蔗糖密度梯度离心分离铁蛋白纳米颗粒的方法与流程

本发明涉及一种分离铁蛋白颗粒的方法，特别是一种蔗糖密度梯度离心分离内部装载四氧化三铁颗粒的铁蛋白的方法。

背景技术：

随着科学研究技术手段的不断提高，铁蛋白纳米壳在体外的研究利用和开发取得了飞速的发展。在生物磁学、生物医学和纳米材料学的研究和应用中，铁蛋白作为一种特殊的纳米材料，具有十分重要的地位。

铁蛋白结构呈球形，由铁核和蛋白壳两部分组成，前者以氢氧化铁和磷酸盐的形式存在于蛋白壳，后者是由24个亚基单体组成的八面体高度对称性结构。铁蛋白内部的水合氧化铁内核粒径均匀，有研究显示，在无氧条件下，氧化还原反应后的铁蛋白铁核可以被去除，得到空壳铁蛋白；利用铁蛋白结构的自组装性能，将金属颗粒或金属氧化物颗粒装进铁蛋白内，形成具有特殊理化性能的颗粒。其中，在铁蛋白内部合成金属氧化物颗粒如四氧化三铁时，由于铁蛋白内腔直径仅为8nm，此时的纳米颗粒具有超顺磁性，且铁蛋白自身具有肿瘤靶向性，因此常用于磁共振成像(mri)研究。

在研究合成含铁氧化物的纳米颗粒的方面，铁蛋白是首选。通过反应3fe²⁺+h2o2+h2o→fe3o4+6h⁺，在铁蛋白内部合成四氧化三铁颗粒。由于必定会有一些铁蛋白空腔内不含四氧化三铁颗粒，因此为了更好的应用于后续研究，获得粒径均一且成分单一的四氧化三铁铁蛋白颗粒很有必要。目前用于分离除去未合成四氧化三铁蛋白颗粒的方法主要借助于其磁性性质，但此种磁性分离方法不适用于其他金属或氧化物的铁蛋白颗粒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用蔗糖密度梯度离心分离内部含有四氧化三铁颗粒铁蛋白的方法。其特征在于该方法的具体步骤为：

(1)将装载四氧化三铁后的铁蛋白样品进行浓缩；

(2)将蔗糖分别按照质量百分比20％，35％，50％，65％，配制不同浓度的蔗糖溶液，依次取等体积不同浓度的蔗糖溶液配置成蔗糖梯度溶液；

(3)将步骤(1)处理后的铁蛋白样品缓慢加入步骤(2)处理后的蔗糖梯度溶液中；

(4)4℃，50,000rpm，5h的条件下，进行水平离心；

(5)将混合液缓慢等分吸出；最终得到内部含有四氧化三铁的铁蛋白。

本发明的有益效果是：本发明所用的离心方法用于纯化铁蛋白内部含四氧化三铁颗粒的方法操作简单、简便易行；(2)本发明分离方法不限于铁蛋白的四氧化三铁颗粒，对分离提纯其他在铁蛋白内部合成金属或金属氧化物的颗粒同样适用，适用范围广。因此本发明在分析化学、纳米材料领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是蔗糖密度梯度离心后的前后对比图；

图2是紫外分光光度计的分析结果图；

图3是蔗糖密度梯度离心前样品的tem结果图(标尺为50nm)；

图4是蔗糖密度梯度离心后样品的tem结果图(标尺为50nm)。

具体实施方式

本发明将结合具体实施案例进行描述：

实施例一：

(1)首先，将反应后的样品利用超滤管进行浓缩，并10,000g，离心10min，去除溶液中的不溶物质；

(2)制作密度梯度：用电子天平准确称取蔗糖，分别配制成质量百分比为20％，35％，50％，65％的蔗糖溶液；从20％开始依次取600μl的蔗糖溶液缓慢加入到离心管中，配置成梯度溶液；

(3)将浓缩液缓慢沿离心管壁加入到梯度溶液上；

(4)在4℃，50,000rpm，5h的条件下，进行水平离心；

(5)将混合液缓慢等分吸出，每等分为200μl，用移液器从顶部缓慢吸将混合液缓慢等分吸出，每等分为200μl，用移液器从顶部缓慢吸出，最终分析得到内部含四氧化三铁颗粒的铁蛋白。

技术特征：

1.一种蔗糖密度梯度离心分离内部含金属或其氧化物的铁蛋白纳米颗粒的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：

(1)将装载四氧化三铁后的铁蛋白样品进行浓缩；

(2)将蔗糖分别按照质量百分比20％，35％，50％，65％，配制不同浓度的蔗糖溶液，依次取等体积不同浓度的蔗糖溶液配置成蔗糖梯度溶液；

(3)将步骤(1)处理后的铁蛋白样品缓慢加入步骤(2)处理后的蔗糖梯度溶液中；

(4)4℃，50,000rpm，5h的条件下，进行水平离心；

(5)将混合液缓慢等分吸出；最终得到内部装载铁氧化物的铁蛋白。

2.根据权利要求1所述的蔗糖密度梯度离心分离铁蛋白纳米颗粒的方法，其特征在于，所述的铁蛋白颗粒包含四氧化三铁的铁蛋白颗粒。

技术总结
本发明涉及一种蔗糖密度梯度离心分离铁蛋白纳米颗粒的方法。该方法的具体步骤为：首先将蔗糖溶于缓冲液中，配制质量百分比浓度分别为20％，35％，50％，65％的蔗糖溶液，采用层铺法，依次缓慢滴加一定量的蔗糖溶液；然后将装载四氧化三铁后的铁蛋白样品缓慢加到蔗糖梯度溶液中；在4℃，50,000rpm，5h的条件下，进行水平离心；最后将混合液缓慢等分吸出，利用紫外分光光度计分别在280nm和410nm波长下分别测定所在蔗糖溶液层的蛋白质含量和铁含量。最终分离得到在铁蛋白空腔内装载了四氧化三铁的铁蛋白，实现了铁蛋白空腔内是否装载四氧化三铁的分离，为分离铁蛋白提供除磁场分离以外的另一种简便可行的方法。

技术研发人员：张瑜;周金花;胡迎澳;董亦馨;王飞;李迅
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：2019.05.17
技术公布日：2020.11.17