一种快速定量检测ngal和timp-2的胶体金试纸的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种快速定量检测NGAL和TIMP-2的胶体金试纸，所述胶体金试纸包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件7，上方设有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜1中间部位第一检测线8和第二检测线11分别包被有抗NGAL或抗TIMP-2的单克隆或多克隆抗体，在所述第一检测线和第二检测线的两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的NGAL和TIMP-2抗体以及控制线偶合物。
【专利说明】—种快速定量检测NGAL和TIMP-2的胶体金试纸
【技术领域】
[0001]本实用新型属于临床医学诊断领域，具体涉及一种快速定量检测NGAL和TIMP-2的胶体金试纸。
【背景技术】
[0002]急性肾衰竭(AKI)是一个由多种病因引起的临床综合征，是因肾循环衰竭或肾小管的变化而引起的一种突发性肾功能丧失，因此肾脏无法排除身体的代谢废物。当肾脏无法行使正常功能时，会导致毒素，废物和水分在体内堆积，而引起急性肾衰竭。近年来陆续发现的可能的AKI标志物包括白细胞介素-18 (IL-18)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystatinC)、肾损伤分子-l(KIM-l)、人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和组织金属蛋白酶抑制剂-2 (tissue inhibitor of metalloproteinases-2, TIMP-2 等。
[0003]免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuC14)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0004]鉴于目前尚无快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2方法，本实用新型的目的是提供一种可用于快速定量检测NGAL和TIMP-2的胶体金试纸以及一种可用于快速定量检测NGAL和TIMP-2的胶体金试纸盒，所述胶体金试纸和胶体金试纸盒具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点。
实用新型内容
[0005]本实用新型的一个目的是提供一种快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2的胶体金试纸，本实用新型所述快速定量检测NGAL和TIMP-2的胶体金试纸具有方便快捷、操作简单、结果准确等优点，适于临床快速诊断。
[0006]本实用新型的技术方案是:
[0007]一种快速定量检测NGAL和TIMP-2的胶体金试纸，包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件7，上方设有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纤维素膜I中间部位第一检测线8和第二检测线11分别包被有抗NGAL和抗TIMP-2的单克隆或多克隆抗体，在所述第一检测线和第二检测线的两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的NGAL和--ΜΡ-2抗体以及控制线偶合物。
[0008]优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
[0009]其中所述BSA是指牛血清白蛋白。
[0010]优选地，所述第一固定部件7为双面胶，第二固定部件6为单面胶。
[0011]优选地，所述两条控制线9与第一检测线8和第二检测线11为平行设置。
[0012]本实用新型的另一个目的是提供了一种快速定量检测NGAL和TIMP-2抗体的胶体金试纸盒，在本实用新型所述的定量检测NGAL和--ΜΡ-2抗体的胶体金试纸的基础上还包括一外壳10。
[0013]所述外壳优选塑料外壳。
[0014]所述外壳包裹所述试纸，露出样本垫片3、硝酸纤维素膜I上的第一检测线8和第二检测线11和两条控制线9、以及吸水垫4。
[0015]本实用新型所述的试纸盒具有方便携带和贮存的优点。
[0016]本实用新型所述的快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2抗体的胶体金试纸或试纸盒的工作原理是:采用双向侧流免疫反应原理,通过双抗体夹心法制备而成。检验时样本中的NGAL和--ΜΡ-2抗原首先分别与偶合垫上的NGAL和--ΜΡ-2抗体偶合物发生免疫反应，形成免疫复合物。其后免疫复合物随着样本在硝基纤维素膜上层析流动，当免疫复合物层析至硝基纤维素膜上的检测区(NGAL和--ΜΡ-2检测线)时，分别与预先包被在硝基纤维素膜上的抗NGAL和--ΜΡ-2抗体发生反应从而被固定在硝基纤维素膜的检测线上。样本中的NGAL和--ΜΡ-2越多，检测线上的复合物越多，条带上的光密度值就越高。同时，在检测过程中，控制线偶合物(即DNP-BSA标记的胶体金)，也会随样本在硝基纤维素膜上层析，当层析至硝基纤维素膜的控制线时，DNP-BSA胶体金会与预先包被在硝基纤维素膜上的抗DNP抗体发生反应从而被固定在对照区(控制线)上。由于胶体金为红色，因而固定在硝基纤维素膜控制线上的抗DNP中的DNP-BSA胶体金免疫复合物将显示红色。当样本中不含NGAL和TIMP-2时，则只显示两条控制线。当样本含NGAL和--ΜΡ-2时，检测线就会分别清晰的显示出来。
[0017]当反应结束后，利用多功能免疫检测仪(瑞莱生物工程(深圳)有限公司)将控制线和检测线的光密度进行分析，并将所分析得到的结果进行运算，从而得到相对光密度值(RI)。然后检测仪根据已预先设置在检测仪内的标准曲线对NGAL和--ΜΡ-2的浓度进行计算并显示结果，以ng/mL为单位表示。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本实用新型所述快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2的胶体金试纸的一种优选实施方式的结构示意图。
[0019]其中，1:硝酸纤维素膜，2:偶合物垫片，3:样本垫片，4:吸水垫，5:支撑垫片，6:第二固定部件，7:第一固定部件，8:第一检测线，9:控制线，11:是第二检测线。
[0020]图2是本实用新型所述快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2的胶体金试纸盒的一种优选实施方式的示图。
[0021]其中，3:样本垫片，8:检测线，9:控制线，4:吸水垫，10:外壳。
【具体实施方式】
[0022]以下结合附图对本实用新型所述快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2的胶体金试纸或试纸盒进行详细说明，不能理解为是对本实用新型的限制。以下实施例中所使用的材料和试剂除特别说明外，均为普通市售。
[0023]【实施例1】制备快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2的胶体金试纸
[0024]如图1所示的胶体金试纸结构，包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端上方层叠连接吸水垫4，另一端上方层叠连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片远离硝酸纤维素膜I的一端上方层叠连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方粘接第一固定部件7，优选为双面胶，上方粘接第一固定部件6，优选为单面胶，其特征在于，所述硝酸纤维素膜I中间部位第一检测线8和第二检测线11分别包被有NGAL或抗TIMP-2的单克隆或多克隆抗体，在所述第一检测线和第二检测线的两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的NGAL和--ΜΡ-2抗体以及控制线偶合物。
[0025]所述控制线9包被有抗DNP抗体,所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
[0026]其中，硝酸纤维素膜I在胶体金试纸中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生处；第一检测线8和第二检测线11是分别将NGAL和--ΜΡ-2抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释到0.5mg/ml的浓度，取lul/cm划线于所述硝酸纤维素膜I上，干燥，即得；控制线9是将抗DNP抗体使用1*PBS、甲醇等缓冲液稀释到0.5mg/ml的浓度,取lul/cm划线于所述硝酸纤维素膜I上，干燥，即得。
[0027]其中，所述偶合物垫片2的原材料为玻璃纤维滤膜，将用于制备偶合物垫片的玻璃纤维滤膜放入预封闭缓冲液(包含0.1-1%的酪蛋白，0.5-5%的牛血清白蛋白、
0.005-0.5%的硼酸、0.01-0.2%的PEG)中浸泡5分钟后取出，干燥，用B1dot包膜仪器将金标记的NGAL和TIMP-2单克隆抗体或多克隆抗体以及控制线偶合物涂布在偶合物垫片2上，干燥，即得。优选地，所述偶合物垫片2的预封闭缓冲液包含0.8%的酪蛋白，4%的牛血清白蛋白，0.007%的硼酸，0.1%的PEG。
[0028]其中，所述样本垫片3可对液态样品起到初步过滤作用。将样本垫片用141封闭液(包含:0.1-1%的Tris，0.1-1%的酪蛋白)浸泡5分钟后，干燥，即得。优选地，所述141封闭液包含:0.3%的Tris，0.8%的酪蛋白。
[0029]将上述各组成部件按图1所示结构粘贴在支撑垫片5上，获得快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2的胶体金试纸。
[0030]【实施例2】用本实用新型所述胶体金试纸快速定量检测NGAL和TIMP-2
[0031]取本实用新型优选的一种快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2的胶体金试纸，如图1所示，所述胶体金试纸包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端上方层叠连接吸水垫4，另一端上方层叠连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片远离硝酸纤维素膜I的一端上方层叠连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方粘接第一固定部件7，优选为双面胶，上方粘接第二固定部件6，优选为单面胶，其特征在于，所述硝酸纤维素膜I中间部位第一检测线8和第二检测线11分别包被有抗NGAL或抗TIMP-2的单克隆或多克隆抗体，在所述第一检测线和第二检测线的两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的NGAL和--ΜΡ-2抗体以及控制线偶合物。优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。按以下步骤进行检测:1)采集的病人尿液样本，如低温保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片3上，反应。3)判读，将所述胶体金试纸置于多功能免疫检测仪，SSJ-2或MINI (瑞莱生物工程(深圳)有限公司)中判定结果。
[0032]【实施例3】用本实用新型所述胶体金试纸盒快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2
[0033]取本实用新型优选的一种快速定量检测NGAL和--ΜΡ-2的胶体金试纸盒，如图1和图2所示，所述胶体金试纸包括支撑垫片5，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜1，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫4，另一端连接偶合物垫片2，所述偶合物垫片连接样本垫片3，所述样本垫片另一端部的下方粘接第一固定部件7，优选为双面胶，上方粘接第二固定部件6，优选为单面胶，其特征在于，所述硝酸纤维素膜I中间部位第一检测线8和第二检测线11分别包被有抗NGAL或TIMP-2的单克隆或多克隆抗体，在所述第一检测线和第二检测线的两边分别设有控制线9，所述偶合物垫片2上涂布有金标记的NGAL和--ΜΡ-2抗体以及控制线偶合物。。优选地，所述控制线9包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。所述胶体金试纸还包括一外壳10，所述外壳包裹所述试纸，露出样本垫片
3、硝酸纤维素膜I上的检测线8和两条控制线9、以及吸水垫4。按以下步骤进行检测:1)采集的病人尿液样本，如低温保存样本需恢复至室温。2)将待测样品加入样本垫片3上，反应。3)判读，将所述胶体金试纸置于多功能免疫检测仪，SSJ-2或MINI (瑞莱生物工程(深圳)有限公司)中判定结果。
【权利要求】
1.一种快速定量检测NGAL和TIMP-2的胶体金试纸，包括支撑垫片(5)，位于所述支撑垫片上的硝酸纤维素膜(I)，所述硝酸纤维素膜的一端连接吸水垫(4)，另一端连接偶合物垫片(2)，所述偶合物垫片连接样本垫片(3)，所述样本垫片另一端部的下方设有第一固定部件(7)，上方设有第二固定部件￠)，其特征在于，所述硝酸纤维素膜(I)中间部位第一检测线(8)和第二检测线(11)分别包被有抗NGAL或抗TIMP-2的单克隆或多克隆抗体，在所述第一检测线和第二检测线的两边分别设有控制线(9)，所述偶合物垫片(2)上涂布有金标记的NGAL和TIMP-2抗体以及控制线偶合物。
2.如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于，所述控制线(9)包被有抗DNP抗体，所述控制线偶合物为DNP-BSA标记的胶体金。
3.如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于，所述第一固定部件(7)为双面胶，第二固定部件出)为单面胶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的胶体金试纸，其特征在于，所述胶体金试纸外还包括一外壳(10),所述外壳包裹所述胶体金试纸外,露出样本垫片(3)、硝酸纤维素膜(I)上的第一检测线(8)、第二检测线(11)、两条控制线(9)、以及吸水垫(4)。
5.如权利要求4所述的胶体金试纸，其特征在于，所述两条控制线(9)与第一检测线(8)和第二检测线(11)为平行设置。
【文档编号】G01N33/558GK204028082SQ201420423962
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】刘红剑, 赵俊平, 何晓红, 刘春莉 申请人:瑞莱生物工程（深圳）有限公司