一种利用斑马鱼胚胎快速评价中成药潜在致畸性的方法与流程

本发明属于毒性评价领域，特别是涉及一种利用斑马鱼胚胎评价中成药潜在致畸性的方法。

背景技术：

中成药根据传统中药的药方利用现代技术进行生产，在生产过程中可能会产生与传统炮制方法不同的药物相互作用，可能产生新的毒性。传统评价致畸性的方法是利用哺乳类模式生物大鼠和小鼠的胚胎进行评价，但由于哺乳类动物胚胎的发育周期长且不易观察，难以进行快速且大规模评价。通常中药中能吸收进入体内的主要是水溶性成分，在水溶液中发育斑马鱼胚胎是适用与中药的毒性评价新模型。过去利用斑马鱼评价中药发育毒性方法中，也未确立潜在致畸性的判断标准，特别未有对中成药评价的方法，实用性低。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种操作简单，适用于快速且大规模评价中成药潜在致畸性的方法技术。本发明的目的通过中成药水溶性物质提取、中成药对斑马鱼胚胎培养和致畸性评价三步实现，具体方案如下：

(1)中成药的处理方法：将中成药的包衣/胶囊去除，研成细粉。中成药粉末精密称量，在超声清洗仪中用dmso萃取30分钟，在室温放置24小时。提取物加入e3培养液稀释到所需浓度(胚胎死亡率为100％的浓度)，离心后取上清液，用e3培养液稀释至多个浓度，用于培养斑马鱼胚胎。

(2)斑马鱼胚胎的培养：取受精后3小时的斑马鱼胚胎，按照每孔一枚地分装于孔板中，孔中加入中成药的溶液，每个浓度的溶液培养若干胚胎。将孔板置于28.5摄氏度、光照/黑暗循环12/12(小时)的培养箱中培养，每24小时更换一次溶液，培养至受精后72小时。

(3)致畸性评价：在显微镜下观察胚胎的发育情况，记录每个浓度下死亡胚胎和畸形胚胎的个数，根据probit模型对半数致死浓度(lc50)和半数致畸浓度(ec50)进行求解，通过计算lc50和ec50的比值得到致畸指数，根据指数的大小判断药物是否具有潜在致畸性。

附图说明

图1是毒性评价技术的流程图。

图中：1、中成药，2、中成药粉末，3、中成药溶液，4、斑马鱼胚胎，5、96孔板，6、培养，7、显微观察，8、显微下斑马鱼发育状态、9、统计与分析

具体实施方式

为了详细说明本发明的特点，现举以下实例说明：

实施例1：

1、取妇乐颗粒研磨成细粉，精密称定250毫克，加入250微升dmso，在超声清洗仪中提取30分钟后，在室温下静置24小时，用e3培养稀释至50毫升，在4000rpm下离心，取上清，上清液浓度为5毫克/毫升。用e3培养液稀释，得到一系列浓度为0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.5和5毫克/毫升的药物溶液。

2、将受精后3小时的斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔放置1枚胚胎，每个孔加入200微升的药液，每个浓度药液培养30枚胚胎。孔板置于28.5摄氏度和光照/黑暗循环12/12(小时)的环境下培养，每24小时更新一次药液，培养至受精后72小时。

3、在显微镜下观察每个浓度的斑马鱼胚胎的形态并记录死亡胚胎和畸形胚胎畸形的数目，计算死亡率和畸形率，并用软件计算得到半数致死浓度和半数致畸浓度分别为0.74和0.484毫克/毫升，致畸指数为1.54，呈现出弱潜在致畸性。

实施例2：

1、取妇炎净胶囊若干，去除胶囊取药芯粉末，精密称定400毫克，加入250微升dmso，在超声清洗仪中提取30分钟后，在室温下静置24小时，用e3培养稀释至50毫升，在每分钟4000转下离心20分钟，取上清，上清液浓度为8毫克/毫升。溶液用e3培养液稀释，得到浓度为0.5、1、2、4、6和8毫克/毫升的药物溶液。

2、将受精后3小时的斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔放置1枚胚胎，每个孔加入200微升的药液，每个浓度药液培养30枚胚胎。孔板置于28.5摄氏度和光照/黑暗循环12/12(小时)的环境下培养，每24小时更新一次药液，培养至受精后72小时。

3、在显微镜下观察每个浓度的斑马鱼胚胎的形态并记录死亡胚胎和畸形胚胎畸形的数目，计算死亡率和畸形率，并用软件计算得到半数致死浓度和半数致畸浓度分别为5.23和3.51毫克/毫升，致畸指数为1.49，呈现出弱潜在致畸性。

实施例3：

1、将安宫牛黄丸剪成颗粒状，精密称定250毫克，加入250微升dmso，在超声清洗仪中提取30分钟后，在室温下静置24小时，用e3培养稀释至50毫升，在4000rpm下离心，取上清，上清液浓度为5毫克/毫升。用e3培养液稀释，得到浓度为0.25、0.38、0.5、0.75、1、1.5和2毫克/毫升。

2、将受精后3小时的斑马鱼胚胎置于96孔板中，每孔放置1枚胚胎，每个孔加入200微升的药液，每个浓度药液培养30枚胚胎。孔板置于28.5摄氏度和光照/黑暗循环12/12(小时)的环境下培养，每24小时更新一次药液，培养至受精后72小时。

3、在显微镜下观察每个浓度的斑马鱼胚胎的形态并记录死亡胚胎和畸形胚胎畸形的数目，计算死亡率和畸形率，并用软件计算得到半数致死浓度和半数致畸浓度分别为0.633和0.743毫克/毫升，致畸指数为0.85，无致畸性。

技术特征：

技术总结
本发明涉及一种快速中成药潜在致畸性的评价测试方法，其特征是：采用斑马鱼胚胎为毒性模型，将胚胎暴露于中成药的水溶液中，观察斑马鱼胚胎的发育在中成药的刺激下是否产生发育毒性，并根据中成药对斑马鱼胚胎的毒性指标判断是否具有潜在致畸性。该方法成功地对多种妇科常用中成药进行了毒性评价，有效地测试出中成药的潜在致畸性，从而为中成药临床安全使用提供了有意义的指导。

技术研发人员：姚美村;陈洁烽;陈缵光;廖敏;刘彤;刘梦萍;黄丹萍
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2017.05.21
技术公布日：2017.10.03