专利名称：类风湿性关节炎诊断剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含蛋白质A或G和一种带标记的植物血凝素作为主要成分的类风湿性关节炎诊断剂其用于医药领域诊断类风湿性关节炎。
大家知道，称作“类风湿性因子”的自身抗体存在于类风湿性关节炎患者(本说明书中简写为PA患者)血清中并能识别存在于人免疫球蛋白G(本说明书中简写为“IgG”)FC区中的抗原(参考文献1)。近来已对RA患者血清IgG的FC区的碳水化合物链作了详细分析。本发明中的一些发明人以前发现RA患者血清IgG的FC区的碳水化合物链的半乳糖含量比健康人要低许多(参考文献2)。也即是说，业已发现健康人的血清IgG的FC区的碳水化合物链是由各种具有微观不均一性而其中的各部分无个体差异的碳水化合物部分组成的(参考文献3)。另一方面，RA患者血清IgG的FC区的碳水化合物链总的来说具有的半乳糖的含量明显降低了，但是同志愿参加的健康人一样也是由具有微观不均一性的而其各部分又无个体差异的各种碳水化合物链所组成的。具体讲，已发现三种链，其含二个、一个或无半乳糖分子的每一种链以2∶2∶1的比例存在于自愿参加的健康人血清IgG的FC区中，而RA患者血清IgG的含两个半乳糖分子的碳水化合物链的含量明显减少了，且半乳糖缺失的碳水化合物链的总量增加了许多(参考文献2)。这些结果告诉人们RA患者血清IgG的碳水化合物链是由于结构上引起的反常。这样，如果能弄清楚其结构上的反常，此IgG便可作为RA的标志(参考文献4)。
下述的四份参考文献详细披露了上述发现，本发明考虑了这些参考文献1)Kunkel，H.G.和Tan，E.M.(1964)自身抗体和疾病。现代免疫学，第4期351页。
2)Mizuochi，T，Taniguchi，T.，Matsuta，K.，等人(1985)类风湿性关节炎和原发骨关节炎同各种血清IgG糖基化作用类型变化之间的关系，Nature第316期，452-457页。
3)Mizuochi，T.，等人(1982)免疫学杂志，第129期2016-2020页。
4)Mizuochi，T。(1985)对类风湿性因子的反应物类风湿性关节炎患者IgG的糖链中的反常，临床免疫学，第17期，977-984页。
如上所述，大家已知道，如果能够测定血清IgGFc区的碳水化合物中的半乳糖缺失便能对RA进行诊断。然而，迄今为止还没有测定半乳糖缺失的实用的诊断剂。
鉴于上述情况，本发明的发明人认为本发明要予解决的问题在于提供一种测定人血清中存在的IgG碳水化合物链中半乳糖缺失的诊断剂。
为了解决上述问题本发明的发明人已进行了广泛研究并发现在血清中加入蛋白质A或G后再加入一种带标记的植物血凝素，所说目的便能达到。本发明的目的正是基于这一发现而实现的。也就是说，本发明涉及含蛋白质A或G和一种带标记植物血凝素作为主要成分的诊断类风湿性关节炎用诊断剂。即本发明涉及一组试剂(二种物质)，所说试剂为蛋白质A或G和带标记的植物血凝素，此组试剂能用于测定半乳糖缺失。
本发明提供了用上面定义的诊断剂测定半乳糖缺失的方法，此方法包括将蛋白质A或G同血清反应，把所得反应物同标记植物血凝素反应及进行显色这样一些步骤。
下面将对本发明作较详细的介绍。
本说明书中所用的术语“类风湿性关节炎”属于自体免疫疾病，而其在早晨出现的特殊症状是僵硬。
本说明书中所用的术语“蛋白质A”是从金黄色葡萄球菌的细胞膜中分离出来的蛋白质，它是由分子量为42，000的单多肽所构成的并且其内部结构彼此类似的若干部分所组成。
蛋白质A有与IgG的Fc区结合的性质。这样便可以利用这一性质来纯化IgG，事实上这已是一公知的技术。
同蛋白质A一样，蛋白质G是从金黄色葡萄球菌中分离出来的一种蛋白质，它具有与IgG的Fc区结合的性质，利用这一性质来纯化IgG，事实上这也是一公知技术。
其中的术语“植物血凝素”是结合碳水化合物蛋白质的通用术语。虽然植物血凝素最初是从蓖麻种子中得到的，但是在许多动物(包括细菌)中广泛存在着诸种植物血凝素，所以不同来源的各种植物血凝素均可获得。从任何源得到的任何植物血凝素都能与结构上彼此不同形式的各种糖链结合以识别它们。例如，来源不同的许多植物血凝素能识别半乳糖缺失的甘露糖链。因此，要在本发明中使用的植物血凝素不受来源的限制，可以是任何来源的任何一种植物血凝素。而其最优先选用的是伴刀豆球蛋白A和兵豆(LensCulinaris)凝集素。
对作探针检测碳水化合物的植物血凝素的标记可采用惯常的方法来进行，即从用酶标记法，放射性同位素法等方法中选出一种适宜的方法来进行标记，这样本发明不受标记方法的限制。用酶标记时，既可将酶直接与植物血凝素结合也可通过诸如生物素和抗生物素蛋白一类适宜的分子与其结合。
用本发明的诊断剂测定半乳糖缺失时基本按下述步骤进行先将蛋白质A固定在硝化纤维素膜上，然后再加入经缓冲液稀释的血清，再于所得到的膜上加入生物素伴刀豆球蛋白A溶液以检测其碳水化合物部分，再于其上加入抗生物素蛋白过氧化物酶溶液以进行另一反应。洗涤得到的膜后用对此过氧化物显色的底物溶液对其进行处理。虽然用于上述方法的诊断剂包括蛋白质A和生物素伴刀豆球蛋白A(已标记的植物血凝素)作为主要成分，但为方便用户起见，根据本发明的诊断剂在测定操作过程中还可适当地与其他成分混合成为一组诊断剂，这些成分的实际例子有如磷酸盐缓冲液、封阻溶液、硝化纤维素膜、抗生物素蛋白-过氧化物酶、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、底物溶液和反应终止剂溶液。本发明包括如上所述的那样一组的诊断剂。
虽然大家已经知道能用蛋白质A或G纯化IgG，也知道植物血凝素能识别碳水化合物链，但将蛋白质A或G与植物血凝素混合成为诊断剂的组合物是新颖的，正如下面的实验例将要说明的那样，利用这种组合物则实现了对RA方便而准确地进行诊断的目的，尽管截至目前为止。这一直认为是难于作到的。
图1把RA患者的血清IgG用伴刀豆球蛋白A染色后所得到的信号强度同自愿参加的健康人的强度进行了比较。信号的强度是用飞点扫描器CS9000进行测定的。
图2把RA患者的血清IgG用血凝素LCA染色后产生的信号强度因健康人的强度进行了比较，其信号强度是用飞点扫描器CS9000进行测定的。
图3示出了每种疾病的患者的血清中缺失半乳糖的IgG的量，水平轴上数据是用多井眼微平板进行显色后在405毫微米及490毫微米波长下测定的。每种疾病的病名载于实施例2中。表1列出了根据如图3所示的结果的阳性百分率。
制备和使用例1.将市售蛋白质A(如Sigma或Pharmacia产品)或蛋白质G(如Sigma或Pharmacia)与带标记的植物血凝素(如过氧化物酶或生物素标记的)(市售品，如6或SeikagakuKogyo的产品)混合便可得到本发明所述的诊断剂。
2.把上述各成分再与一种固定(结合)蛋白质A的固体成分(如硝化纤维素膜或聚苯乙烯微平板)、封闭缓冲液(如磷酸盐或含BSA(牛血清白蛋白)或明胶的三羟甲基氨基甲烷缓冲液)、一种标记酶(如链球菌抗生物素蛋白-过氧化物酶)和一种酶的底物(如4-氯萘酚)即可得到根据本发明的诊断剂。
3.将固定于一固体成分表面上的蛋白质A或G与人血浆或血清反应以特异性地选择IgG。用带标记的植物血凝素(如过氧化物酶植物血凝素)对存在于所说IgG中的碳水化合物结构进行标记后再利用此植物血凝素特异的识别所说碳水化合物链结构的活性来检测此IgG碳水化合物链中结构的反常。此检测是根据诸如显色信号的强度来测定与IgG链结合的此植物血凝素的量来进行的。具体讲，因为通过对RA患者血清IgG碳水化合物链的结构分析揭示了此碳水化合物链的半乳糖含量明显降低了，所以这就筛选出了与这种缺半乳糖的IgG具有反应性的植物血凝素。从而发现识别甘露糖的植物血凝素如ConA(伴刀豆球蛋白A)或兵豆(Lensculinaris)凝集素(LCA)一类植物血凝素对于缺半乳糖的IgG具有很强的反应性。所以用这些植物血凝素来检查RA患者的血清IgG。
实施例1〔样品〕下述实验中用的血清取自于RA患者及健康的自愿参加者。
〔方法〕把蛋白质A(250μg/ml)溶解在磷酸盐缓冲溶液(50mM磷酸盐、0.15MNaCl.PH7.4)中，将10μl此溶液滴于硝化纤维素膜(划园点)上，再把此膜预以干燥并用封闭缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷-Hcl，0.15MNaCl，0.05%NP-40，2.5%明胶(W/V)，pH＝7.4)封闭。
把所得到的此膜(俘获IgG的膜，下面简称为“IGGTM”)用于分析RA患者或健康的自愿参加者血清IgG的糖链。用封闭缓冲溶液稀释RA患者或健康自愿参加者的血清，再将其加到IGGTM上以使此IgG与所说的膜结合(室温下，60分钟)。反应后，对IGGTM进行温和轻洗，再对其洗涤5分钟。然后此IGGTM上加入500μg/ml生物素-ConA(20μg/ml)以进行反应(室温下，60分钟)。反应后，温和轻洗IGGTM，再对其洗涤2次，每次5分钟。尔后再于所得的IGGTM上加入500μl连球菌抗生物素蛋白-过氧化物酶以进行另一反应。反应后，温和轻洗所得的IGGTM，再洗涤2次，每次5分钟。洗涤后，用TBS(20mM三羟甲基氨基甲烷-Hcl，0.5MNaCl，pH＝7.4)温和轻洗。于此IGGTM上加入500μg/ml过氧化物酶底物溶液以引发显色(5-10分钟)，显色完全后，用蒸馏水对所得的IGGTM进行充分洗涤，干燥后用双波长飞点扫描器CS9000(Shimadzu制，λ＝540毫微米)测定此IGGTM显色信号的强度。
结果1.检查RA患者组(4个人)和自愿参加的健康组(4人)每一个人血清IgG与ConA的反应性。健康组的平均计数为7603.85，而RA患者组的平均计数为43906.22。这表明RA患者组比健康组的计数高(图1)。
2.检查RA患者(一组10人)和健康人(一组4人)血清IgG与LCA的反应性。健康组的平均计数为0，而RA患者组为24501.8。这表明RA患者组的平均计数高于健康组(图2)。
实施例2〔样品〕下述实验使用如下所述的疫病患者及健康的自愿参加者的血清(样品)类风湿性关节炎(RA)20早期类风湿性关节炎(E-RA)27血清阴性类风湿性关节炎(S-N-RA)
(RA实验-，玫瑰红，8或更小)13骨关节炎(OA)18早期骨关节炎(E-OA)20系统红斑狼疮(SLE)12健康的自愿参加者87〔方法〕于微平板的每一井眼中放入100μl蛋白质A(2.5μg/ml)并盖上。用100μl封闭缓冲液(1%BSA(牛血清白蛋白)、50mM磷酸盐缓冲液、0.15MNaCl，pH＝7.4)封闭，于每一井眼中加入100μl明胶缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷-HCl、0.15MNaCl、0.05%NP-40、2.5%(W/V)明胶、pH＝7.4)后再于其中加入1μl样品。然后再于每一井眼中加入100μl所说明胶缓冲液。于25℃下，把全部井眼孵育60分钟。反应后，用缓冲溶液(50ml三羟甲基氨基甲烷-Hcl、0.15MNaCl0.05%NP-40。pH＝7.4)洗涤每一井眼。然后再于其中加入100μl生物素-ConA溶液(0.0625μg/ml)，在25℃下进行反应60分钟。
用所说洗涤缓冲液洗涤此反应产物。然后再加入100μl链球菌抗生物素蛋白一过氧化物酶溶液。于25℃下反应60分钟。反应产物经所说洗涤缓冲液洗涤后加入100μl底物溶液(3%H2O2，10μl+ABTS6mg/4ml，柠檬酸缓冲液，pH4.2)以在37℃下反应60分钟。
于每一井眼中加入100μl叠氮化钠溶液以终止反应，用双波长分光光度计测定所得的样品，在波长为405毫微米和490毫微米处的吸收值。
结果图3表示(1)规定吸光度为0.14的值为截止值;当测定的样品的吸光度大于此截止值时，所识别的类风湿性关节炎为RA，每种疾病的阳性百分率列于表1中。
(2)对于除RA之外的那些疾病如SLE、OA和LD来说，识别的高的阳性百分率是根据文献(TatsuABE，GeneralClinic(SogoRinsho)34，1915(1985))中介绍的贯常RA实验(如血凝反应法和胶乳凝固作用法)进行的。对于这些疾病来说，采用本发明测定方法所得到的阳性百分率是很低的，但本发明的方法对于RA疾病却有极高的选择性。
表1疾病CUP(A405/490)百分率(%)RA0.155±0.04875(15/20)E-RA0.158±0.04853.8(14/27)S-N-RA0.092±0.0277.7(1/13)OA0.086±0.0355.6(1/18)E-OA0.057±0.0180(0/20)SLE0.09±0.0320(0/12)LIVERD.0.087±0.04617.2(5/29)对照组0.081±0.034.6(4/87)
权利要求
1.一种包含蛋白质A或G和一带标记的植物血凝素作为主要成分的类风湿性关节炎诊断剂。
2.一种根据权利要求1的类风湿性关节炎诊断剂，其中所说标记血凝素是识别半乳糖缺失糖链的血凝素。
3.一种根据权利要求2的类风湿性关节炎诊断剂，其中所说的识别半乳糖缺失糖链的标记血凝素是伴刀豆球蛋白A。
4.一种根据权利要求2的类风湿性关节炎诊断剂，其中所说的识别半乳糖缺失糖链的标记血凝素是兵豆(Lens Culinaris)凝集素。
5.一种利用权利要求1定义的诊断剂测定半乳糖缺失的方法，所说方法包括下述步骤蛋白质A或蛋白质G与血清反应;所得的反应产物与一种标记植物血凝素反应;使之显色。
全文摘要
一种利用权利要求1定义的诊断剂测定半乳糖缺失的方法来诊断类风湿性关节炎，所说方法包括下述步骤将蛋白质A或G与血清反应；所得产物与一种标记植物血凝素反应；使之显色。
文档编号G01N33/53GK1047392SQ9010372
公开日1990年11月28日 申请日期1990年5月19日 优先权日1989年5月19日
发明者山田雄二, 楢木彻, 小出醇, 水落次男 申请人:卫材株式会社