到100%。将杂交瘤细胞扩大培养，注射于经石蜡油预处理的Balb/c小鼠腹腔，每只2X106个杂交瘤细胞，7?10天小鼠腹部隆起，活体穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化抗体。
[0040]筛选出3株稳定分泌抗出血性大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为GS2-D3(简称D3)、3A8F11B10E7(简称E7)、5H11D8A5B9 (简称B9)，分别进行亚类及亚型鉴定、测定浓度、相对分子质量，并对制备的单克隆抗体通过交叉反应进行特异性验证。
[0041]3.单克隆抗体的亚型鉴定
[0042]通过单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定各抗体亚类、亚型，表3结果为显色终止后450nm处OD值，由表2可得，B9亚类为IgGl，轻链亚型为κ ;Ε7亚类为IgG2a，轻链亚型为K ;D3亚类为IgGl,轻链亚型为κ。
[0043]表I单克隆抗亚类、亚型结果
[0044].编
B9 17 D3
抗体视类、___
IgGl1,715 0,23-1 1,356
I g(；2a(1 2471.2480.183
I gC2h0,2290, 1520, 167
— IgG 30.1390.1270.152
IgA0.1600,0930, 144
IgM0,2280.2060.155
κ1.5261,2321.283
λ0.1220.1260.1,12
[0045]4.单克隆抗体的纯化、纯度及效价检测
[0046]腹水先用辛酸-硫酸铵法粗提后，再用Protein G Sepharose亲和层析法纯化，将制备纯化所得抗体D3、E7、B9通过NanOdrOp2000C测定仪测得浓度如表2，DlO浓度为
4.5mg/mL, FlO浓度为3.5mg/mL,该浓度适于抗体的使用与保存,不需再进行浓缩或稀释。
[0047]用SDS-PAGE分析纯度，5%积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部，凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察结果。图1是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的单抗SDS-PAGE电泳图；如图1所示，泳道1、2、3分别为D3、E7和B9，结果显示，D3重链分子量为48kDa，轻链分子量为26kDa ；E7重链分子量为48kDa，轻链分子量为28kDa ；B9重链分子量为48kDa，轻链为25kDa。
[0048]表2单克隆抗体浓度
[0049]
抗体编号 |D3 |E7 |B9
浓度(mg/mL)丨4.0 |3.0 |4.0
[0050]单克隆抗体效价测定的步骤如下:
[0051]I)将饱和培养细菌抗原连同培养基在对应的孔中加入100μ 1，4°C过夜(约包板36h)。
[0052]2)倒空液体并拍干残留液体，用250 μ I洗涤液清洗3次。
[0053]3)每个孔中加 100 μ 11% BSA，37°C封闭 Ih0
[0054]4)倒空液体并拍干残留液体，用250 μ I洗涤液清洗3次。
[0055]5)每个孔中加100 μ I血清，37°C孵育lh。
[0056]6)倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250 μ IPBST洗涤液洗涤3次。
[0057]7)每个孔中50 μ I的HRP标记的二抗(sigma)，室温孵育lh。
[0058]8)用洗涤液浸泡5min，倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加250 μ IPBST洗涤液洗漆3次。
[0059]9)每个孔中加100 μ I底物，显色30min，加终止液100 μ I并立即在0D450读数。
[0060]表3.两株单克隆抗体效价测定结果(OD45tl)
[0061]抗稀释度
稀释^:腦01:画)卜:1。，麵1:50，000 1:100, 000
^^-------
GS2-D32.2382,157 2.1.161.3570.618
3A8F11B10E7 —2.262 —2.189一| 2.0731.649O, 769
[0062]5.单克隆抗体交叉反应的测定
[0063]I)抗原包被:将78种108cfu/ml菌液浓度的致病菌加入到酶标板中，每个致病菌加3各孔，每孔100 μ I，4°C，包被过夜。
[0064]2)封闭:洗板3遍后，每孔加入3%85六20(^1，371:孵育211。
[0065]3)洗板3遍。每孔加入稀释好的单克隆抗体100 μ 1，37摄氏度孵育lh。
[0066]4)洗板3遍。加入已稀释好的山羊抗鼠二抗到所有微孔中，每孔100μ 1，37摄氏度孵育Ih。
[0067]5)洗板4遍。加入底物显色液，37°C,避光显色15min。于450nm波长下读取结果，结果见表4。
[0068]表4单克隆抗体E7、D3的交叉反应
[0069]
l-f ^I E7 (C)Dw,)交义
满神名称菌株S号D3 (ODw)
反M/:
01出血献涵杆酋
ATCC 43895 0.S00 0.797 0.779 0.923 0.983 0.896 +
()157:117
02幽血性大藤杆證
ATCC 43889 0.757 0.759 0.768 0.823 0.835 0.834 +
0157:117
03_ 沟腸扦菌 CMCC(B) 4530i 0.051 0,051 0J54 0,051 0,051 0.054 一
04粪肠球菌ΛΤΟ: 29212 0.057 0.059 0.067 0.057 0.059 0.06? -
05大肠埃希氏:貨ATLX: 8B9 0.065 0.075 0.054 0.065 0.075 0.054 —
06大肠埃希氏駕ATCC 25922 [ 0.057 0.059 0.067 | 0.051 0.054 0.067 —
[0070] 07大肠攻￠1?;?CMCC* B) 441020.0670.0650.06?0.067一
08大肠-?,令氏,辑80990.0570.059 (S.06? I0.0590.067(1.067—
W攀増李斯特菌ATCC 432510Λ10,0650,075 |0,0590,0670.067-
10離場李斯特菌ATLX'剛丨 50.H510.051054 丨》鳥5?.075().!)54—
11離纖李Jlf特菌CM(’C'iB) 540020.(1570.059 (1.067 |0.0650.0750.067-
12单墻辛Jlf特蘭Λ?(Λ' !39320.0570.059 0.0670.0570.059丨).W?7—
13馨靖李fPltfiATCC191120.0570.059 0.067 |0.0570.0590.067-
14学if 學斯特霧ATCC !91140.0750.059 0.0670.0570.0590.067—
15李斯特菌ΛΤΠ.'1*>Ι1?0A)<40.0650JT50,0510.0510,054-
16学-增率ATCC 191170.0670.0650.075 |0.0570.0590.067-
17单墦李斯特菌ΛΤ(Τ I ?川 50.067().()570.0590,0570.05?)0.067- 11单增奪:斯特氏ftATCC I9II!0.0570.0590.06T0.0570.0590.06?—
19ilUt个斯持氏袋ATCX 191190.0610.0650.075 I0.0570.0590.067—
20格氏李斯特氏菌ΛΤ(Χ 254010.05?0,059 0,06?0,0750,0570.05?-
21成氏乍斯特氏崗ATCC 358970.0610.0650.075 |0.0510,0540.()57-
22无害1T1-增伞斯t---CICC 102970.0650,0750.057 I0,05?0.0670.057—
23K炎沙Π 氏SiATCC 130760.0510.051?.054 丨(J.0510.0590.47-
24IffiR乱沙Π 氏蘭CICC 214?0,0570,06?0J5? I0,0670.0650,062—
25鼠伤寒沙门氏鐘CMCC(B:t 50丨150.0570.059 0.067 |0.0590.0650.057—
26鼠仿寒沙Π 氏 WCTCX: 229560.0560.0650,06? I0.0650,0510,69—
27鼠伤寒沙门氏 1?ATCC 1402?[ 0.0610,0650.075 |0.0650,0590.054—
28甲型副伤寒沙门氏贫CMCC(B) 500930.0510.0510.054 丨0.0570.0590.067—............................: ?.............................................................................................................................................29乙5?副伤寒汐门 ΛlWCMCC(.B) 500940.0570.0590.067 |0.0570.0590.067—
30伤寒沙-- 氏—:SCMCC(B) 500710.0570.059 0.0670.0590.0510.065—
31:? 保罗沙门氏 liIQCC 105290.0560,0650.0670,0650,0590.065
32海德堡沙门氏菌IQCC 105310,0610.0650.0750,0650.0590.051—
33肯塔基沙门氏菊IQCC 105300.0510.0510.0540,0510.0650.067—
34也洛克利沙门 LtiSIQCC 105320.0570.059 0.0670.0590,0650.067—
35阿伯丁沙ΠΛΜIQCC 105110,0570.059 0.0670.0570.0510.067—
[0071]36乙 4----沙门 Λ?￥:1QVV 105()40.0560.0650.0670.0570.059(1.067—
37丨# 沙门氏 SIQCC 105230.W10.0650.0750.057(?.0670.06?-
38鸭沙门氏保IQfC 105(W0.0510.0510.0540.0570.07S0.06?—
39ttt-?ΦΠΛ.*!IQCr 1()51(10.0570.0590J670.0570.0540.067-
40丨丨"W副伤寒沙门,(1?:1QC(' HiSiX◎.挪了()册？—
41趵沙门氏 1*4IQCC' 105250.0560.0650.06? I0.0750.06?0.054-
42λ?|沙Π1Χ菌IQCC10S260.0610,0650,075 |0,0540,0590,06?-
43内把诏伤寒沙门义度IQCC 10527(11)510.05!D.054 ；0.0H70.0590.067-
44I杨炎沙[QC'C 10528OJ570,0590.1)6? I0,0670.0590.067-
45丨丨"Wtfj伤寒沙门 Λ|?:1QCC 105800.0570.0590.067 j0,059().0590.075-■
461 丨氏|?IQCC3053?0,0560.0650.06? |0.059!).0590.06?-
47丨RWlHV霉沙i ^[(X C 305380.0510.0510.054 I0.0570.0590.067-
48乙哨副伤寒沙门夭丨方CMCC 5()0()40.0?70.059ai>57().()590.067-
49Ιι^β:CMCC 501180.0570.0590.067 I0.0570.0590,067-80福氏,]/.贺ATCC 120220JS60.0650.067 |0.0S?0.0590.067-
51宋内氏志贺ΛΤ(Χ.2593!0.()560.0650.067 I0.0570.0590.067-
52鲍ATCC' ΗΤΟΙ)().()56H.D650,067 j0.0570.()590.06?—
53鲍 LHftKSATCC 92070J620.0580.0590.0570.0590.067-
54鲍氏丄资氏匁CMCC 513460,0570,0590,0670.0570.0590.067—
55:_.1':忑饬氏肩CMCTiB、511050.0560.0650.0670.0570.0590.067-
56_疾上贺氏;為f:"'k讣离抹0.0620,058ll059 |0.1)57().()590.06?-
57福氏忠《 氏,?515720.0570.059?.?67 丨0.()59IUMV7-
58描氏ΛΤ?Χ: 120220.0510.0760.(161丨0.0510.0550.058-
59宋㈧无友贺氏满fMCX'i B) 515920.0510.0760.1)61 丨(Κ?5Ι0.0550JS58-
60宋内氏;i; η 氏 1?ΛΤ(Γ25ι>310.0520,0550.1)60 I0.0520.0550.060~~
61Sj溶血弧俱ATCC 178020.0510.0550.058 I0.0510.0550,058—
62阪崎肠杆菌ATCX' 290040.U510.0500.0580.051().05()0.058—
63R崎腸杆IfATC.X: 295540.0470.0490.0560.0470.0490.056—fi4隱崎腸杼蘭ATCX 12X580.0470.0490.0560,0470.0490,056
[0072]65小腸專尔森氏阐ATCC 237150.0490.0520,049(1.056—
66小腸耶尔*RWCMCC 522()70J470.0490.0560.0470.0490.056-
67小腸 1%;森氏?IMCC(B) 522040.0490.0521)J67|1).()470.0490.056—
68乙懸 If 血性键球菌ΛΤΓΓ2 丨 0590.0540.0570J610,04?0.0490.056-
69乙管?ft血ft链球_ATCt' 21060μ--μ^0.049().()490.056-
70JiMiJtfF鏡ATCt' 丨丨 77H0.077?.?850.066 I0.0470.0490.056-
71Jt祥I1IIff菌CMCC(B) 633010.0470,0490,056 |0,0740,0850.061一
72維样芽?ff菌('M(XXB) 6331130-0770.085D.066 ；0.0570.0H50.064-
73.公坑色葡球 1?ATCC' 653H0.0670.085(!.056 I0.0740.0850.066-
74金贫色―偏?球 WΛΤ?Χ: 259230.0790.085丨(U>470.0490.056-
75金黄?Λβ球菌ΛΤ?Χ 112丨30.0470.0490.0S6 I0.06?0.085().?7?—
76金I!色響藝球 1?ATCC: 276600.0750.0850.066 I0.0720.0850.062- ?.表JfelI萄球菌t+'Mi'C*B) 2?_ 0.0730.085Ι).(!Μ> 丨_710.085().(164—
78空腸灣 _ (II(?(Χ.229370.0590.0560.067 |0.0570,0520.051-
[0073]产生经过上述鉴定的出血性大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体的杂交瘤细胞株GS2-D3于2012年9月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)N0.6610。
[0074]产生经过上述鉴定的出血性出血性大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A8F11B10E7于2013年9月保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)，保藏号为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，中国，北京市)N0.8458。
[0075]二、胶体金试纸条抗体最优组合的确定
[0076]由于不同的抗体组合对胶体金试纸条检测灵敏度及品质优劣影响较大，因此，需对制备胶体金试纸条过程中所用抗体进行配对择优选择。除了前面筛选出来的三株单克隆抗体外，本实用新型还引入了多克隆抗体Pab，图2中a组是单克隆抗体D3的实验结果，b组是单克隆抗体B9的实验结果、c组为单克隆抗体E7的实验结果、d组为本实验中引入的多克隆抗体Pab。多抗Pab利用常规方法制备得到。
[0077]1.各抗体偶联胶体金的最佳pH的确定
[0078]分别取100 μ L胶体金溶液于96孔板8个孔中，并调节pH至5.5,6.0,6.5,7.0、
7.5、8.0、8.5、9.0，每孔加入10 μ L浓度为lmg/mL的单克隆抗体。反应5min，各孔加入10yL10% NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次。
[0079]图2中各组从左到右的孔中pH值依次为5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0。由图2得知，a组当pH为7.5-8.0时，孔中胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即D3单抗偶联胶体金最佳pH范围为7.5-8.0 ；b组当pH为7.5时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无褪色或变色现象，即B9偶联胶体金最佳pH为7.5 ；c组当pH为7.5时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无变色现象，即E7偶联胶体金最佳pH为7.5 ；d组当pH为8.0时，胶体金颜色最红，且无聚沉、无变色现象，即多克隆抗体偶联胶体金最佳pH为8.0。
[0080]2.各抗体偶联胶体金的最佳结合量的确定
[0081]调节胶体金溶液pH至步骤(I)中得到的各抗体偶联的最佳pH值，各取10yL于96孔板中，按表5加入各抗体，反应5min，各孔加入10 μ LlO % NaCl溶液，反应5min，观察溶液颜色变化，重复三次，结果如图3所示。取颜色最红且抗体用量最少的为最小结合量χμ g/mL,为保证胶体金完全与抗体结合,则以x+xX20%为最佳结合量。
[0082]表5抗体与胶体金偶联最佳结合量
[0083]
贏号Il |2 |3 |4 |5 |6 |7
液体金溶液(μ L)Too 50~Too Too 10 10 Too
抗体质量/金溶液体积(μ g/mL) 0~0~~TF~20~25~
To% NaCl (μ L)|?0 |θ |?0 |?0 |?0 |?0 |?0
[0084]由图3得知，抗体质量/金溶液体积为O μ g/mL时，加入10% NaCl后各组孔I中胶体金均出现聚沉，颜色由红色变灰，最后变为无色；各组孔2为50μ L胶体金原液作对照。当抗体质量/金溶液体积由5 μ g/mL增加至25 μ g/mL时，各组孔中胶体金颜色依次变红变深，其中，a组B9抗体添加量> 10 μ g/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3，即B9最小结合量为10 μ g/mL,则其最佳结合量为12 μ g/mL ；b组D3抗体添加量彡20 μ g/mL时，颜色变化较小，且均红于孔3、4、5，即D3最佳结合量为24 μ g/mL ;(^iE7抗体添加量> 15 μ g/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3、4，即E7最佳结合量为18 μ g/mL ；d组多克隆抗体添加量> 15 μ g/mL时，颜色保持红色基本不变，且均红于孔3、4，即多抗最佳结合量为18 μ g/mL。
[0085]3.抗体的纳米金标记
[0086]胶体金pH调节至最佳pH值，按步骤⑵中确定的最佳结合量吸取抗体以40 μ L/min的速度滴加到胶体金溶液中，同时在磁力搅拌器上搅拌，待抗体加完后继续搅拌30min，加入金溶液1/10体积的含10% BSA的PBS溶液，搅拌lh，移入离心管4000rpm离心1min,小心吸取上清至新离心管,将上清13000rpm离心25min,弃上清,沉淀用重悬液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4°c保存备用。以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混合均匀后4°C保存备用，如需保存较长时间，可加入0.3%叠氮化钠。
[0087]4.出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的组装及测定
[0088]图4是本实用新型出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的结构示意图。
[0089]如图4所示，出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条10包括:样品垫14、金标垫13、检测线16，质控线15以及吸水垫11，在吸水垫11与样品垫14的中间采用硝酸纤维素膜12，硝酸纤维素膜也称NC膜。硝酸纤维素膜12上具有质控线15和检测线16，检测线16靠近样品垫一侧。另外出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条10还具有背衬，用于承载上述的样品垫等结构。
[0090]将步骤3中制备好的金标抗体分别喷涂于多个检测试纸条的金标垫上，记为E7-Au_pad、D3-Au_pad、B9-Au_pad、Pab-Au-pad,将各抗体均稀释至 1 mg/mL,分别包被硝酸纤维素膜12上作为Test line，即检测线，也称T线。包被方法采用常规实验方法。以羊抗鼠作为金标单抗试纸条的Control line，即控制线，也称C线。以羊抗兔作为金标多抗试纸条的Control line。按表5中的组合方式对金标垫和检测线喷涂抗体,组装试纸条,将培养好的菌液用生理盐水稀释至108、107、106CFU/mL进行测定，无菌生理盐水作阴性对照，选择最优的抗体组合。表5中金标垫一列中的E7-Au-pad代表将单克隆抗体E7作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上。
[0091]B9-Au-pad代表将单克隆抗体B9作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上。
[0092]D3-Au-pad代表将单克隆抗体D3作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上。
[0093]Pab-Au-pad代表将多克隆抗体Pab作为金标抗体与胶体金结合并喷涂于胶体金试纸条的金标垫上。
[0094]表6中的检测线纵列表示分别使用不同的抗体做检测线。
[0095]表6抗体不同配对组装试纸条
[0096]
E7-Au-pad B9-Au-pad D3-Au-pad Pab-Au-pad
检测线Xn
E7无B9- E7 D3- E7 Pab- E7
D3E7-D3 B9-D3无Pab-EO
B9E7-B9无D3-- B9 Pab- B9
PahF7-PahRQ_ Pah[TU Pah子
IJL.!...1# i JLI H JL1.■,
[0097]图5是本实用新型出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的各抗体组合配对结果。如图5所示，其中，a为E7-B9组合结果；b为E7-D3组合结果；c为B9-E7组合结果；d为B9-D3组合结果；e为D3-B9组合结果；f为D3-E7组合结果；g为B9_Pab组合结果；h为D3-Pab组合结果；i为E7-Pab组合结果；j为Pab_B9组合结果；k为Pab_D3组合结果；1为Pab_E7组合结果。
[0098]图5中各组试纸条中从左至右分别为采用108、I O7、106CFU/mL以及无菌生理盐水进行测试的结果，由图5可知，f组灵敏度可达106CFU/mL，且无假阳性，效果较好；a、b、C、e、l组灵敏度也可达106CFU/mL，且无假阳性，但其T、C线显色均较f组浅；d、g、j、k组T线均无显色，为假阴性；h、i组有假阳性出现，j、k、I组C线包被羊抗兔浓度较低或可能胶体金未能标记上多抗导致C线未显色，综上，选用抗体组合效果较好的f组，即D3偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，E7喷涂于NC膜作T线来制作本实用新型的出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条。
[0099]5.对f组，即以D3偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，E7喷涂于NC膜作T线的组合，进行灵敏度测定实验。
[0100]将培养好的菌液用生理盐水依次稀释至108、107、106、105CFU/mL，不同浓度菌液均以35 μ L分别滴加至使用f组单抗组合制作的试纸条的样品垫上，进行检测，使用无菌生理盐水为阴性对照，并重复三次。
[0101]挑出血性大肠杆菌0157:H7单菌落于培养基中，置于36°C摇床培养12h，平板菌落计数算得纯菌液浓度为2.lX108CFU/mL，由图6可知，滴加浓度为ΙΟ8、107、106CFU/mL菌液后，试纸条T线显色，滴加105CFU/mL菌液T线无显色，说明试纸条检测灵敏度可达106CFU/mL,三次重复结果均为106CFU/mL，灵敏度稳定性较好。
[0102]6.对出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条进行交叉反应实验
[0103]此时出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条以单克隆抗体D3偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，单克隆抗体E7喷涂于NC膜作T线。
[0104]利用以下细菌对制备的试纸条进行交叉反应实验:金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (ATCC29213、ATCC27660)、出血性大肠杆菌 0157:H7Escherichiacoli 0157:H7(ATCC43895、ATCC43889)、单核细胞增生李斯特菌 Listeriamonocytogenes (ATCC43251、ATCC13932、ATCC19112、ATCC19114、ATCC19116、ATCC19117、ATCC19115、)、猪霍乱沙门氏菌 Salmonella choleraesuis (CICC21493)、鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhiumukriunm(CICC22956、ATCC14028)、肠炎沙门氏菌 Salmonellaenteritidis(ATCC13076)、福氏志贺氏菌 Shigella flexneri(ATCC12022)、宋内氏志贺氏菌 Shigella sonnei (ATCC25931)、痢疾志贺氏菌 Shigella dysenteriae (野生分离株)、鲍氏志贺氏菌Shigella boydii (ATCC9207)、小肠结肠炎耶尔森氏菌 Yersinia enterocolitica(ATCC23715、CMCC52207)、副溶血性弧菌(Vibr1parahaemolyticus (ATCC17802) > 坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii (ATCC29004、ATCC29554)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni enteritis) (CICC22937)、乙型溶血性链球菌(Streptococcus Hemolytics β ) (ATCC10373)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylor)(ATCC43504)。
[0105]用制备好的试纸条检测27株培养至108CFU/mL的细菌并观察结果。
[0106]图7是本实用新型实施例中出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条的胶体金试纸条交叉反应结果。
[0107]由图7可知，35yL浓度为108CFU/mL的出血性大肠杆菌0157:H7(ATCC43895、ATCC43889)菌液滴加到样品垫后，T线均显色，其他25株细菌相同浓度相同体积加样后，T线均未显色，结果表明，该试纸条可以专一检测出血性大肠杆菌0157:H7 (ATCC43895、ATCC43889)，特异性较好。
[0108]三、对采用f组单抗制备的出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条进行模拟代菌实验
[0109]此实验即为出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金检测试纸条在检测食品出血性大肠杆菌0157:H7中的应用实验。本实验中的出血性大肠杆菌0157:H7的免疫胶体金快速检测试纸条以单克隆抗体D3偶联胶体金作为金标抗体喷涂于金标垫，单克隆抗体E7喷涂于NC膜作T线。
[0110]培养出血性大肠杆菌0157:H7浓度至108CFU/mL，用生理盐水梯度稀释至103CFU/mL后各取100 μ L分别加入到25g (如果是液体实验对象则取25mL)的市售面包、果冻及牛奶中，按照国标GB/T4789.36-2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌0157:H7/匪检验》分别向各样品中加入225mL的改良EC肉汤，36°C培养22h，期间每隔2h各取1mL样品待检，分别取各样品各时间段培养物40 μ L滴加至样品垫进行检测。实验结果在图8中依次左至右排列。其中，abc各组的最后一个均为使用生理盐水的空白对照。
[0111]由图8可知，a组面包样品增菌2_6h时,试纸条T线无显色，增菌8_22h时,T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU Escherichia coli 0157:H7的面包样品在增菌液中增菌8h可被检出山组牛奶样品增菌2-8h时，T线无显色，增菌10-22h时，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU Escherichia coli 0157:H7的牛奶样品在增菌液中增菌1h可被检出；c组果冻样品增菌2-8h时，T线无显色，增菌10-22h，T线显色，检测结果呈阳性，说明含有约200CFU Escherichia coli 0157:H7的果冻样品在增菌液中增菌1h可被检出。
[0112]【具体实施方式】作用与效果
[0113]实验数据表明，本实用新型的出血性大肠杆菌0157:H7免疫胶体金快速检测试纸条具有无交叉反应和灵敏度高的特点，并且在实际检测食品的应用中也同样具有无交叉反应和灵敏度高的效果。
【权利要求】
1.一种出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金快速检测试纸条，其特征在于，包括:位于底部的衬板，以及在该衬板上依次排列的样品垫、连接在所述样品垫后面并且喷涂有金标抗体的金标垫、与连接在该金标垫后面的NC膜以及与所述NC膜相连接的吸收垫，其中，所述NC膜上具有单克隆抗体3A8F11B10E7喷涂于所述NC膜上所形成的检测线。
2.根据权利要求1所述的出血性大肠杆菌0157:H7的胶体金快速检测试纸条，其特征在于: 其中，所述金标抗体是单克隆抗体GS2-D3与胶体金偶联后形成的。
【文档编号】G01N33/577GK203929783SQ201420126568
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】刘箐, 刘程 申请人:上海理工大学