专利名称：酶发光测定方法
技术领域：
本发明涉及一种检测酶活性的方法，特别涉及检测生物来源的样品中酶活性水平的测定方法。
有许多种测定方法可用于检测具有生物学重要性(无论是显示正常状态还是表现为病态)的特定分子的浓度和活性。在这些待测分子中包括酶，酶是典型的生物催化剂。虽然酶可通过仅检测该分子是否存在的传统方法测定，但这样的测定不能用于测定酶活性水平。例如，一种依赖于酶上某一特定抗原决定簇存在的检测该酶的免疫测定法，只要该抗原决定簇不改变，即表明有一定量的酶存在。如果该酶存在，但酶活性，例如由于与修饰过的底物的不可逆结合或存在于酶的活性中心的金属离子所产生的抑制作用而改变，则即使可正确地示出所存在的酶量，所示出的酶活性水平也是不准确的。
相对于酶量测定，目前已有测定酶活性的技术，由于酶是使底物转化为产物的催化分子，所以这样的测定一般包括测定底物的量随时间的变化。其中一种方法是使用一种无色，但当与酶作用时可形成有色产物的底物。已发展了许多这样的反应，在分析反应如酶联免疫吸附测定(ELISA)中酶本身用作标记物。过氧化物酶常常用作这种类型的标记物，因此便于用相同的底物和反应产物测定过氧化物酶的活性。然而，这样的测定方法只有在可经历颜色变化的适宜底物可得到的情况下才能使用，因而不是通常适用的方法。
对于大多数类型的酶来说，不能使用显色测定法。动物细胞糖基转移酶就是这类酶的实例。这些酶通过使一种糖核苷酸供体的糖部分转移到一条待增长的多糖或寡糖链的特定羟基上而在糖结合物上催化形成糖苷键。动物细胞中代表性糖结合物包括糖蛋白，糖脂和葡糖氨基聚糖。
不同于核酸和蛋白质，在糖结合物的合成中不涉及模板，因此，其合成的控制及其结构的确限度取决于糖基转移酶的表达和高度特异性。动物细胞中不同的糖基转移酶的总数是未知的，然而，基于所观察到的糖结合物结构的变化，看来存在着数百种这样的酶。此外，不同的糖基转移酶可利用相同的糖核苷酸和相似的受体生成不同的产物。如下所述，糖基转移酶的这些特征当有一种以上的酶存在于组织样品中时，在检测它们的比活性时出现一些独有的问题。
目前，大多数测定糖基转移酶的方法都采用放射性同位素并包括从糖核苷酸掺加到产物糖苷中的放射性的测定。各种非放射性同位素糖苷转移酶测定法已得到发展，但这些测定法的灵敏度并非明显高于使用现存的放射性同位素测定法所获得的灵敏度。虽然已知测定法的灵敏度相对于许多其它类型的酶测定法来说可能是高的，但对于许多糖基转移酶来说它又低得无法接受，糖基转移酶的活性可低至1pmol/小时/mg细胞蛋白质。
本发明人之一的实验室已报导了一种测定糖基转移酶的方法。在cummings等人，J.Biol.Chem.(1988)5511-519中报导了一种用外源凝集素俘获UDP-半乳糖;β-D-半乳糖基-α-1，3-半乳糖基转移酶的特异酶产物的测定法。将放射性标记的半乳糖从供体分子UDP-GlcNAc(尿苷-5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺)转移到一种糖蛋白受体分子的末端，并用外源凝集素衍生的亲合柱(柱上结合酶反应产物而不是反应物)从溶液中分离出该产物。然而，这种测定法严格地受测定放射性标记所需时间和难度限制。
几年来，为了在免疫测定中不再使用放射性同位素而代之以其它类型的可检测标记物，已做过多种尝试。某些酶已被成功地用作许多免疫测定的标记物，即使这些酶的灵敏度一般低于同位素标记物的灵敏度。这类测定法的典型实例是其中用酶标记免疫球蛋白的测定法，通常称之为酶免疫测定法(EIA)。在这类测定法中也可用酶标记分析物。有关EIA的详细描述见WilfrldR.Butt编辑的“PracticalImmunoassay”第3章，“ClinicalandBiochemicalAssays”14卷(MarcelDekker，Inc.，1984)。
除酶之外，化学发光化合物和生物发光化合物也已被用作免疫测定的非放射性标记物，代替同位素。这类测定法被称为发光免疫测定法(LIA)或免疫化学发光计量测定法(ICMA)。这些标记物通常已证明在灵敏度方面是与同位素等同的，但经常受到与标示物的蛋白组分(典型的是荧光素酶)的非特异性结合相关的问题的阻碍。有关这些测定法的更详尽的描述见“PracticalImmunoassay”第5章，op.cit.和PatelandCormier，AnalyticalApplicationsofBioluminescenceandChemiluminescence，273-276页，AcademicPress，Inc.，1984。
然而，以前采用的测定法没有一种能提供适于酶活性测定的通用性，高灵敏度，并消除本底干扰。因此，尚需要可在样品中直接测定相对于酶浓度的酶活性的测定法和普遍适用于各种酶的直接方法。
因此，本发明的目的在于提供一种特异地，快速地和简便地测定尤其是生物来源的样品的酶活性的方法。
本发明的另一个目的是提供一种测定酶活性的方法，该方法可用于各种酶而不需技术上的较大变化。
通过提供一种检测样品中酶活性的存在或水平的方法已达到了本发明的这些和其它目的，这些目的通过下述将会更加明显，所述方法包括在反应介质中将(1)怀疑含有所述酶的样品和(2)能与所述酶反应生成标记产物的所述酶的标记底物合并，其中所述标记物包括一种生物发光蛋白或能被转化为生物发光蛋白的标记物;使所述酶和所述底物在一定时间内发生反应，从而在所述酶存在下生成所述产物;将能与所述标记产物或所述标记底物(但不是两种同时)特异性结合以形成复合物的受体与反应介质合并;和通过在所述生物发光蛋白的控制下引发光发射来检测在所述复合物中或在不与受体反应的非复合、标记组分中标记物的存在或量。
参照下面具体实施方案的详述，并结合考虑构成本说明书一部分的附图，可更好地理解本发明。
图1是本发明第一个实施方案的图解。
图2是本发明第二个实施方案的图解。
图3是本发明第3个实施方案的图解。
图4是本发明第4个实施方案的图解。
图5是用于一种特殊测定的本发明实施方案的图解。
本发明提供一种检测酶活性的方法，该方法适用于任何经与一种结合物(受体)结合而产生一种能与酶的底物区分开的产物的酶。使用一种能俘获产物而不与底物适度结合(反之亦然)的受体，可容易地区分并定量所形成的产物或参加反应的底物的量。本发明的方法也需要一种生物发光蛋白，特别是能结合荧光素酶分子并通过一种外加引发物所引发的光蛋白，作为底物和/或产物的可检测标记物。另外，该标记物可被转化为生物发光蛋白标记物，例如通过俘获蛋白标记物与连接于底物或产物上的生物素分子的抗生物素蛋白复合物转化。通过使用生物发光蛋白作为标记物，可产生各种优点，如下文详述。
设计的方法最初是使用外源凝集素作为受体，碳水化合物作为底物和产物用于测定糖基转移酶，因为这些酶的天然存在量低，活性很低，给酶的测定带来困难。由于证明了本测定法可用于这种困难的测定，所以它可被应用于其它体系。其它天然特异结合化合物如激素受体可使得本发明能广泛用于各种酶。另外，通过杂交瘤生产的具有高度特异性的单克隆抗体也可使得这些技术能应用于许多不同的没有天然受体可供的酶产物。
该方法的范围相当宽，如下所示。按标准技术收集怀疑含有酶的样品，与具有可检测标记的酶的底物或能在测定的后一步骤被标记的底物合并。该底物也能与酶反应提供具有可检测标记的产物(或以后能被标记的产物)。其中加有这些主要成分的反应介质还含有其它酶催化反应所必需的成分。例如，如果酶催化的反应是另一成分与底物的共价连接，则该种成分应加到反应介质中。在待测样品中若有酶存在，要产生可检测量的产物需足够的时间。将一种与产物特异性结合而基本上对底物无特异结合亲合力(反之亦然)的受体在酶催化反应得以发生之前或之后与反应介质合并。根据所进行反应的类型，从反应介质中分离出产物-受体复合物或底物-受体复合物(多相测定)或对含有可溶态产物-受体或底物-受体复合物的反应介质进行测定(均相测定)。然后测定可检测标记物在复合成分或非复合，可溶性成分中的存在(定性测定)或量(定量测定)。
测定的各个步骤可依用于进行多相和均相测定的不同技术而广泛地变化。由于可用中间标记物标记底物，该中间标记物在底物与酶反应之前或之后被转化为一种包含生物发光蛋白的标记物，所以具体测定步骤还可有其他不同。图1-4示出四种变化。在图1中，用生物发光蛋白(L)标记的底物(S)与酶(E)反应产生标记产物(P)，然后P被第一种受体(R1)结合。在多相测定中将受体/标记产物复合物与非复合标记底物分离或不经分离即可进行均相测定。如图2所示，用一种不同的受体(R2)与底物而不是产物形成复合物。对这种变化同样适用均相和多相测定。在图3和图4中，用生物素标记的底物(S-O)被酶转化为产物(P-O)。然后加入与抗生物素蛋白连接的生物发光蛋白(
-L)形成最终标记物。然后或者用第一种受体与产物形成复合物(图3)或者用第二种受体与底物形成复合物(图4)。这些步骤的每一步以及其它变化详见下述。
可用本方法测定任何能产生充分不同于其底物的产物以便与受体相互结合的作用能够发生而区分底物和产物的酶的活性水平。由于生物受体所具有的高度特异性，实际上任何酶都能产生通过与受体结合而与原始底物区分开的产物。下表1按照国际分类系统列出了酶的类别。这一分类系统也用于本说明书的其它地方。
表1酶的国际分类(类名，代号，和所催化的反应类型)1.氧化-还原酶(氧化-还原反应)1.1.作用于-CH-OH1.2.作用于-C＝O1.3.作用于-CH＝CH-1.4 作用于-CH-NH21.5作用于-CH-NH-1.6作用于NADH;NADPH2.转移酶(官能团的转移)2.1单碳基团2.2醛基或酮基2.3酰基2.4糖基2.7磷酸根2.8含硫基团3.水解酶(水解反应)3.1酯3.2糖苷键3.4肽键3.5其它C-N键3.6酸酐4.裂合酶(加成到双键上)
4.1-C＝C-4.2-C＝O4.3-C＝N-5.异构酶(异构反应)5.1外消旋酶6.连接酶(经ATP裂解形成键)6.1C-O6.2C-S6.3C-N6.4C-C本发明的方法可适用选自任何所列类别或其它未列出的酶。从说明书的进一步讨论可明显看出，酶的底物，酶，酶的产物，和受体都是可变的，根据本说明书的描述，生化分析领域的专业人员可对其进行变更，从而获得一种可用于测定的各组分的组合。
当存在待分析酶的底物或产物的天然受体时，最易实施本发明。例如，有许多特异的外源凝集素，它们可识别具有高度特异性的碳水化合物链的末端部分。选择一种例如在由外源凝集素识别的特定序列中只缺少末端碳水化合物的底物，当通过糖基转移酶将适宜的末端碳水化合物加到底物碳水化合物链上时，可用外源凝集素结合所生成的产物。天然受体-酶成对物的其它实例包括激素受体和产生激素过程中所涉及的酶，以及转运蛋白质(例如甲状腺素结合球蛋白)和合成该转运物的酶。
混合物的产物组分并非必须是由待分析的酶直接产生的产物。例如，从类脂角鲨烯生物合成胆甾醇受一系列酶的控制。角鲨烯2，3-环氧化物可通过角鲨烯氧化环化酶环化为羊毛甾醇。使羊毛甾醇转化为胆甾醇还需要几个步骤。然而，可制备一种反应介质，使得能通过测定所产生的胆甾醇的量来测定角鲨烯氧化环化酶。这种反应介质应含有标记的角鲨烯(或角鲨烯2，3-环氧化物的其它标记前体，即酶的真正底物)，在正常情况下羊毛甾醇转化为胆甾醇所需的过量的酶，以使受角鲨烯氧化环化酶控制的步骤成为该反应的限制步骤，和产生胆甾醇所需的任何辅助因素或任何中间体。其它的酶体系可按类似的方法操作，以提供一种可接受的产物，底物，和受体组合，便于测定代谢或其它类型酶控制途径中任何酶的活性。因此，本文所用的术语“底物”和“产物”不一定是指待分析酶的直接底物或其直接产物，而可以是涉及待分析的途径中的另一种底物或产物。
如果底物或产物没有天然受体，则可用免疫学技术制备适宜的受体。单克隆抗体具有高度特异性，因而是优选的，尽管抗血清可在适当的情况下使用。在制备单克隆抗体和特异的抗血清时，用需要与之结合的反应成分(底物或产物)刺激B细胞(体内或体外)。一般使用未标记的成分以避免抗体产生对标记物的刺激作用，该标记物通常存在于产物和底物中。然后，通过检测抗体与需结合的成分的结合能力选择抗血清，或在单克隆方法中产生抗体的细胞。也可用第二种筛选反应消除抗体与非选择成分(例如，若欲使受体与产物结合，则为底物)之间的结合反应。例如，底物可附着在亲合柱上，如果这些抗体对底物具有结合亲合力它可从流经柱的溶液中除去抗体。如果用标记成分作为免疫原，则这种第二种选择方法也可用来消除与分子的标记部分结合的抗体。通过制备杂交瘤生产单克隆抗体是一种完全发展起来的方法，不需在此详细描述。
在其中发生酶与底物之间的反应的反应介质一般为pH适合于待分析酶的缓冲水溶液。反应介质还含有发生反应所需的其它成分。例如，如果酶为转移酶，则反应介质还可含有底物将被转移其中的成分。如果酶为氧化-还原酶，则也可供给氢离子源或氢离子受体(例如，NADH)。反应介质的其它成分从待分析的酶反应的性质看将是显而易见的。
样品可以是任何怀疑含有待分析酶的样品并可按照与所收集样品的类型有关的标准方法处理。典型的实例包括血(血清，血浆或全血)，尿，唾液，粪便，组织样品等。样品可以其最初获得的形式使用，也可经各种加工步骤提供以适于测定形式存在的酶。例如，如果是正常情况下的细胞质中的酶，则可破坏细胞壁使酶释放到反应介质中。
酶所作用的底物可根据设想的两个主要特征来选择。第一个特征是酶通过与受体的特异结合反应由底物生成可区别于底物的产物的能力。由于生物结合系统的高度特异性，这在正常情况下不会成问题。通过测定所选受体对底物和酶反应产物的结合亲合力可容易地确定是否任一特定的底物适于测定方法。若有必要，放射性标记物，例如非特异性氚标记物，可满足这种类型的筛选。
底物的第二个主要要求是其以不干扰底物与酶之间的结合的方式被生物发光蛋白标上可检测标记的能力。用许多类型的可检测标示物标记生物物质是一个完全发展起来的临床化学领域。生物发光标示物是众所周知的，将这样的标记物连接到其它分子上的技术也是众所周知的，许多出版物和专利都描述了标记许多不同种类化合物的技术。描述生物发光标记物与分析物连接的例子包括1987年6月5日提交的题目为“利用得自腔肠动物的荧光素酶和光蛋白的生物发光免疫测定法”的059，137号美国申请，题目为“用标记技术检测或定量测定物质”的4，478，817号美国专利，和题目为“生物发光示踪组合物和用于免疫测定的方法”的4，604，364号美国专利。
用于本发明方法的特定生物发光标记物包括一种能够与荧光素酶或其它发光分子结合并在适当条件下诱导发光的蛋白质或有关分子(例如糖蛋白)。已令人惊奇地发现生物发光蛋白可附着于酶的底物上而不会对底物与酶的反应能力或生物发光蛋白有效地发光能力产生不利影响。此外，发现生物发光蛋白经诱导和用作标记物时具有高于化学发光标记物的量子产量。虽然生物发光蛋白看来似乎与其它标记物如放射性标记物，和化学发光标记物相同，但实际上许多具有生物学意义的化合物在不用生物发光蛋白作为标记物的情况下都无法检测。
可得到各种生物发光蛋白。4，478，817号美国专利，4，604，364号美国专利，和1987年6月5日提交的059，137号美国申请(详见上文)都描述了可用于实施本发明的生物发光蛋白标记物。此外，Serio和Pazzagli编辑的《发光测定法》(LuminescentAssays)第1卷(RavenPress，1982)第115和125页给出了用萤火虫荧光素酶作为多相免疫测定的标记物检测微微克分子量的氨甲蝶呤和三硝基甲苯的实例。
最好使用通过重组技术制备的蛋白质作为本发明的生物发光标记物。1988年2月29日提交的165，422号和1988年3月7日提交的173，045号美国专利申请描述了许多能够表达脱辅基水母发光蛋白，即一种得自腔肠动物的光蛋白的重组DNA载体。
特别优选作为蛋白标记物的是光蛋白(相对于以酶促方式作用的荧光素酶和其它生物发光蛋白)。本发明的光蛋白易于与控制发光反应的酶如荧光素酶区分，因为光蛋白具有在有氧情况下结合真正的发光分子(例如荧光素)而不直接发光的能力。
得自腔肠动物的光蛋白特别适用于实施本发明。得自腔肠动物的光蛋白的实例为水母发光蛋白，obelin，mnemiopsin，和berovin。在许多科技出版物中都描述了这些分子，见Wardetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1975)722530-2534。这种得自腔肠动物的蛋白质在无游离钙离子的情况下是稳定的并含有腔肠动物荧光素和与蛋白质结合的氧。本文所用术语“发光分子”是指荧光素和与光蛋白结合(或受荧光素酶作用)的类似的有机小分子，它们是所发出的光的真正来源。当将钙离子(它是得自腔肠动物的光蛋白的生物发光引发剂)加到用光蛋白标记的溶液中时，由荧光素分子发射出蓝色的光，发射光最大值在波长约469nm处。有关这种标记物的描述详见1987年6月5日提交的059，137号美国申请(列为本文参考文献)。用遗传工程技术制备的一种光蛋白见1988年2月29日提交的165，422号和1988年3月17日提交的173，045号美国申请(这两个申请的题目为“能够表达脱辅基水母发光蛋白的重组DNA载体)。
本文所述的光蛋白所具有的一个特殊优点是它们能够在无结合的发光分子情况下用于减弱本底发光的技术。与使用直接与发光分子反应而发出光的荧光素酶和其它酶促分子相关的问题之一是该体系的蛋白组分将优先与存在于反应介质中的各种表面和分子非特异性地结合。当将荧光素或另一种发光分子加到介质中以产生光时，则发生本底发光。由于光蛋白需要一种单独的引发剂分子，所以可使用不含发光分子的光蛋白预先涂覆反应介质的表面。这种蛋白称为脱辅基光蛋白。然后用载有发光分子的光蛋白作为标记物。由于可以控制发光分子在脱辅基光蛋白上装载和卸载的条件，所以有可能选择反应介质的条件以便不发光蛋白之间的发光分子的交换。在这些情况下，只有用作标记物的光蛋白受到外加引发剂(用于腔肠动物的光蛋白的钙离子)引发时即发射出光，因为用于消除本底发光的脱辅基光蛋白不含有发光分子。可用于本发明的优选实施方案(及其许多其它实施方案)的这一优越的技术可参见与本申请同日递交的，题目为“提高发光测定法的灵敏度的方法”的共同未决申请。
制备出含有酶和可检测的标记底物的反应介质后，使其有足够的时间在酶和底物之间发生反应。由于酶具有不同的转换率，这一时间随所分析的具体的酶会有不同。典型的转换率可在几秒至几分的范围内变化，而缓慢作用酶保温时间要更长一些。
由于酶的活性一般是通过测定在给定的时间内发生反应的量来测量的。因此需要有精确的开始和结束的时间计时。在多数情况下，反应是通过将样品与标记或未标记底物混合引发的。反应结束可采用若干种方式，取决于特定的酶和/或所采用的分析方法的类型。例如，可改变反应介质的pH(如加酸)，使在所提供的pH下酶的活性大大降低。其它终止反应的技术包括加入大量过量抑制剂，加热反应介质使酶变性，冷却反应介质以降低反应率和加入表面活性剂或其它Caotropic剂以打乱酶的结构。如果在反应中产物是用附着在固相表面的固相受体俘获的，可通过使反应介质与固相受体脱离接触终止反应。例如，如果受体附着于微量滴定板孔壁上，可迅速将反应介质抽出，然后用人工或在自动微量滴定板处理器中洗涤。如果使用的受体与酶底物结合，而不是与产物结合，向反应介质中加入受体将导致底物与受体结合，从而防止底物与酶继续反应。然而，在此种和类似的酶并未失活的情况下，必须注意防止平衡被破坏，因为酶有时能够催化逆反应(此时，由产物形成底物)，若持续使酶与反应中未俘获的组分接触，会产生不正常的结果。由于在反应介质中还可能发生其它反应脱除潜在的反应物，例如产物水解或转化为不能进行逆反应的形式，因此上述问题在许多反应中不成为问题。其它终止反应的方式对专业领域的技术人员是显而易见的。
在适当的时机，这取决于所采用的分析方法，将能与可检测标记产物特异结合形成产物-受体复合物的受体或能与可检测标记底物特异结合形成底物-受体复合物的受体并入反应介质。如前所述，受体的选择应该是对两组分中的一个基本没有特异结合亲合力，对另一个有特异结合亲合力。结合亲合力的绝对值并不重要。然而，较高结合亲和力增加分析的灵敏度，并可允许待测酶的数量少和活性低。特异结合亲合力(与非特异结合亲合力相对)是指受体在天然结合部位与天然结合靶分子相互作用的能力。在R+T→C的反应中，受体R和靶分子T相互作用形成复合物(R-T，此处用C表示)的缔合常数(KA，用M-′为单位表示)对于抗体靶(配位体)相互作用一般至少为107。已知抗体结合反应缔合常数高到1012。其它类型的配位体-受体相互作用和缔合常数可更高。例如，生物素-抗生物素蛋白相互作用的缔合常数大约为1015，激素-受体相互作用通常接近甚至超过此值。
比缔合常数的绝对值更重要的是目的靶的缔合常数与另一不希望结合的组分的缔合常数之比。例如，如欲结合产物，可取的是，这一结合反应的缔合常数至少是受体和底物间相互作用缔合常数的103倍。该比值以至少为105为好，以至少107为更好。通过产物和底物对有限数量的受体结合位点竞争(不存在酶)，可以确定相对结合亲合力。
如果需要，可在用酶形成产物后，使生物发光蛋白与产物连接。尽管这种连接在必要时可以用与标记物在酶反应前和底物相连的相同方式进行，可取的是使用非共价连接基，在发生酶反应时反应介质所处的条件下完成。例如，可采用生物素和抗生物素蛋白之间的强结合反应在产物形成后在溶液中将标记物连接于产物。抗生物素蛋白，较好是抗生蛋白链菌素，可直接与底物结合，或间接与底物结合，这时生物素直接与底物结合，抗生物素蛋白与底物上的生物素结合。然后，可将生物素化的发光剂，例如生物素化水母发光蛋白，加到溶液中，使底物变为用光蛋白标记。Hsu等人在“ImmunoperioxidaseTechniques;AComparisonBetweenABC&Unlabeled(PAP)Procedures”(1981，J.Histochem.Cytochem.29;577)中描述了几种使用生物素-抗生物素蛋白复合物将标记物连接于有机分子的技术。
受体和反应介质中适当组分一旦发生相互结合反应，即采取步骤检测待测的两种可检测形式之一中可检测标记物的存在或量。由于适用于本发明分析方法的测定类型多种多样，上述技术也是多变的。例如，如果是均相分析，可采用骤冷或能量转移来区分与骤冷标记(或能量接收标记)的受体形成复合物的标记物和仅与可溶的底物或产物分子结合的标记物。如果反应是多相分析，其中固相和液相要分离，受体结合的靶是标记产物，那么将反应介质与固相受体复合物分离，可测定固相受体复合物或液相未复合的可检测标记底物的标记物。测定可检测标记物和两组分之一的存在或其量所必需的具体步骤，根据所用标记物的类型和具体分析方法(如均相或多相，测试产物或未反应的底物)，对医药化学领域的技术人员是显而易见的。当采用光蛋白作标记物时，向被测定的介质中加入适宜的引发物诱导发光之后测定发生度。
作为一种可能的分析方法，这里详细论述用本发明的方法测定糖基转移酶。在此除了提供分析如何进行的细节以外，还介绍了采用本发明的酶俘获分析方法测定用以前的测定技术不易达到的酶活性测定。
在此例中，被分析的酶是UDPGalβ-D-GlcNAc(β14)半乳糖基转移酶。这一分析中涉及的主要组分示于图5。如图所示，分析中两种基本试剂是重组水母发光蛋白和抗生蛋白链菌素。天然水母发光蛋白是取自水母Aequorea victoria的20，000道尔顿生物发光蛋白。每摩尔该蛋白含有大约1摩尔腔肠动物发色荧光素。该蛋白在钙离子存在下产生蓝光(λ最大469nm)，其量子产率可使水母发光蛋白在10-19至10-20摩尔范围内被检测到。水母发光蛋白的这一数量相当于大约每升1，000-10，000个分子。基因编码脱辅基水母发光蛋白(没有荧光素分子的蛋白)已进行了克隆，所得蛋白是上述“重组”脱辅基水母发光蛋白。经与合成腔肠动物荧光素、溶解氧和2-巯基乙醇一起保温，可将重组脱辅基水母发光蛋白高产率地转变成重组水母发光蛋白。使用市场可供的反应物使重组发光蛋白生物素化。第二种试剂，即抗生蛋白链菌素是取自阿维丁链霉菌的60，000道尔顿的生物素结合蛋白。每一分子该蛋白结合4分子具有高度亲合力的生物素(KD约为10-5M)。抗生蛋白链菌素是市场可供的。
在图5所示的示意性分析中，含有末端GlcNAc残基的糖肽以共价键连接于抗生蛋白链菌素，作为UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基转移酶的受体。酶反应产物含有Galβ1-4GlcNAc键。保温后，将生物素化的重组水母发光蛋白加到反应混合物中，在此，它与产物和底物中抗生蛋白链菌素上所有可利用的生物素结合位点形成复合物。为将酶反应产物与底物和分析中的其它组分分离，使反应混合物通过固定化外源凝集素RicinusCommunis凝集素-I柱。这一植物外源凝集素以高亲合力与含有末端序列Galβ1-4GlcNAc-糖肽的糖结合物结合，但不与这一结构的异构体，例如Galβl，3GlcNAc-糖肽或Galα1，4GlcNAc-糖肽结合。通过用含有乳糖(它是一种与外源凝集素有竞争力的配位体)的缓冲液洗脱柱，由外源凝集素柱释放出由外源凝集素结合的糖肽-抗生蛋白链菌素产物。然后向洗脱液中加入钙离子，测定水母发光蛋白产生的光子数，由此测定产物的总量。在这一体系中，光子放射在10秒内出现，产生的光子总量与原始样品中酶的活性直接有关。
糖基转移酶的糖肽受体(底物)可由纤维蛋白原制备。简言之，是用经链霉蛋白酶消化纤维蛋白原制备的纤维蛋白原糖肽作为初始原料。在ConA柱上用亲合层析分离纤维蛋白原糖肽中的双触角链。洗出来结合的物质，结合的糖肽用α-甲基甘露糖苷溶液洗脱。在经过本文下面实验部分详述的一系列操作后，得到无唾液酸，无半乳糖纤维蛋白原糖肽。这一物质作为反应中的底物，如下面实施例所详述，采用市场可供的试剂，与抗生蛋白链菌素共价偶联。
在所述酶分析中，反应混合物含有抗生蛋白链菌素-糖肽结合物(SGP)，UDP-Gal，氯化锰和缓冲剂。反应在37℃进行，然后在如上述加入生物素化水母发光蛋白前将混合物冷却至4℃抑制酶活性终止反应。如下面实施例所示，分析结果表明，与经典放射性同位素分析方法相比，采用上述技术，半乳糖基转移酶活性测定的灵敏度至少提高三个数量级。
这种技术同样可用于其它糖基转移酶，例如UDPGalβ1，4Glc(NAc)-(β1，3)半乳糖基转移酶和CMPNeuAcGalβ1，3(4)Glc-NAc(α1，3)唾液酸转移酶。UDPGalβ1，4Glc(NAc)(β1，3)半乳糖基转移酶在含有Galβ1，4Glc(NAc)-糖序列的低聚糖中末端半乳糖残基连接的α1，3键与半乳糖相连。该酶负责糖结合物上末端Galαl-3Gal序列的合成。所有人的血清含有大量(约为循环IgG的1%)抗这一抗原决定簇的天然存在的抗体。已有指出，人的这种糖基转移酶的异常表达可能导致抗原决定簇的合成和引发自身免疫过程。对这一半乳糖基转移酶的测定与上述对UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基转移酶的测定相同。例外之处包括受体的结构，分离受体和产物用的固定化外源凝集素亲合柱的特异性和糖核苷酸。糖核苷酸(UDPGal)是相同的，但受体糖肽将是与抗生蛋白链菌素偶联的纤维蛋白原糖肽的无唾液酸衍生物，外源凝集素柱将由得自GriffoniaSimplicifoliaⅠ的外源凝集素制备。该外源凝集素与具有末端序列Galα1，3Gal-糖的低聚糖结合。结合的糖肽-抗生蛋白链菌素产物用甲基-α-半乳糖苷或末端为α-连接的半乳糖的低聚糖如棉子糖洗脱。
可采用相同的方法(其中变动不大)测定CMPNeuAcGalβ1，3(4)GlcNAc(α1，3)唾液酸转移酶，该酶将NeuAc由CMPNeuAc转移到含有末端序列Galβ1，3(4)GlcNAc-糖的低聚糖中。CMPNeuAcGalβ1，3(4)GlcNAc(α1，3)唾液酸转移酶是生物合成动物细胞糖结合物过程中链终止反应的重要的酶。反应产物NeuAcα2-3Gal-糖是由人细胞分离的流感病毒(H3血清型)的细胞表面受体。测定中与上述UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基转移酶的测定不同之处包括使用CMPNeuAc作为糖核苷酸，用纤维蛋白原糖肽的无唾液酸衍生物作为受体分子。外源凝集素柱用得自Maackiaamurensis的白细胞外源凝集素制备，该外源凝集素与酶的产物，即具有末端序列NeuAcα2，3Galβ1，3GlcNAc-糖的低聚糖结合。采用这种固定化外源凝集素结合无唾液酸糖肽-抗生蛋白链菌素-水母发光蛋白产物可使产物与原始底物和其它例如由相关但不同的酶形成的产物分离。
尽管上述实例涉及的是糖基转移酶，但根据本说明书和下述的实施例将本技术用于其它酶对本专业领域的技术人员是显而易见的。如本文所述，只要能用受体由酶底物区分出酶产物，则没有理由使反应不包括表Ⅰ所列各种类型或任何已知的酶。
用下面实施例对本发明加以说明，而不是对其加以限制。
实施例测定UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基转移酶活性用市场可供的UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖苷转移酶(SigmaChemicalCo.，St.Louis)做证明检测可行性的研究。测定原理示于图5。
测定中，含有末端GlcNAc残基的糖肽共价连接于抗生蛋白链菌素，作为UDPGalβ-D-GlcNAc(β1，4)半乳糖基转移酶的受体。酶反应的产物在其末端含有Galβ1-4GlcNAc键。保温后，加入生物素化水母发光蛋白与产物中和反应物中抗生蛋白链菌素上所有可利用的生物素结合位点形成复合物。为将酶反应产物与测定中的其它反应物分离，使反应混合物通过固定化外源凝集素RicinusCommunis凝集素-Ⅰ柱。该植物外源凝集素以高亲合力与含有末端序列Galβ1，4GlcNAc的糖结合物结合，但不与该结构的异构体，例如Galβ1，3GlcNAc糖结合物或Galαl，4GlcNAc糖结合物结合(MerkleandCummings，MethodsinEnzymol(1987)138232-259)。用含有100nM乳糖的缓冲液(是与外源凝集素有竞争力的配位体)洗脱该柱，由外源凝集素柱释放由其结合的糖肽-抗生蛋白链菌素产物。然后加入Ca++，通过测定水母发光蛋白产生的光子量测定产物总量。10秒钟内出现光子放射，产生的光子总量与样品中存在的酶量直接有关。
半乳糖基转移酶的糖肽受体是如前所述由纤维蛋白原制备的(Cummings and Kornfeld，J.Biol.Chem.(1982)25711235-11240)。简言之，使用经链霉蛋白酶消化1g纤维蛋白原(Sigma Chem.Co.)制备的纤维蛋白原糖肽作为初始原料。通过在100ml Con A-琼脂糖柱上层析分离纤维蛋白原糖肽中存在的双触角链。未结合的物质用TBS(10mM Tris，1mM CaCl2，1mM MnCl2和0.02%NaN2，PH8.0)洗涤。结合的糖肽用10mM α-甲基甘露糖苷的TBS溶液洗涤，收集，用交联葡聚糖G25柱层析脱盐，以除去盐类和半抗原糖。收集用酚-硫酸法检测到的空隙中的糖肽并干燥。它携带着含有末端唾液酸和缺少墨角藻糖残基的典型双触角N-连接的低聚糖，如下所示
用温和酸水解脱除糖肽的唾液酸，所得无唾液酸衍生物用刀豆6-半乳糖苷酶完全消化，得到脱唾液酸、脱半乳糖的纤维蛋白原糖肽，如下所示
无唾液酸、无半乳糖的纤维蛋白原糖肽共价偶联于抗生蛋白链菌素。简言之，糖肽在eppendorf管中干燥，使之在乙酸钠缓冲液(pH6.0)中与40μl 50μmol/ml茚三酮溶液反应。将产物加到Bio Gel PlO柱(1×20ml)上，将活化糖肽与Rheumann′s紫和未反应的茚三酮分离。柱的空隙中冷冻干燥的样品干燥后立即取出，悬浮于20μl 0.17M KH2PO4(pH7.5)。将抗生蛋白链菌素(5mg)溶于25μl 0.17M KH2PO4(pH7.5)和5μl NaCNBH3的KH2PO4溶液(0.082g NaCNBH3/ml 0.17M KH2PO4，pH7.5)，将其加到活化的糖肽中。混合物在室温下保温过夜，抗生蛋白链菌素-糖肽结合物(SGP)在Con A柱上进行亲合层析，在100mM二甲砷酸缓冲液(pH6.5)溶液中冷冻保存。
在酶测定中，反应混合物(35μl)在二甲砷酸缓冲液中含有2μg SGp，50nmol UDP-Gal和1μmol MnCl2，pH6.5。测定中所用酶的单位数为1-10μU。反应混合物在37℃保温最长2小时，通过加入20μl 200mMEDTA(pH8.0)中止反应。保温结束时，将反应混合物冷却至4℃，加入1μg生物素化水母发光蛋白(BAEQ)。将该混合物于冰上冷却30分钟。将样品加到固定化Ricinus Communis凝集素Ⅰ柱上，用乳糖洗脱自柱上收集结合的半乳糖化SGP-BAEQ产物。将结合部分分份(500μl)装入小瓶，通过注入100μl含钙的检测缓冲液(0.1M Tris，0.1M CaCl2，0.004%NaN3，pH7.5)，用Berthold光度计以光子的释放测定产物。
实验表明，所产生的光子总数为酶活性的函数。将光子换算成所产生的生物素化水母发光蛋白缔合产物的毫微微摩尔数。采用已知浓度的光蛋白测定建立的绝对光标准完成这一换算。结果表明，采用这一测定技术，与经典的放射性同位素方法相比，糖基转移酶活性测定的灵敏度至少提高三个数量级，同时不需要昂贵的放射性标记试剂以及没有相关的放射性污染问题。
本说明书中所提到的所有公开出版物和专利文献都列为本文的参考文献，这里一并指出。
虽然本发明通过说明和实例以使人能够理解的方式进行了清楚的描述，但根据本发明的教导，很明显，专业领域内的普通技术人员在不脱离本发明实质和权利要求范围情况下还可对其做出某些变更和改进。
权利要求
1.测定样品中酶活性的方法，其特征在于该方法包括a.在反应介质中合并(1)可能含有所述酶的样品和(2)能与所述酶反应提供标记产物的酶的标记底物；b.使反应在所述反应介质中在所述酶和所述底物间进行，在所述酶的存在下生成所述产物；c.在使所述反应发生前或发生后，使所述反应介质与一种能与所述产物或所述底物，但不是两者，特异结合的受体合并，形成复合物；d.测定在所述复合物中或反应介质中未配合的标记物的存在或量，其中所述标记物含有生物发光蛋白。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述受体附着在固体物表面，所述受体和所述可检测标记产物或底物形成固相复合物。
3.权利要求2的方法，其特征在于所述标记底物存在于液相反应介质中，在测定前将所述固相复合物与所述液相反应介质分离。
4.权利要求1的方法，其特征在于所述受体是其结合所述产物的亲合力至少是其结合所述底物的105倍的单克隆抗体。
5.测定样品中酶的活性水平的方法，其中将可能含有酶的样品在反应介质中与能与所述酶反应形成产物的底物合并，通过产物的形成量或底物的反应量测定酶活性，其特征在于对该方法的改进包括使所述产物或所述产物与对该产物或底物有特异结合亲合力的受体结合，形成可与未复合的底物和产物区分的复合物，以使产物与未反应的底物分开，和用所述产物或所述底物的生物发光蛋白标记物检测所述复合物中或所述反应介质中未复合的产物或底物。
6.权利要求5的方法，其特征在于所述生物发光蛋白是光蛋白。
7.权利要求6的方法，其特征在于所述光蛋白是水母发光蛋白。
8.权利要求5的方法，其特征在于所述复合物含有产物和受体，基本不含所述底物。
9.权利要求8的方法，其特征在于所述的底物用含有生物素-抗生物素蛋白或生物素-抗生蛋白链菌素复合物的连接基连接在所述标记物上。
10.权利要求9的方法，其特征在于所述受体是外源凝集素。
11.权利要求10的方法，其特征在于所述产物和所述底物是生物素标记的碳水化合物，所述生物发光蛋白标记物在将所述生物素结合到含有所述生物发光蛋白和抗生物素蛋白的反应之后与所述产物或底物连接。
全文摘要
测定样品中酶活性的方法，包括在反应介质中将可能含有酶的样品和能与酶反应形成产物的标记底物合并；使酶与底物间发生反应，在酶的存在下形成产物；在使反应发生前或发生后，将能与标记产物或标记底物，但不是两者，特异结合的受体并入反应介质，形成复合物；和测定复合物中或反应介质中未复合的可检测标记物的存在或量，其中可检测标记物是生物发光蛋白。
文档编号G01N33/533GK1046560SQ9010198
公开日1990年10月31日 申请日期1990年4月10日 优先权日1989年4月10日
发明者理查德·D·库明司, 米尔顿·J·考米尔 申请人:佐治亚州大学研究基金会