专利名称：径向色谱柱用弱阳离子型介质的合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高分子有机聚合物的合成方法，具体地说是提供一种用作径向色谱柱填料的以短纤维与甲基丙烯酸和甲基丙烯酸环氧丙酯进行共聚接枝，直接合成制得CM型弱阳离子交换介质的方法。
随着生物工程的日益发展，特别是对生物大分子的分离与纯化传统的色谱技术已远不能适应当今发展的需要，在80年代中期推出了径向色谱柱的新技术。它克服了传统色谱技术在大规模处理时不便放大、色谱填料易造成生物样品失活等缺点，采用了全新的概念-径向流动技术，它是膜分离技术与色谱分离原理的结合，可以在较小床层高度时获得较大处理容量，而且还可以达到较大流速，其最大优点还在当保持柱径不变，而只增加柱长时，可按比例增加样品处理量，即线性放大。因此径向色谱新技术是一种较理想的生物工程大规模初级分离纯化的工具。在径向色谱技术中除了在结构上作了某些革命性的改进以外，所用的填料介质也必须作相应的改进和发展，特别是适用于生物大分子分离纯化的色谱填料。其中一种分离蛋白质以及其它不稳定的生物活性物质的色谱介质是纤维素离子交换介质。纤维素的非特异性吸附较小，有合适的孔径结构，它通过酯化、醚化、氧化等方法，把交换基团引入纤维素骨架上而制备成纤维素离子交换介质。但这几种方法只能在不破坏纤维素结构的情况下得到很有限的交换容量，使得相应柱子的柱容量很小，给这类介质在径向色谱柱中应用带来困难。此外，又发展一种新的离子交换交联多糖凝胶作介质。它是一种葡聚糖改性物，交换基团通过醚链引入到葡聚糖链中的葡萄糖单元上。它表现为非常低的非特异性吸附，被认为是理想的生化分离介质。然而凝胶的孔径与它的溶涨性质有关，低交联高溶涨介质可以获得较高的交换容量但强度非常小，只能经受很小压力;高交联低溶涨的介质能获得强度提高，但容量和孔径会很快降低，所以不可能获得一种具有适当强度同时又有较高交换容量的多糖凝胶。将上述两种组份融合起来，其中一种是稳定结构的半钢性组分，另一种是带有离子交换基团的软聚合物组分，经合成可产生一代新的离子交换介质-混合型凝胶。例如美国专利USP 4，663，163号采用含离子交换基团(DEAE，QAE、SP等)的甲基丙烯酸衍生物与甲基丙烯酸环氧丙酯进行共聚，随后再与纤维素交联合成混合型凝胶离子交换介质。但是含离子交换基团的甲基丙烯酸衍生物合成困难，介格较贵，因此限制了该方法的应用。此外，含CM(羧甲基)离子交换基团的弱阳离子型离子交换介质还未看见到报导。
本发明的目的是提供一种合成适于生物大分子的分离纯化处理采用的径向色谱柱填料CM型离子交换介质的方法，该合成方法利用的原料易得，反应条件易控制，同时交换容量大。
本发明的CM型离子交换介质的合成方法是利用上述混合型凝胶的合成原理，并同时考虑到合成介质的后期成膜工艺，以纤维素(短纤维)作为刚性组分，以甲基丙烯酸和甲基丙烯酸环氧丙酯共聚作为聚合物组分合成离子交换介质。具体的合成方法按下步骤(1)以甲基丙烯酸和甲基丙烯酸环氧丙酯进行共聚反应合成聚合物;
(2)纤维素与聚合物进行接枝反应直接制得CM型离子交换介质，其化学反应如下
上述反应1、2中，反应溶液控制在PH为4～7范围内，其PH值以稀盐酸进行调解，反应温度控制在50～80℃下，反应只少进行0.5小时，为使反应物充分的进行共聚和接枝反应提高接枝率，反应时间控制在0.5～4小时为宜。纤维素的用量应当过量，反应物按(重量)纤维素∶甲基丙烯酸∶甲基丙烯酸环氧丙酯＝40～10∶10～5∶1同时为加快共聚反应速度，反应1进行可加入引发剂，如采用偶氮二异丁腈或过硫酸铵与硫代硫酸钠，引发剂的加入重量为反应物的1～5%。下面通过实例对本发明的合成反应给予进一步地详细说明。
实例1 CM型弱阳离子交换介质的制备于装有搅拌器，温度计及冷凝器的250ml三口烧瓶中，加水约100ml，升温到70℃，加入约2克短棉纤维，充分搅拌均匀，随后加入甲基丙烯酸与甲基丙烯酸环氧丙酯的混合物10ml，其混合比例为6∶1，搅拌5分钟后，再加入含过硫酸铵和硫代硫酸钠各0.5克的混合液10ml，保温70℃反应在3小时。反应后用大量水冲洗，再用丙酮或乙醇洗去纤维素表面残余物，于真空烘箱烘干制得介质。该介质纤维素的接枝率＞40%，按常规方法测试其离子交换当量＞2.5mmol/g。
实例2，填充CM型离子交换介质径向色谱柱应用利用实例1所合成的CM型离子交换介质填充成径向色谱柱用于人血浆分离纯化实验。将径向色谱柱用10mMPH6.3PBs溶液充分平衡后上10倍稀释人血浆2000ml(即200ml原浆)，用平衡缓冲液充分洗涤后，用盐梯度洗脱，蛋白总回收率在90%以上。
实例3，填充CM型离子交换介质径向色谱柱应用2利用实例2的径向色谱柱用于登革病毒单克隆抗体与乙型肝炎单克隆抗体的分离纯化。将径向色谱柱用0.2M醋酸缓冲液PH5.5充分平衡，1升培养物上清上样，洗去未吸附蛋白，然后用2.2MTrls-HClPH8.0缓冲液洗脱，可得50%纯度单抗。径ELIS检测，未吸附物中无单抗，单抗全部在PH8.0洗脱峰中，再径硫酸沉淀纯度可达90以上，4℃保存数月，活性稳定。
由上述实例，本发明合成方法可以方便地制备径向色谱柱用弱阳离子(CM)型离子交换介质。其合成反应条件简单，易于控制，且交换容量大。使用这种介质填充制备的径向色谱柱适用于对生物大分子进行分离和初步纯化，样品处理量大、速度快、操作简便，样品活性保持较高，所以特别适用于体积大，含量低的生物工程大规模发酵后的产品的分离纯化。
权利要求
1.一种径向色谱柱用弱阳离子CM型离子交换介质的合成方法，其特征在于是采用以甲基丙烯酸与甲基丙烯酸环氧丙酯进行共聚反应得到聚合物再与纤维素进行接枝反应的过程；共聚接枝反应在50～80℃，PH值4～7范围内进行。
2.按照权利要求1所述的合成方法，其特征在于自聚反应中可加入引发剂，如偶氮二异丁腈或过硫酸铵与硫代硫酸钠，引发剂加入量为反应物重的1～5%。
全文摘要
一种径向色谱柱用弱阳离子CM型离子交换介质的合成方法，是采用以甲基丙烯酸与甲基丙烯酸环氧丙酯进行共聚，再与纤维素进行接枝反应过程。该合成反应条件简单、易于控制，且交换容量大。使用这种介质填充制备的径向色谱柱适用于对生物大分子进行分离和初步纯化，样品处理量大、速度快、操作简便、样品活性保持较高，所以特别适用于体积大、含量低的生物工程大规模发酵的产品的分离纯化。
文档编号G01N30/38GK1072421SQ91106299
公开日1993年5月26日 申请日期1991年11月20日 优先权日1991年11月20日
发明者张青, 李彤, 张玉奎, 孙爱民, 吴丽华 申请人:中国科学院大连化学物理研究所