一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置制造方法
【专利摘要】本发明属于酶活性测定领域，公开一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置。先向反应体系内连续通气至少2min，测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为氢气和一氧化碳，然后将0.5mL待测厌氧微生物的菌液注射入反应体系内，再连续通气至少2min，接着于37℃条件下保持6min，反应过程结束时冰浴终止反应，取0.2mL反应液测定吸光度值，经换算即得酶活。装置包括气体供给装置、酶活反应装置和酶标仪。本发明步骤简单，操作简便，无需对样品进行处理，检测时间短，取样量小，酶活稳定有效，设备要求较低，避免酶活必须在厌氧操作箱内操作，减少氮气耗用量，灵活性好，适用于对厌氧微生物样品中的氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性测定。
【专利说明】一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性 的方法与装置
【技术领域】
[0001] 本发明属于氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性测定【技术领域】，具体涉及一种直接测定 厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法与装置。
【背景技术】
[0002] 厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的微生物，且不能直接暴露在 含氧量大于或等于18%的空气里，对氧气敏感，一般可分为绝对厌氧菌和兼性厌氧菌两类。 厌氧菌属于较为古老的原核菌进化而来，目前不断发现较多的厌氧菌特别是绝对厌氧菌具 有很大的发酵应用和工业生产价值，如ClostridiumcarboxidivoransP7、Clostridium strainPll、Clostridiumljungdahlii和ClostridiumautoethanogenumDSM10061 等。 此类厌氧菌能够利用乙酰CoA/Wood-Ljungdahl代谢途径行使生命活动进行生长繁殖，另 外研究证明该类菌的代谢物还可作为人类所需要的生物燃料或原料，如乙醇、丁醇和脂类 等。
[0003] 氢化酶（hydrogenase，简称H2ase)是一类存在于微生物尤其是厌氧菌体内的重要 生物酶，是一种催化伴有氢分子释放或分子氢转化质子的氧化还原反应酶，它通过控制微 生物体内氢的代谢来调节细菌的其他生理活动。
【权利要求】
1. 一种直接测定厌氧微生物内氢化酶或一氧化碳脱氢酶活性的方法，其特征在于：先 向反应体系内连续通气至少2min，测定氢化酶和一氧化碳脱氢酶活性时对应的气体分别为 氢气和一氧化碳，然后将〇. 5mL待测厌氧微生物的菌液注射入反应体系内，再连续通气至 少2min，接着于37°C条件下保持6min，反应过程结束时冰浴终止反应，取0. 2mL反应液测定 吸光度值，经换算即得酶活。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：测定氢化酶活性时，对应的反应体系组成 为：0? 4mL1M、pH=7. 5 的Tris-HCl缓冲液，0? 2mL0? 04M的甲基紫精溶液，0? 2mL0? 04M 的二硫苏糖醇溶液，〇.lmL5v%的Trit〇n-X100溶液，2mL脱气去离子水；测定一氧化碳 脱氢酶活性时，对应的反应体系组成为：〇. 8mL0. 5M、pH=6. 8的Tris-HCl缓冲液，0. 2mL 0. 04M的甲基紫精溶液，0. 2mL0. 04M的二硫苏糖醇溶液，0.lmL5v%的Triton-X100溶液， 1. 2mL脱气去离子水；以上反应体系中，Tris-HCl缓冲液、甲基紫精溶液、二硫苏糖醇溶液、 Trit〇n-X100溶液配制时采用的水均为脱气去离子水。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：涉及的两处通气，其流速范围均控制在 1 ~10mT,/min〇
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：采用酶标仪测定反应液的吸光度值，测定波 长为578nm，同时以未加待测厌氧微生物的菌液的反应体系作为对照液。
5. 如权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述待测厌氧微生物的菌液为待测厌 氧微生物的种子液或发酵液。
6. -种实现如权利要求1-3任一所述方法的装置，其特征在于：该装置包括气体供给 装置、酶活反应装置和酶标仪；所述气体供给装置的结构构造为：包括气体储罐、带铁夹的 铁架台、多通管，多通管固定在铁夹上，气体储罐的罐顶设有气罐阀，气体储罐的气体出管 上依次设有安全阀和流量调节阀，安全阀上连接有低压表和高压表，流量调节阀上连接有 气体流量计，气体出管的末端通过第一输气管路连接至多通管其中的一个管口，多通管的 剩余管口则分别各连接一个第二输气管路，第二输气管路又与连接导管连接；所述酶活反 应装置的结构构造为：包括固定座板，固定座板上设有至少一个反应管，反应管顶部设有密 封垫，密封垫上针头朝下插入有进气针头和出气针头，并且进气针头插入密封垫直至反应 管底部，出气针头插入密封垫直至漏出部分的长度为〇. 5-2cm;气体供给装置和酶活反应 装置之间通过连接导管连接至进气针头的尾部实现连接，酶标仪则相对气体供给装置和酶 活反应装置独立设置。
7. 如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述酶标仪型号为MultisuanGo1510,酶 标仪采用96孔板，每孔上样量均为0. 2mL，扫描震动10s。
8. 如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述反应管为5mLEP管；所述密封垫为一 次性医用10mL注射器橡胶活塞且凸面朝下放置；所述进气针头和出气针头的规格型号分 别为麻醉用 〇? 5X100SB与 0? 45X16RWLB。
9. 如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述多通管为四通管，所述反应管的数量为 三个。
10. 如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述第一输气管路和第二输气管路均为橡 胶管；所述连接导管由lmL无菌医用注射器切除尾部制成。
【文档编号】G01N33/573GK104515851SQ201510008457
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2015年1月8日 优先权日:2015年1月8日
【发明者】宋安东, 张炎达, 彭华, 王风芹, 谢慧, 杨森, 任天宝 申请人:河南农业大学, 河南省环境监测中心