血清S100A8/A9复合体水平在CABG术预后判断中的应用的制作方法

本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种血清s100a8/a9复合体水平在cabg术预后判断中的应用。

背景技术：

缺血性心脏病(ischemicheartdisease,ihd)是全球范围内导致死亡的最常见原因之一，且死亡率逐年上升。2013年起，缺血性心脏病已取代卒中，位居我国死亡原因之首。目前，心脏冠脉旁路移植术(coronaryarterybypassgrafting,cabg)是对冠心病(coronaryheartdisease，chd)患者进行心脏血运重建最常用的手术方式之一，尤其是多支血管狭窄的复杂病变患者的首选治疗方式。然而，由于人口老龄化与合并症的增加，越来越多的高风险患者接受cabg术，以及术中冷损伤和心脏停搏液不均匀等因素，可造成心肌发生急性缺血损伤，心泵功能衰竭，从而导致术后低心输出量综合征(lowcardiacoutputsyndrome，lcos)等恶性心血管事件的发生。因此，我们亟需早期识别cabg术后发生此类急性心肌损伤的高危患者及时干预降低院内不良事件发生率。

近年来，国际上已出现一些预测评估cabg术后不良心血管事件发生风险的生物标志物。其中最常见的包括：肌钙蛋白、nt-probnp等。2006年，circulation一项研究共纳入254例首次行急诊cabg术患者，发现术前ctni与院内死亡率和mace(低心排出量综合征、心肺复苏和新发室颤)均显著相关(p均<0.001)，但该研究纳入人群局限于急诊cabg；2019年,europeanheartjournal一项研究共纳入6597例三支病变行cabg术患者，发现术前nt-probnp与院内死亡率具有相关性，然而终点事件单一，未对低心输出量综合征等其他不良事件进行评估；并且既往生物标志物研究缺乏对冠心病患者cabg术后低心输出量综合征发生的准确风险分层，临床应用受限。

s100a8蛋白(calgranulina蛋白、mrp8蛋白)与s100a9蛋白(calgranulinb蛋白、mrp14蛋白)均属于钙结合蛋白s100蛋白家族成员，两者常以钙离子依赖性方式形成异源二聚体s100a8/a9蛋白复合物。在循环中性粒细胞、单核巨噬细胞中表达，而在正常巨噬细胞和淋巴细胞中无表达，在慢性炎症环境下，两蛋白也表达于上皮细胞中，可参与炎症反应，调节细胞生长分化，增长抑制，诱导细胞凋亡等。根据以往文献报道和前期基础实验，发现s100a8/a9是一种关键的炎症预警分子，在心肌缺血损伤、缺血再灌注损伤和心肌功能障碍等方面发挥了重要作用。本团队在之前的工作中，已经阐述了s100a8/a9和多种心脏事件的相关(cn108982844a等)，在此基础上，继续研究s100a8/a9和cabg术后事件的关系，有可能为cabg的预后带来临床帮助。

技术实现要素：

本发明从临床有效快速识别高危患者的角度出发，通过对冠心病患者cabg术后早期检测s100a8/a9的表达水平，说明s100a8/a9作为反映心肌损伤的指标可能对cabg术后院内低心输出量综合征的发生具有预测价值。

本发明首先涉及血清中的s100a8/a9复合体的如下应用，

作为血清学诊断标志物预测心脏冠脉旁路移植术(coronaryarterybypassgrafting,cabg)患者的术后预后情况。

所述的s100a8/a9复合体是由s100a8蛋白(calgranulina蛋白、mrp8蛋白)与s100a9蛋白(calgranulinb蛋白、mrp14蛋白)以钙离子依赖性方式形成的异源二聚体复合物。

所述的cabg患者的术后预后情况指患者术后发生如下院内事件：死亡、低心输出量综合征。

低心输出量综合征是由血运重建或心肌保护不完全导致的一种急性循环障碍综合征，在cabg术后发生率约为3-14％。低心输出量综合征的发生会进一步加剧心肌损伤，引发多器官并发症，死亡率高达17-24％。s100a8/a9是一种关键的炎症预警分子，在缺血损伤部位早期释放，并发挥了重要作用，因此能够反映急性心肌缺血损伤程度，早期预测不良预后。

本发明还涉及所述的s100a8/a9复合体在制备预测心脏冠脉旁路移植术(coronaryarterybypassgrafting,cabg)患者的术后预后情况的检测试剂盒中的应用。

所述的预测cabg患者的术后预后情况指，预测患者术后的不良事件(mace)发生概率，不良事件指患者术后发生如下院内事件：死亡、低心输出量综合征。

所述的s100a8/a9复合体是由s100a8蛋白(calgranulina蛋白、mrp8蛋白)与s100a9蛋白(calgranulinb蛋白、mrp14蛋白)以钙离子依赖性方式形成的异源二聚体复合物。

本发明还s100a8/a9复合体在预测cabg患者的术后预后情况的应用，所述的预测cabg患者的术后预后情况是指，区分患者为术后高不良事件风险组和术后低不良事件风险组，所述的不良事件包括但不限于：死亡、低心输出量综合征。

所述的高风险组为：cabg术后不良事件发生率超过30％；

所述的低风险组为：cabg术后不良事件发生率低于6％；

所述的不良事件高风险组的判断标准为：患者cabg术后24小时的血清s100a8/a9复合体表达量差值大于或等于7860ng/ml；

所述的不良事件低风险组的判断标准为：患者cabg术后24小时的血清s100a8/a9复合体表达量差值小于7860ng/ml。

所述的s100a8/a9复合体是由s100a8蛋白(calgranulina蛋白、mrp8蛋白)与s100a9蛋白(calgranulinb蛋白、mrp14蛋白)以钙离子依赖性方式形成的异源二聚体复合物。

本发明还涉及s100a8/a9复合体在制备预测cabg患者的术后预后情况的检测试剂盒中的应用，所述的预测cabg患者的术后预后情况是指，区分患者为术后高不良事件风险组和术后低不良事件风险组，所述的不良事件包括但不限于：死亡、低心输出量综合征。

所述的高风险组为：cabg术后不良事件发生率超过30％；

所述的低风险组为：cabg术后不良事件发生率低于6％；

所述的不良事件高风险组的判断标准为：患者cabg术后24小时的血清s100a8/a9复合体表达量差值大于或等于7860ng/ml；

所述的不良事件低风险组的判断标准为：患者cabg术后24小时的血清s100a8/a9复合体表达量差值小于7860ng/ml。

所述的s100a8/a9复合体是由s100a8蛋白(calgranulina蛋白、mrp8蛋白)与s100a9蛋白(calgranulinb蛋白、mrp14蛋白)以钙离子依赖性方式形成的异源二聚体复合物。

所述的检测试剂盒中还包含，检测s100a8/a9复合体血清表达量的检测试剂，所述的检测试剂包括但不限于：

(1)特异性结合s100a8/a9复合体的抗体，所述的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、功能性抗体片段、抗体fab区，纳米抗体、嵌合抗体、多特异性抗体等；

(2)特异性结合s100a8/a9复合体的配体蛋白或多肽；

(3)特异性识别s100a8/a9复合体的非蛋白类化合物。

所述的检测试剂盒是，

(1)酶联免疫法检测试剂盒；

(2)胶体金试纸检测试剂盒；

(3)化学发光检测试剂盒；

(4)流式细胞仪检测试剂盒。

附图说明

图1、mace组和non-mace组患者在cabg术后1天的血清s100a8/a9蛋白复合体的含量。

图2、冠心病患者cabg术后1天的血清s100a8/a9蛋白复合体表达量水平预测cabg术后mace事件发生率的roc曲线图。

图3、以冠心病患者cabg术后的s100a8/a9蛋白复合体表达量水平7860ng/ml为区分值，划分出的冠心病患者群的cabg术mace事件生存曲线图。

具体实施方式

实施例1：688名冠心病患者在院期间cabg术后1天，s100a8/a9的表达情况

688名冠心病患者cabg术后1天血清样本，通过elisa实验检测s100a8/a9的表达水平。根据院内发生mace事件(死亡、低心输出量综合征)情况，将688名行cabg术患者分为mace组(65人)和non-mace组(623人)。

一、实验步骤：

试剂盒：r&dsystems,inc，humans100a8/s100a9，heterodimerimmunoassay

(一)试剂准备：

1、使用前将所有试剂平衡至室温。

2、洗液(washbuffer)：如果浓缩液中已经形成结晶，平衡至室温，并轻轻地摇晃直到结晶完全溶解，加入离子水或蒸馏水稀释20ml洗涤液至500ml。

3、底物溶液(substratesolution)：显色试剂a和b应该在使用前15min以等体积混合，避光保存，每孔需要200ul显色试剂a和b的等体积混合物。

4、s100a8/a9标准品(s100a8/9standard)：使用标准稀释液rd5-10(calibratordiluentrd5-10)重新配置s100a8/a9标准品。重新配置的产品为40ng/ml贮存液。稀释前将标准品至少轻轻搅拌15min。

5、吸取适当的标准品稀释液rd5-10(calibratordiluentrd5-10)250ul到每个管子中。使用贮存液配置一系列的稀释液(20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml)，没有稀释的标准品(40ng/ml)作为高标准，标准稀释液作为0标准(0pg/ml)。

(二)测定步骤：

使用前将所有试剂和样本平衡至室温，所有样本、标准和对照测定双份。

1、准备所有的试剂和工作标准品，血清样本稀释150倍。

2、取下多余的微量培养板条，放回装有干燥剂的锡箔袋中，重新密封。

3、每孔加入50ulassaydiluentrd1-34。

4、每孔依次加入50ul标准品、样本和对照。用橡皮条密封，室温孵育2小时，记录测定标准和样本的分布。

5、吸弃孔内液体，每孔400ul洗涤液，充分洗涤后完全去除液体，在干净的纸上拍干，反复洗涤4次。

6、每孔加入200uls100a8/a9conjugate，用新的橡皮膏条密封。室温温浴2小时。

7、重复步骤5。

8、每孔加入200ulsubstratesolution，室温避光孵育30分钟。

9、每孔加入50ulstopsolution，孔内颜色应该由蓝变黄。如果孔内颜色是绿色，或者颜色变化不均匀，轻轻拍打板子以确保充分混匀。

10、30分钟内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度，如果波长校正是有效的，设定为540nm或570nm。如果波长校正不可用，从450nm波长读数减去540nm或570nm波长读数。这种方法可以校正板的光学缺陷。直接在450nm而无校正读数可以会偏高或偏低。

(三)计算结果：

1、标准、对照、样本的od值减去零标准的od值，取两个复孔的均值。

2、用4参数曲线，使用电脑软件建立标准曲线。

3、如果样本已经被稀释，由标准曲线得到的浓度必须乘以稀释倍数。

二、实验结果：

根据cabg术后院内发生mace事件(死亡、低心输出量综合征)情况，将688名冠心病患者cabg术后分为mace组(65人)和non-mace组(623人)。相比non-mace组，mace组患者的血清s100a8/a9含量在cabg术后24小时内有显著提升。mace组较non-mace组升高2.41倍(p<0.001)，结果见图1和下表1所示。

表1、在cabg术后1天，mace组患者和non-mace组患者血清s100a8/9含量

实施例2：s100a8/a9对院内mace事件的预后评估价值

688名患者与实例1相同。实验结果：

通过建立cox回归模型说明标志物水平与院内mace事件之间的关系，校正年龄、性别、euroscoreii评分、术前nt-probnp、术后肌酐、术前及术后的ctni和术前及术后的射血分数九个因素，s100a8/a9对于院内mace事件的发生有独立预测价值，结果见下表2所示。

表2、cox回归模型统计标志物水平与院内mace事件之间的关系

(未校正hr是在cox回归模型中只放入标志物。校正hr是在cox回归模型中放入标志物和前述的校正因素)

实施例3：s100a8/a9对cabg术后院内不良事件预测的风险分层

688名患者与实例1相同。

实验结果：

1、在院内mace事件分析中，使用roc曲线分析确定cabg术后24小时s100a8/a9院内不良事件预测的cut-off值，具体roc曲线见图2，其中的各项roc数据见下表3。

表3、cabg术后24小时s100a8/a9与mace事件的相关数据

2、使用kaplan-meier生存曲线评价s100a8/a9院内mace事件预测的cut-off对不良事件的预测价值。标志物水平<7860ng/ml的患者预后情况优于标志物水平升高的患者(p<0.001)，结果见图3。

最后需要说明的是，以上实施例仅帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。