专利名称：一种新的肿瘤标志物以及用该标志物检测肿瘤的方法
技术领域：
本发明涉及一种用高效液相色谱测定尿中假尿嘧啶核苷(简称假尿苷)的方法，并用该方法建立肺癌和鼻咽癌的标志物及其检测方法。
人尿中的修饰核苷是由tRNA降解产生的。人体癌变组织中，由于肿瘤的快速增长，消耗的蛋白质急聚增加，运载蛋白质的tRNA也迅速增长。但tRNA的生长是有寿命的，当它衰亡时，各种核酸成份就代谢出来。其中腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶等主要组份的代谢产物不是被重新利用，就是以尿酸形式排出体外，而修饰核苷因不易被酶识别，最终以核苷形式从体液中排出，假尿苷是修饰核苷之一，在所有修饰核苷中，它在体液中的含量是最高的;又因尿中的假尿苷的含量比血清中高十倍以上，故测定尿中的假尿苷作肿瘤标志物，对癌症的早期诊断及监测肿瘤的放疗和化疗的临床效果有十分重要的意义。近几年来，用HPLC测定人尿中假尿苷已有报导，比如Gerald·A等人报道了先用硼酸亲和凝胶将尿中修饰核苷分离出来，然后再用HPLC测定假尿苷(Journal of Chromatography 1986，374149-154)。此法分两步完成，操作麻烦、费时。
本发明的目的是提供简便可靠的方法测定尿中假尿苷(用ψ表示)含量，分别用假尿苷和假尿苷/肌酐(用ψ/C表示)，作为鼻咽癌和肺癌的标志物，以及用该标志物检测鼻咽癌和肺癌的方法。
本发明是用高效液相色谱鉴定和定量测定尿中假尿苷，再通过分光光度法同时测出肌酐，采用标准物质加入法鉴定尿中假尿苷的特征峰，标准曲线法测定尿中假尿苷含量。分别用正常人的ψ和ψ/C值作为鼻咽癌和肺癌的参照控制标准，然后对待测尿样(凝为鼻咽癌和肺癌的病人)进行同样程序分析，根据ψ和ψ/C值就可得到诊断结果。
下面结合附图和实施例对本发明的内容作详细说明
图1为尿中假尿苷定性鉴定色谱图。
图2为假尿苷含量与峰面积关系的标准曲线图。
图3为正常人、肺癌和鼻咽癌患者尿中的ψ分布图。
图4为正常人、肺癌和鼻咽癌患者尿中的ψ/C分布图。
图5为13例疑为肺癌的病人中的ψ/C检测分布图和为检测肺癌病人放疗和化疗效果图。
本发明所选用的HPLC系统由Tracor950 A型泵、Tracor970 A型UV监测器和056型记录仪组成;柱子为4×250mm，填料为YWG-C18.10μM(天津试剂二厂)，800型离心机，721型分光光度计。
测定方法是首先收集尿样，低于-20℃下冷冻20小时以上，待测时解冻，在大于1700g下离心5-10分钟，立即分离上清液作高效液相色谱。
色谱条件0.02mol/L KH2PO4(PH3.45);流速0.95ml/min;温度室温;检测波长254nm;进样10-20μl。肌酐分析利用苦味酸分光光度法。
假尿苷特征峰的鉴定采用标准物质加入法确定。在确定的色谱条件下，测假尿苷标准色谱图(图1a)。然后在相同条件下分析尿样(图1b)，根据标准假尿苷的标准保留时间tR(6.1±0.1分钟)，初步确定尿中假尿苷的特征峰，接着在该样品中加入标准假尿苷再作色谱，发现初步确定的色谱峰增高，面积增大而并未发生分裂(图1c)，因此可确定该峰正是假尿核苷的特征峰。
定量分析采用标准曲线法。配制浓度分别为50nmOl/ml、100nml/ml、150nmOl/ml、250nmOl/ml、350nmOl/ml、450nmOl/ml的标准假尿苷溶液，在上面确定的色谱条件下分别测定他们的HPLC及其峰面积，根据假尿苷含量与对应的峰面积的比例关系绘制ψ含量～A面积的标准曲线(图2)，待测样品的含量就可经标准曲线计算出来。
图1为标准假尿苷，尿样和标准假尿苷加尿样的HPLC对照图。图中“＊”表示假尿苷特征峰，图1a为标准假尿苷的峰，图1b为尿样的色谱峰，图1c为标准假尿苷加尿样色谱峰。
图2为假尿苷含量与峰面积的线性关系标准曲线，图中横座标为假尿苷含量(单位nmOl)，纵座标为峰面积，标准曲线的线性回归方程为A＝74.135ψ+0.665，r＝0.9997，A表示峰面积，ψ表示假尿苷含量，r表示线性相关系数。
实施例一用假尿苷作鼻咽癌的标志物。
随机收取20～53岁健康人员尿样12例。从医院收集肺癌和鼻咽癌患者尿样分别为14和13例。用HPLC系统测得这些尿中的ψ值，经统计学的t检验处理结果表明t鼻咽癌/正常＝3.91＞t(25)0.001＝3.74P＜0.001t肺癌/正常＝1.39＜t(26)0.1＝1.71P＞0.1正常人与鼻咽癌患者尿中的ψ值有非常显著性差异，阳性检出率为92.3%。从统计学角度讲，ψ的差异对鼻咽癌的诊断具有非常显著的意义。
图3为正常人，鼻咽癌和肺癌患者尿中ψ的分布图，纵座标为ψnmOl/ml，横座标的a为正常人，b为鼻咽癌，c为肺癌。
实施例二通过ψ/C诊断肺癌根据对上述12个正常人，14例肺癌和13例鼻咽癌患者所测的数据，计算每个样品的假尿苷/肌酐(ψnmOl/CμmOl/ml)的数据绘于图4中。并对所测数据作统计学分析，t检验结果t肺癌/正常＝3.28＞t(26)0.01＝2.78P＜0.01t鼻咽癌/正常＝1.54＜t(25)0.1＝1.71P＞0.1正常人与肺癌病人尿中ψ/C的比值有非常显著性差异，阳性检出率为86%。从统计学角度讲，对肺癌的诊断有非常显著的意义。
图4为正常人，肺癌和鼻咽癌患者尿中的ψ/C分布，图中纵座标为ψ/C[(nmOl/ml)/(μmOl/ml)]，横座标的a为正常人，b为肺癌，c为鼻咽癌。
实施例三肺癌早期诊断用本方法对12例怀疑为肺癌的病人作假尿苷/肌酐(ψ/C)分析，结果分析如图5(a)所示。对该12例病人于两个月后经切片活检后得出肯定结论。图中“△”为活检证实为肺癌者，用本方法查出了三例中的两例，漏判一例，误判一例，其余10例结论相符，准确率为86%，而误判和漏判的这两例也可通过影响肌肝分析的相关病得到解释。也就是说，如作临床综合分析，准确率还会显著提高。
实施例四监测肺癌病人放疗和化疗效果用本方法测定已经有效放射性治疗和化学药物治疗的肺癌病人7例(图5b)，其中6例显著降低，达到正常水平，准确率为86%以上，只有一例略高于正常平均值，但落在正常值的统计范围内。
图5为用于早期诊断和放疗化疗结果检验研究的分布图，图中横座标为早期诊断效果和放疗化疗效果检验结果，纵座标为ψ/C值，1为正常值控制线，2、3为正常值控制范围。
使用本发明有以下特点1.测定方法简便可靠，病人无任何痛苦，愿意合作，方法灵敏度高，实际操作一个样品只需2小时就可得到准确结果。
2.用ψ和ψ/C分别作鼻咽癌和肺癌的标志物，阳性检出率高于现有临床的各种肿瘤标志物，因此准确度高，见下表(该表摘自米岛学·他，肿瘤标志物，国外医学肿瘤学分册，1989，2108)
3.根据尿中假尿苷含量增高的基本原理，假尿者也可推广应用于其它肿瘤的标志物。
权利要求
1.一种新的肿瘤标志物，其特征在于采用高效液相色谱鉴定和定量测定人尿中假尿嘧碇核苷(简称假尿苷)，再用分光光度法同时测出肌酐，分别以假尿苷和假尿苷/肌酐作为鼻咽癌和肺癌的标志物。
2.根据权利要求1所说的标志物，其特征在于用同样的色谱条件分别测定正常人和已确诊为鼻咽癌病人的尿中假尿苷含量，对测定结果作统计分析证明，假尿苷可作为鼻咽癌的肿瘤标志物。
3.根据权利要求1所说的标志物，其特征在于用同样的色谱条件分别测定正常人和肺癌患者尿中的假尿苷含量，以及用苦味酸分光光度法测定尿中肌酐，测定结果用假尿苷/肌酐表示，进行统计分析证明假尿苷/肌酐可作为肺癌的标志物。
4.一种新的肿瘤检测方法，其特征在于采用人尿中的假尿苷和假尿苷/肌酐分别作为鼻咽癌和肺癌的标志物，在通过条件选择确定的色谱条件下，鉴定尿中的假尿苷特征峰和测定其峰面积，测试标准假尿苷对峰面积的线性标准曲线，得出线性回归方程A＝74.135ψ+0.665，r＝0.9997，然后对待测尿样进行同样程序的分析，将峰面积带入线性回归方程即得出待测尿样的假尿苷含量，再用分光光度测出肌酐后，计算假尿苷/肌酐。
5.根据权利要求4所说的方法，其特征在于所测定的尿样，包括正常人和鼻咽癌、肺癌患者的尿样，首先分别收集鲜尿，在低于-20℃冷冻20小时以上，待测时解冻，于＞1700g离心5-10分钟，立即分离上清液作高效液相色谱。
6.根据权利要求4或5所说的方法，其特征在于液相色谱条件为0.02mol/lKH2PO4(PH3.45)、流速0.95ml/min，温度为室温，检测波长254nm，进样10-20μl，肌酐分析采用苦味酸分光光度法。
7.根据权利要求4所说的方法，其特征在于线性回归方程中A表示峰面积，ψ表示假尿苷含量，r表示线性相关系数。
全文摘要
用高效液相色谱(简写HPLC)直接测定人尿中假尿嘧啶核苷(简称假尿苷)，再通过分光光度法同时测出肌酐，分别用假尿苷和假尿苷(nmol/ml)/肌酐(μmol/ml)作为鼻咽癌和肺癌的标志物。同时，将该标志物分别用于鼻咽癌和肺癌的早期诊断、监测其放疗和化疗临床效果。本法简便可靠，阳性检出率高，测定一个样品的实际操作只需2小时。
文档编号G01N33/574GK1051980SQ90106198
公开日1991年6月5日 申请日期1990年12月18日 优先权日1990年12月18日
发明者王科太, 弋昌厚 申请人:四川大学