专利名称：荧光分光光度计的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及荧光光谱学，尤其涉及测量偏振荧光的荧光分光光度计。
荧光分光光度计一般包括光源、主(或激励)单色仪、盛纳待分析试样的试样室、第二(或发射)单色仪、光电检测器和信号处理装置。激励单色仪从光源中选出特定波长的光并将其投射在试样室内的试样上。所产生的荧光被引入发射单色仪，並且选定波长的荧光射到光电检测器上，该检测器产生对应于荧光强度的电信号。
为了用荧光分光光度计测量荧光的偏振度，习惯上是在从激励单色仪至试样的激励光光路上放置一个偏振器，在从试样至发射单色仪的荧光光路上放置另一个偏振器。在测量荧光偏振度的现有技术方法中，试样用单一种类的荧光染料染色，以测量单一波长荧光的偏振度。例如在生物工艺学中，通过测量由荧光染料染色的细胞所发荧光的偏振度，就有可能了解细胞膜的液流性。
随着目前生物工艺学的进步，测量来自单细胞不同部份(例如细胞膜表面或其内部)的偏振荧光的偏振度已成为必要。
有可能用不同的染料对细胞不同部分进行染色。但是没有合适的荧光分光光度计可以测量荧光偏振的时间过程以及由同一试样发射的不同波长荧光的偏振度。
本发明的主要目的是提供一种荧光分光光度计，它可以测量由用两种以上荧光染料染色的试样所发出的两个以上波长的偏振荧光的时间过程。
图1是本发明各装置的分布简图;
图2是装置运行实例的流程图;
图3是运行时序图;
图4表示图3所示运行获得的数据的曲线图;
图5是本发明一个实施例的方框图。
图1表示根据本发明构成的荧光分光光度计，它包括光源1，第一(或激励)单色仪2，试样室3，第二(或发射)单色仪4，检测器5。单色仪2将来自光源1的光色散成一系列波长的光，其中的一个被选出以便投射到盛纳待分析试样的试样室3上去产生荧光，第二(或发射)单色仪4将该荧光色散成不同的波长，它们被有选择地施加到检测器5上。
第一(或激励光)偏振器(以下称作激励偏振器)6放置在激励单色仪2和试样室3之间的光路(以下称作激励光路)Px上，第一(或发射光)偏振器(以下称作发射偏振器)7放置在试样室3和发射单色仪4之间的光路(以下称作发射或荧光光路)Pm上。
单色仪控制器8同步地控制激励单色仪2和发射单色仪4，使激励单色仪2的激励光波长和发射单色仪4的发射光波长以下文详述的方式成对地改变。偏振器控制器9分别控制激励偏振器6和发射偏振器7，使得每一个偏振器的偏振方向在两个正交方向之间改变。偏振方向表示通过偏振器的光的电矢量的方向。
当发射偏振器7调到两个正交偏振方向的每一个上时，数据处理器10(它包括检测器前置放大器、取样模/数转换器和微处理机)接收来自检测器5的检测信号，存储器11存储来自处理器10的数据。系统控制器12控制单色仪控制器8、偏振器控制器9和信号处理器10的工作。
为了测量来自试样的偏振荧光的偏振度，调节激励偏振器6，使其偏振方向垂直于包括激励光路Px和发射光路Pm两者的平面，发射偏振器7的位置在两个正交位置，即发射偏振器7的偏振方向与激励偏振器6的偏振方向相平行的第一位置和发射偏振器7的偏振方向与激励偏振器6的偏振方向相垂直的第二位置，之间交替地改变。在第一位置，由于激励偏振器6和发射偏振器7的偏振方向互相平行，所以可以说这两个偏振器处于“平行”状态。在第二位置，由于两个偏振器的偏振方向互相垂直，所以可以说它们处于“垂直”状态。用“IPar”表示偏振器处于平行状态时来自试样的荧光强度，用“IPer”表示偏振器处于垂直状态时的荧光强度，由此，偏振度P为P＝(IPar-IPer)/(IPar+IPer) (1)为了同时测量来自两种荧光染料染色的试样的荧光的偏振度，同时在相应于这两种荧光染料的两个波长状态之间交替地改变激励光波长和发射光(荧光)波长，在每一个波长状态下，随着发射偏振器的位置在上述两个正交位置之间改变，在每一个偏振位置对来自试样的偏振荧光进行测量，以计算偏振度。
所述的操作将结合附图2和3的例子被进一步详叙，其中各自提供激励波长和发射波长的两个波长状态A和B是交替的。
在步骤S1，激励单色仪2的激励波长被调节到波长状态A的波长Exλa，发射单色仪4的发射波长被调节到同一个波长状态A的波长Emλa。单色仪控制器8控制激励波长和发射波长的调节和改变。
在步骤S2，激励偏振器6固定在上文所述的垂直于包括激励光路Px和发射光路Pm的平面的位置，发射偏振器7由偏振器控制器9调节到上文所述的第一位置，在该位置，发射偏振器7的偏振方向“平行”于激励偏振器6的偏振方向。然后在步骤S3，数据处理器10从光电检测器5的信号中取样，并将处理过的数据送至存储器11。
然后在步骤S4，偏振器控制器9将发射偏振器7的位置改变至上述的第二位置，在该位置，发射偏振器7的偏振方向“垂直”于激励偏振器6的偏振方向，然后在步骤S5，数据处理器10从光电检测器5的信号中取样，并将处理过的数据送至存储器11。
然后在步骤S6，检测波长状态是否为A，如果状态是A，则采取步骤S7，否则返回到步骤S1。
在步骤S7，单色仪控制器8将激励单色仪2的波长和发射单色仪4的波长分别改变成另一个波长状态B的激励波长Exλb和发射波长Exλb。这样，波长状态交替地变化。
在波长状态B下，随着发射偏振器7的位置在上述两个正交位置，即在发射偏振器7的偏振方向分别“平行”于和“垂直”于激励偏振器6的偏振方向的位置，之间改变，数据处理器10从检测器5的信号中取样，存储器11存储处理过的数据(步骤S2至S5)。
波长状态的改变，发射偏振器7位置的改变，对来自检测器数据的取样，以及数据在存储器11中的存储，所有这些操作都在系统控制器12的控制下反复地进行。
以上述方式，在波长状态A下，发射偏振器7的位置在两个正交位置之间改变，以获得图4A所示的一套数据，同样，在波长状态B下，发射偏振器7的位置在两个正交位置之间改变，以获得图4B所示的另一套数据。这些数据作为时间过程的数据存储在存储器11中，通过对存贮数据的算术运算计算偏振度P。如果算术运算足够快，则可以进行偏振度的实时计算。
现在参照图5叙述本发明的一个实施例，用氙灯1a作为光源。来自氙灯的光被透镜装置1b聚焦到第一(或激励)单色仪2上。在来自激励单色仪2的单色光的激励光路Px上放置第一(或激励)偏振器6，它借助第一脉冲电机20可以统平行于激励光路Px的光轴的轴旋转，以使通过了偏振器6的激励光的偏振方向可以有选择地调节到两个正交方向上。来自偏振器6的偏振光投射到盛纳待分析试样的试样室3上，试样随之向各个方向发射荧光，其中射向透镜1d的光沿着垂直于激励光路Px的发射光路Pm通过第二(或发射)单色仪4。在发射光路Pm上放置第二(或发射)偏振器7，它借助于第二脉冲电机21可以旋转，以使平行于或垂直于偏振方向的光可以通过发射偏振器7与偏振器的偏振方向一致。脉冲电机20和21是由微处理机23通过输入-输出接口22来控制的。
发射单色仪4将已通过偏振器7的偏振荧光色散成不同的波长，检测器5(可以是光电倍增管)接收其中选定的一个。检测器5产生相应于接收到的光强的电输出信号，并将该输出信号送至放大器24。模/数转换器25将放大了的信号转换成数字信号，该数字信号通过输入-输出接口26传送至微处理机23。
微处理机23包括中央处理单元(CPU)27，随机存取存储器(RAM)28、只读存储器(ROM)29和时钟脉冲发生器30，所有这些部分都通过总线31连接。ROM29用来存储系统工作所需的各种程序，例如改变单色仪2和4的波长的程序，改变偏振器6和7的位置的程序和对所测数据取样的程序。CPU27和ROM29对应于图1所示的单色仪控制器8、偏振器控制器9、数据处理器10和系统控制器12，RAM28对应于图1中的存储器11。
如上所述，为了测量偏振度，固定激励偏振器6的位置，使偏振器6的偏振方向垂直于包括激励光路Px和发射光路Pm的平面。
为了测量荧光分光光度计本身的偏振特性，应该改变激励偏振器6的偏振方向。尤其是，将激励偏振器6的偏振方向从垂直于包括激励光路Px和发射光路Pm的平面的位置改变到平行于该平面的位置，激励偏振器6保持在平行位置上，在上述“平行”于和“垂直”于与包括光路Px和光路Pm的平面相垂直的方向的两个正交方向之间改变发射偏振器7的偏振方向，以测量偏振荧光的分量I′Par和I′Per的强度。荧光分光光度计的偏振特性G表示为G＝I′Par/I′Per(2)如果G＝1，则荧光分光光度计没有偏振特性。
如果考虑偏振特性G，则偏振度表示为P＝(IPar-G·IPer)/(IPar+G·IPer)在上述实施例中，试样是用两种不同的荧光染料染色的。在使用三种或更多种荧光染料的情况下，也可以通过提供三个或更多个相应波长状态(在每一个波长状态下，发射偏振器的偏振方向都在两个正交方向之间改变)，测量来自试样的偏振荧光。
权利要求
1.一种荧光分光光度计，其特征在于包括1)光源；2)激励单色仪，用于接收来自所述光源的光，以提供选定波长的激励光；3)盛纳待分析试样的试样室，所述激励光投射于其上，使所述试样发射荧光；4)发射单色仪，用于接收所述荧光，以提供选定波长的发射光；5)光电检测器，用于将所述发射光转换成相应于所述发射光的强度的电信号；6)一个装置，用于控制所述激励单色仪和发射单色仪，以根据多个波长状态中的每一个而同时改变所述激励光波长和所述发射光波长；7)置于所述激励光路上的激励光偏振器；8)置于所述发射光路上的发射光偏振器；9)一个装置，用于控制所述发射光偏振器的位置，使所述发射光偏振器的偏振方向可以在每一个所述波长状态下有选择地吻合于每一个平行于和垂直于包括所述激励光光路和所述发射光光路的平面的方向；10)信号处理装置，用于当所述发射光偏振器的偏振方向与所述平行和垂直方向中的每一个相吻合时，对来自所述光电检测器的所述输出信号取样，並且处理所述取样信号；以及11)用于存储所述已处理的信号的装置。
2.根据权利要求1的荧光分光光度计，其中固定所述激励光偏振器，使其偏振方向垂直于包括所述激励光路和所述发射光路的所述平面。
3.根据权利要求1的荧光分光光度计，进一步包括一个装置，用于控制所述激励光偏振器的位置，使所述激励光偏振器的偏振方向可以有选择地与两个正交方向中的每一个相吻合。
4.根据权利要求3的荧光分光光度计，其中所述两个正交方向中的一个平行于包括所述激励光路和所述发射光路的所述平面，而另一个垂直于所述平面。
全文摘要
在包括光源、激励单色仪、试样室、发射单色仪、光电检测器和信号处理装置的荧光分光光度计中，在激励光路和发射光路上分别放置激励光偏振器和发射光偏振器，根据多个波长状态中的每一个同时改变两个单色仪的激励光波长和发射光波长，并且在每一个波长状态下，在两个正交方向之间改变发射光偏振器的偏振方向，在每一个方向，信号处理器对检测器的输出取样，并存储处理过的数据，以用于计算来自试样的偏振荧光的偏振度。
文档编号G01N21/64GK1035357SQ8910081
公开日1989年9月6日 申请日期1989年2月15日 优先权日1988年2月16日
发明者大久保邦彦 申请人:株式会社岛津制作所